Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt Lydia Sorokin, som har delat sin ursprungliga i situ zymography protokoll10 med oss.

Alla studier genomfördes enligt riktlinjer enligt den schweiziska lagstiftningen om skydd av djur och godkändes av veterinärmedicinska byrån av kantonen Bern, Schweiz (tillstånd nummer: BE 31/17 och vara 77/18).
1. bostäder C57BL/6 möss i specifik patogen fri (SPF) villkor
<ol><li>Hus möss i enskilda ventilerade burar med en 12/12 h ljus-mörker cykel. Ge mat och vatten ad libidum. För att övervaka mikrobiologiska kvaliteten på möss, genomgick den experimentella kohorten kvartal...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Här presenterar vi ett protokoll för att inducera och övervaka EAE i kvinnliga C57BL/6 möss. Honor är företrädesvis valt, och det finns en förekomst av kvinnor: män 3:1 i MS. För att bedöma svårighetsgraden av EAE, gjorde vi använder sig av ett 3-punkt scoring blad. EAE svårighetsgrad är generellt gjorde med avseende på svårighetsgraden av motor dysfunktioner. Möss med avancerade stadier av EAE, dvs uppvisar en poäng ovanför 2 bör offras för att undvika onödigt lidande för djuren. Därför är det...

Det centrala nervsystemet (CNS) samordnar alla kropp och mentala funktioner hos ryggradsdjur, och CNS homeostas är avgörande för en korrekt kommunikation av nervceller. CNS homeostas rättsordning neurovaskulära enheten (NVU), som skyddar CNS från den föränderliga miljön i blodet. NVU består av CNS mikrovaskulära endotelceller, som är biokemiskt unika och upprätta den blood - brain barriären (BBB) i kontinuerlig överhörning med pericyter, astrocyter, nervceller och extracellulär matrix (ECM) komponenter, upprätta två distinkta källaren membran1. Endothelial basalmembranet som ensheathes den abluminal aspekten av BBB endotelceller hamnar en kick numrerar av pericyter och består av laminin α4 och laminin α5, förutom andra ECM proteiner2. Däremot parenkymal basalmembranet består av laminin α1 och laminin α2 och är omringad av astrocytic slutet-fötter. Parenkymal basalmembranet tillsammans med astrocyten slutet-fötterna komponerar den glia limitans som segregerar CNS neuronala nätverket från cerebrospinalvätska fylld perivaskulär eller subarachnoid utrymmen3. På grund av den unika arkitekturen av NVU är immunceller som människohandel i CNS skild från att i perifera vävnader eftersom det kräver en tvåstegsprocess med immuncellerna, först bryter mot endothelial BBB och därefter den glia limitans för att når CNS parenkymet.
Multipel skleros (MS) är en vanlig neuroinflammatoriska sjukdom i CNS, där ett stort antal cirkulerande immunceller ange CNS och orsaka neuroinflammation, demyelinisering och fokal förlust av BBB integritet4. Förlust av BBB integritet är en tidig MS, som anges av närvaron av gadolinium kontrast öka lesioner i CNS som visualiserade genom magnetisk resonanstomografi (MRT)5. Leukocyt extravasering till CNS uppstår i nivå med postcapillary venules; de exakta mekanismerna som är involverade i immunceller diapedesis över BBB basalmembranet och därefter gliaceller barriären återstår dock undersökas. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerar som en djurmodell för MS och har väsentligt bidragit till vår nuvarande kunskap om MS patogenes. Exempelvis har med hjälp av EAE modellen man upptäckt att leukocyt extravasering sker i en process, inklusive en första fångsten och rullande steg medieras av selectins och mucin-liknande molekyler som P-selektin glykoprotein ligand (PSGL) -1, följt av integrin-beroende fast gripandet och genomsökning av T-celler på BBB endotelceller till tillåtande sidor för diapedesis6.
När T-celler har passerat endothelial BBB och endotel basalmembranet, behöver de stöta deras cognate antigen på makrofager och dendritiska celler strategiskt lokaliserade i leptomeningeal eller perivaskulär utrymmen. Denna interaktion inducerar fokal produktionen av pro-inflammatoriska mediatorer som utlöser de efterföljande mekanismerna krävs för CNS vävnad invasion av immunceller via glia limitans7,8,9. Focal aktivering av matrix-metalloproteinas (MMP) -2 och MMP-9 förändrar chemokine aktivering och inducerar nedbrytning av extracellulärmatrix receptorer på astrocyten slutet-fötter, som är en förutsättning för immun cell migration över den glia limitans i den CNS parenkymet och att framkalla kliniska symtomen av EAE10,11.
Läckage och gelatinase aktivitet i CNS vävnadssnitt kombinerar detektion av CNS infiltrera immunceller med BBB och ger värdefull information om funktionella integriteten av endothelial och gliaceller barriären i samband med neuroinflammation. Till exempel, vi nyligen undersökt konstituerande förlusten av endothelial åtsittande föreningspunkt molekyl Junktional vidhäftning molekylen (SYLT)-B i immunceller handel till CNS i samband med EAE. Jämfört med friska vildtyp C57BL/6 möss, friska JAM-B-brist littermates visade ingen försämring av BBB integritet som visas av Invivo permeabilitet bedömning använder endogena samt exogena spårämnen12. I samband med EAE, JAM-B-brist C57BL/6 möss visade förbättras sjukdomssymtom, som var associerade med inflammatoriska celler svällning i leptomeningeal och perivaskulär utrymmen12. För att undersöka detta fenomen vi tillämpat i situ zymography, möjliggör identifiering av gelatinase aktivitet för att testa om brist gelatinase aktivitet i SYLT-B-brist möss kan ansvara för det reducera antalet immunceller som kan bryta mot de glia limitans12.
Med tanke på tillgången på modifierade olika genetiskt mus modeller saknar, t.ex. olika BBB åtsittande föreningspunkt molekyler som kan orsaka förändringar i BBB funktion, metoder för att undersöka BBB integritet är viktigt. Nyutvecklade droger kan dessutom påverka NVU hinder. Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering med den myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplett Freunds adjuvans. Sedan förklarar vi hur du lokalisera immunceller infiltration över NVU endothelial och gliaceller barriärer och studera Invivo endothelial och gliaceller barriär integritet genom jordbaserad upptäckt av exogena spårämnen och gelatinase aktivitet, respektive.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

