Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Agradecemos a Sorokin de Lydia, que compartió con nosotros su original en situ zymography de protocolo10 .

Todos los estudios se llevaron a cabo bajo las directrices de acuerdo con la legislación Suiza relativa a la protección de los animales y fueron aprobados por la Oficina veterinaria del cantón de Berna, Suiza (número de autorización: BE 31/17 y ser 77/18).
1. vivienda de ratones C57BL/6 en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF)
<ol><li>Ciclo de ratones en jaulas individuales ventilados con una 12/12 h luz / oscuridad de la casa. Proporcionar alimento y agua ad libidum. ...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Aquí, presentamos un protocolo para inducir y controlar EAE en ratones C57BL/6 femeninos. Preferentemente se eligen las hembras, y hay una incidencia de las mujeres: los hombres de 3:1 en MS. Para evaluar la severidad de la EAE, hicimos uso de una hoja de puntuación de 3 puntos. Severidad de la EAE se anotó generalmente con respecto a la gravedad de los trastornos motores. Ratones con avanzadas fases de la EAE, es decir, exhibiendo una puntuación por encima de 2 debería ser sacrificado para evitar sufrimiento innece...

Sistema nervioso central (SNC) coordina todos los cuerpo y las funciones mentales en los vertebrados, y homeostasis del CNS es esencial para una adecuada comunicación de las neuronas. Homeostasis de la CNS está garantizada por la unidad neurovascular (NVU), que protege el SNC desde el ambiente cambiante de la corriente sanguínea. El NVU se compone de células endoteliales microvasculares de la CNS, bioquímicamente único y establecen la barrera blood - brain (BBB) en continua interferencia con pericitos, astrocitos, neuronas y componentes de la matriz extracelular (ECM), establecimiento de dos las distintas membranas del sótano1. La membrana basal endotelial que ensheathes el aspecto abluminal de las células endoteliales de BBB alberga un alto número del pericitos y se compone de laminina α4 y α5 del laminin, además de otras proteínas de ECM2. En contraste, la membrana basal parenquimal consta de laminina α1 y α2 de laminina y es abrazada por fin pies astrocíticos. La membrana basal parenquimal junto con los astrositos final-pies compone el INCURVATA4 de glia que segrega la red neuronal del CNS de la llena de líquido cerebroespinal perivascular o espacios subaracoideos3. Debido a la arquitectura única del NVU, células inmunitarias trata hacia el SNC es distinto que en los tejidos periféricos ya que requiere un proceso de dos pasos con las células inmunes, primero incumplimiento BBB endotelial y posteriormente la glia INCURVATA4 a fin de alcanzar el parénquima de la CNS.
Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad común de la capensis del CNS, en la que un gran número de células inmunes circulantes entre el SNC y causar neuroinflamación, desmielinización y pérdida focal de BBB integridad4. Pérdida de la integridad BBB es un sello temprano de MS, como se indica por la presencia de contraste de gadolinio mejora las lesiones en el SNC como visualizado por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)5. Extravasación del leucocito en el SNC se produce a nivel de vénulas postcapilares; sin embargo, los mecanismos precisos involucrados en la diapedesis celular inmune a través de la membrana del sótano BBB y posteriormente la barrera glial quedan por explorarse. Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como un modelo animal para MS y ha contribuido significativamente a nuestro conocimiento actual sobre la patogenia de la EM. Por ejemplo, utilizando el modelo EAE se ha descubierto que la extravasación del leucocito ocurre en un proceso de varios pasos, incluyendo una captura inicial y balanceo paso mediado por selectinas y moléculas de mucina-como como ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido por detención firme dependiente de integrinas y arrastre de células T en las células endoteliales de BBB a lados permisivas por diapedesis6.
Una vez que las células T han cruzado el BBB endotelial y la membrana basal endotelial, que necesitan encontrar su antígeno cognado en macrófagos o células dendríticas localizadas estratégicamente en los espacios de leptomeningeal o perivascular. Esta interacción induce producción focal de mediadores pro-inflamatorios disparo los mecanismos posteriores necesarios para la invasión del tejido del CNS de células inmunes por la glia INCURVATA47,8,9. Focal activación de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9 altera la activación de chemokine e induce la degradación de receptores de matriz extracelular en astrositos final-pies, que es un prerrequisito para inmune migración de la célula a través de la INCURVATA4 de glia en la Parénquima de CNS e inducir la aparición de síntomas clínicos de EAE10,11.
Combina la detección de CNS infiltración celular inmune con BBB actividad salida y gelatinasa en las secciones de tejido de CNS ofrece información valiosa sobre la integridad funcional de la barrera endotelial y glial en el contexto de la neuroinflamación. Por ejemplo, hemos investigado recientemente la pérdida constitutiva de la molécula de adherencia junctional de molécula endotelial ensambladura apretada (JAM)-B en el tráfico de células inmunes en el SNC en el contexto de la EAE. No comparado con saludables ratones C57BL/6 de tipo salvaje, sanas hermanos de camada de mermelada-B-deficiente mostraron ningún deterioro de la integridad BBB como se muestra en la evaluación de la permeabilidad in vivo utilizando marcadores endógenos como exógenos12. En el marco de la EAE, ratones C57BL/6 B-mermelada-deficiente mostraron síntomas de la enfermedad mejoró, que se asoció con captura de células inflamatorias en los espacios de leptomeningeal y perivascular12. Para examinar este fenómeno aplicamos zymography en situ , que permita la identificación de la actividad gelatinasa para probar si la falta de actividad gelatinasa en ratones deficientes en B-atasco puede ser responsable por el reducido número de células inmunes capaces de romper la glia INCURVATA412.
Dada la disponibilidad de diferentes genéticamente ratón modelos carece de, por ejemplo, diferentes moléculas de ensambladura apretada BBB que pueden provocar cambios en la función BBB, metodologías para investigar la integridad BBB son importantes. Además, fármacos recientemente desarrollados podrían impactar sobre las barreras NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa con la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG)-péptido aa35-55 en adyuvantes de Freund completo. A continuación explicamos cómo localizar la infiltración de células inmunitarias a través de las barreras endoteliales y gliales del NVU y cómo estudiar la integridad de la barrera endotelial y glial en vivo por la detección in situ de marcadores exógenos y la actividad gelatinasa, respectivamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

La unidad neurovascular (NVU) se compone de células endoteliales microvasculares formando la barrera blood - brain (BBB), una membrana basal endotelial con pericitos encajado, y la glia INCURVATA4 compuesta por la membrana basal parenquimal y astrocíticos alimentación final abarca el aspecto abluminal de microvasos del sistema nervioso central (SNC). Además de mantener el CNS homeostasis el NVU controla tráfico de células inmunes en el SNC. Durante el ataque del SNC bajo número de linfocitos activados puede cruzar la barrera endotelial sin causar disfunción BBB o enfermedad clínica. En contraste, durante la neuroinflamación tales como esclerosis múltiple o su modelo animal encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) un gran número de células inmunes puede cruzar el BBB y posteriormente la glia INCURVATA4 eventualmente alcanzar el parénquima de la CNS hacia la enfermedad clínica. 
Migración de células inmunes en la parenquimia del CNS es así un proceso de dos etapas que implica una migración secuencial a través de la barrera endotelial y glial de NVU empleando distintos mecanismos moleculares. Si después de su paso a través de la barrera endotelial, células T encuentran su antígeno cognado en células presentadoras de antígenos perivasculares su reactivación local iniciará posterior mecanismos que conducen a la activación focal de matrilisina, que permitirá a las células T cruzar la barrera glial y entrar en el parénquima del CNS. Por lo tanto, evalúe la permeabilidad BBB y actividad MMP en correlación espacial con acumulación de células inmunitarias en el SNC durante la EAE permite para especificar la pérdida de la integridad de las barreras endoteliales y gliales del NVU. 
Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa y posteriormente analizar permeabilidad BBB en vivo usando una combinación de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos además, cómo visualizar y localizar la actividad gelatinasa en el cerebro de EAE por zymogaphy in situ junto a los stainings inmunofluorescentes de las membranas del sótano BBB y CD45 + invade las células inmunes.