Neurovaskulära enheten (NVU) består av mikrovaskulära endotelceller som bildar den blod - hjärnbarriären (BBB), en endothelial basalmembranet med inbäddade pericyter, och den glia limitans komponerad av parenkymal basalmembranet och astrocytic slutet-feed omfamna den abluminal aspekten av centrala nervsystemet (CNS) microvesselsna. Förutom att bibehålla CNS styr homeostas på NVU immunceller handel till CNS. Under immunosurveillance i CNS kan låga antalet aktiverade lymfocyter korsa endotel barriären utan att orsaka BBB dysfunktion eller klinisk sjukdom. Däremot under neuroinflammation såsom multipel skleros eller dess djurmodell kan experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) ett stort antal immunceller passera BBB och därefter den glia limitans så småningom nå CNS parenkymet leder till klinisk sjukdom. 
Immunceller migration till CNS parenkymet är således en tvåstegsprocess som innebär en sekventiell migrering över endothelial och gliaceller barriären för den NVU sysselsätter olika molekylära mekanismer. Om efter deras passage över endotel barriären, T-celler stöta deras cognate antigen på perivaskulär antigen-presenterande celler deras lokala reaktivering kommer inleda efterföljande mekanismer leder till fokal aktivering av gelatinases, som kommer att aktivera T-cellerna att korsa gliaceller barriären och ange CNS parenkymet. Således tillåter att bedöma både BBB permeabilitet och MMP aktivitet i rumslig korrelation till immunceller ackumulering i CNS under EAE för att ange förlust av integritet av endothelial och gliaceller hindren för NVU. 
Här visar vi hur man framkalla EAE i C57BL/6 möss av aktiv immunisering och därefter analysera BBB permeabilitet i vivo med en kombination av exogena fluorescerande spårämnen. Vi ytterligare Visa hur man visualisera och lokalisera gelatinase aktivitet i EAE hjärnor av jordbaserad zymogaphy kopplat till Immunofluorescerande infärgning av BBB källaren membran och CD45 + invaderande immunceller.