Evaluación del curso clínico de la EAE en ratones C57BL/6 debe resultar en una curva de la enfermedad como se muestra en la figura 2A y los cambios en el peso corporal de ratón tal como se presenta en la figura 2B. Ratones C57BL/6 inmunizados con MOGaa35-55 generalmente comienzan a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededor de 10-12 días después de la inmunización activa (figura 1A). Por lo general, ratones vacunados mue...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Los métodos presentados aquí nos permiten estudiar los mecanismos moleculares de la migración de células inmunitarias a través de las barreras cerebrales en la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal para la esclerosis múltiple. Al investigar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la actividad de la matriz-metaloproteasa al mismo tiempo en correlación espacial con la infiltración de células inmunitarias en secciones de tejido cerebral, podemos asociar precisamente estos eventos neuroinflamatorios a los signos clínicos de EAE. El manejo profesional de ratones enfermos necesita un entrenamiento en profundidad, así como la puntuación correcta de los signos clínicos de EAE.Por lo tanto, la demostración visual es beneficiosa. Comience este procedimiento con la anestesia de ratones C57-Black/6 que se han alojado en condiciones específicas libres de patógenos como se describe en el protocolo de texto. Fijar el ratón anestesiado en una mano, e inyectar 30 microlitros de péptido MOG y completar la emulsión adyuvante de Freund por vía subcutánea en cada uno de los flancos de las piernas traseras, muy cerca de los ganglios linfáticos inguinales.Ahora, coloque el ratón sobre su vientre e inyecte 20 microlitros de la emulsión MOG-péptido en el tejido graso blando tanto a la izquierda como a la derecha en la raíz de la cola. Además, inyectar una pequeña gota de la emulsión en el cuello del ratón. Inyectar 100 microlitros de solución de toxina de tos ferina intraperitonealmente en el ratón.Sostenga la cabeza del ratón debajo del centro del cuerpo para evitar la inyección en el intestino. Reemplazar la dieta de mantenimiento a la dieta de cría con el fin de proporcionar a los ratones con alimentos de mayor contenido de energía antes y durante la enfermedad clínica esperada. Repita la inyección de toxina toxsis 48 horas después del primer tratamiento.Compruebe el estado de salud de los ratones EAE cada mañana echando un vistazo dentro de las jaulas. Puntua a los ratones EAE cada tarde. Saca todos los ratóns individuales incluidos en el experimento EAE de la jaula y comprueba si la cola tiene tonus.Mueva la cola hacia arriba con un dedo. Un ratón sano mantendrá su cola hacia arriba. Si eae clínica ha comenzado, el tonus de la cola será más bajo, visible por una caída gradual de la cola.Eventualmente, el ratón no será capaz de levantar su cola en absoluto. Coloque cada ratón individual incluido en el experimento EAE en el banco limpio para observar y documentar el comportamiento de caminar. Consulte el texto para conocer los criterios de puntuación para la evaluación de la gravedad de la enfermedad, que es la puntuación EAE.Evalúe y documente el peso de cada ratón incluido en el experimento. Para preparar soluciones de dexran, disolver 10 miligramos de tres-kilodalton Dextran Texas Red en 500 microlitros de 0.9% solución de cloruro de sodio y cinco miligramos de 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 en 250 microlitros de 0.9% solución de cloruro de sodio. Para la solución de trabajo de dextrán, justo antes de la inyección, pipetear 55 microlitros de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solución en stock sobre una pieza de película de sellado.A continuación, agregue 55 microlitros de la solución de stock de tres kilodalton Dextran Texas Red. Mezclar y recoger 100 microlitros en una jeringa fina desechable. A continuación, coloque un ratón anestesiado en la posición lateral sobre la mesa.Inyecte por vía intravenosa 100 microlitros de trazadores fluorescentes en el ratón antes de que el ratón se despierte. Deje que el trazador circule durante 15 minutos antes de realizar la perfusión de ratones como se detalla en el protocolo de texto. Llene un recipiente plano de dewar con hielo seco triturado, y agregue 2-metilbutano hasta que el líquido alcance aproximadamente un centímetro por encima de la bolsa de hielo seco.Cubra con una tapa suelta, como una cubierta de cubo de hielo. Después de cortar la cabeza del ratón perfundido con tijeras afiladas, retire la piel y las orejas usando un conjunto más pequeño de tijeras. Diseccione cuidadosamente la tapa del cráneo cortando desde el foramen magnum hacia el frente a la izquierda y el lado derecho, para permitir el plegarse de la tapa del cráneo sobre el cerebro.Luego, saca cuidadosamente el cerebro intacto de la base del cráneo mientras corta los nervios ópticos usando una espátula plana de metal. Coloque el cerebro sobre papel de aluminio. Corta el cerebro en tres pedazos colocando dos cortes coronales.Las tres piezas representan el cerebro frontal, el cerebro medio y el cerebelo con tallo cerebral. Llene un Cryomold hasta el primer trimestre con una matriz de corte de temperatura óptima. Luego, coloca las rebanadas cerebrales en el Cryomold, con el lado anterior de cada pieza del cerebro mirando hacia abajo.Cubra el tejido completamente con matriz. Coloque el Cryomold con el tejido en una orientación horizontal en el baño de 2-metilbutano. Asegúrese de que el tejido se congela de abajo a arriba en un minuto evitando sumergir todo el bloque de tejido en el baño.Transfiera el tejido congelado a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento. Consulte el protocolo de texto para la preparación de las secciones de tejido congelado. Recuperar secciones de tejido cerebral no fijos de seis micras que se habían preparado a partir de ratones EAE.En una campana de humo, descongele las secciones dentro de la caja de congelación de plástico que contiene gel de sílice en la tapa para evitar la retención de agua en el tejido. Separe dos secciones de tejido en una diapositiva dibujando líneas con una pluma repelente al agua. Soluciones de reacción centrífuga durante cinco minutos a 13, 300 g a temperatura ambiente, y precalentó a 37 grados centígrados utilizando un baño de agua.Luego, rehidrate las secciones del tejido durante cinco minutos a 37 grados Celsius usando un tampón de reacción 1X. Después de cinco minutos, vierta el tampón de reacción 1X. Añadir solución de reacción en las secciones tisulares e incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados.A continuación, lave los portaobjetos cinco veces en agua doble destilada. Ahora, fije las secciones durante cinco minutos con metanol helado a menos 20 grados Celsius antes de lavarlas una vez con PBS a temperatura ambiente. Añadir 1%BSA en PBS a la sección, e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.A continuación, deseche el búfer de la sección volteando la diapositiva sobre un tejido. Añadir cóctel de anticuerpos primarios a la sección, e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las secciones dos veces con PBS, agregue un cóctel de anticuerpos secundarios e incubar durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, lave las secciones dos veces con PBS y monte las diapositivas con la solución de incrustación. Después de dejar que las secciones montadas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, analice las secciones de tejido teñido con un microscopio fluorescente. La gravedad de la enfermedad EAE aumenta hasta el pico de la enfermedad, que puede esperarse entre los días 16 y 20 después de la inducción de EAE.En el pico de EAE clínico, los ratones también mostraron el menor peso corporal, lo que aumenta en correlación con la mejora de EAE en la fase de remisión de la enfermedad. Aquí se muestra una imagen representativa del plexo coroides y el parénquima cerebral adyacente de un ratón C57-Negro/6 que sufre de EAE. El ratón se inyectó por vía intravenosa 15 minutos antes de sacrificarse.Los trazadores se difunden fácilmente a través de los microvajillones fenestrated en el estoma del plexo coroides, mientras que la barrera hematoencefálica no permite la difusión de trazadores circulantes en el parénquima cerebral, que por lo tanto está desprovisto de cualquier señal fluorescente. Estas imágenes muestran vasos sanguíneos con fugas representativos en el cerebelo de un ratón C57-Black/6 que sufre de EAE. Las puntas de flecha indican que los trazadores se difunden a través de los microjillones cerebrales hacia el parénquima del SNC, lo que sugiere que la función de barrera hematoencefálica está deteriorada en estos vasos.En el parénquima del SNC, la señal fluorescente verde y roja es visible fuera de las paredes de los vasos sanguíneos. La correcta colocación subcutánea de la emulsión MOG-CFA es esencial para montar la respuesta inmunitaria adecuada que conduce a EAE. Debe evitarse la inyección intraperitoneal e intramuscular.Prepare CFA bajo una campana de humo para evitar la inhalación de la Mycobacterium atenuada. Además, evitar la autoinyección con la emulsión MOG-CFA, ya que esto puede causar condyloma o incluso conducir a EAE en individuos que están genéticamente predispuestos. Las células inmunitarias infiltrantes cerebrales se pueden aislar del SNC de ratones que sufren de EAE para cuantificar subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes durante la neuroinflamación por citometría de flujo.La evaluación de la integridad de las barreras cerebrales endoteliales y gliales se puede traducir al análisis de modelos de ratón modificados genéticamente o a modelos de otros trastornos neurológicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Mejora de la inmunogenicidad por Mycobacterium paratuberculosis en la encefalomielitis autoinmune

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Autor destacado: Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental  

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...