Bedömning av det kliniska förloppet av EAE i C57BL/6 möss bör resultera i en sjukdom kurva som skildras i figur 2A och förändringar i kroppsvikten mus som presenteras i figur 2B. C57BL/6 möss immuniserats med MOGaa35-55 brukar börja utveckla sjukdomssymptom runt dag 10-12 efter aktiv immunisering (figur 1A). Immuniserade möss visar vanligtvis, en övergående minskning av kroppsvikt dagen efter injektion av emulsionen och d...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisera nedsättning av Endothelial och gliaceller hinder av neurovaskulära enheten under Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Här presenterar vi protokoll för att undersöka nedsättning av neurovaskulära enheten under experimental autoimmune encephalomyelitis Invivo. Vi adress specifikt hur man bestämma blod - hjärnbarriären permeabilitet och gelatinase aktivitet deltar i leukocytmigration över den glia limitans.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

De metoder som presenteras här tillåter oss att studera de molekylära mekanismerna för immun cell migration över hjärnbarriärerna i experimentell autoimmun encefalomyelit, ett djur modell för multipel skleros. Genom att undersöka blod - hjärnbarriären permeabilitet och matris-metalloproteas aktivitet samtidigt i rumslig korrelation till immun cell infiltration i hjärnvävnad sektioner, kan vi exakt associera dessa neuroinflammatoory händelser till de kliniska tecknen på EAE. Professionell hantering av sjuka möss behöver djupgående utbildning, samt korrekt poängsättning av de kliniska tecknen på EAE.Således är den visuella demonstrationen fördelaktig. Börja detta förfarande med anesthetization av C57-Black/6 möss som har inhysts i specifika-patogen-fria villkor som beskrivs i textprotokollet. Fix den sövda musen i ena handen, och injicera 30 mikroliter av MOG peptid och slutföra Freunds adjuvant emulsion subkutant i var och en av bakbenen flanker, i närheten av inguinal lymfkörtlar.Nu, placera musen på magen, och injicera 20 mikroliter av MOG-peptid emulsion i den mjuka fettvävnaden på både vänster och höger vid svansroten. Injicera också en liten droppe emulsion i halsen på musen. Injicera 100 mikroliter av pertussistoxinlösning intraperitoneally i musen.Håll huvudet av musen nedanför kroppen centrum för att undvika injektion i tarmen. Byt ut underhållsdieten till avelsdieten för att kunna förse mössen med mat med högre energiinnehåll före och under den förväntade kliniska sjukdomen. Upprepa pertussistoxininjektionen 48 timmar efter den första behandlingen.Kontrollera hälsostatusen för EAE-möss varje morgon genom att ta en titt inuti burarna. Betyg EAE möss varje eftermiddag. Ta varje enskild mus som ingår i EAE-experimentet ut ur buren, och kontrollera om svansen har tonus.Flytta svansen uppåt med ett finger. En frisk mus kommer att hålla svansen upp. Om klinisk EAE har startat, svansen tonus kommer att vara lägre, synlig genom en gradvis droppe av svansen.Så småningom kommer musen inte att kunna lyfta sin svans alls. Placera varje enskild mus som ingår i EAE-experimentet på den rena bänken för att observera och dokumentera gångbeteendet. Se texten för poängsättningskriterier för bedömning av sjukdomsvårt, vilket är EAE-poängen.Bedöma och dokumentera vikten av varje mus som ingår i experimentet. För att förbereda dextran lager lösningar, lösa 10 milligram tre kilodalton Dextran Texas Red i 500 mikroliter av 0,9%natriumklorid lösning och fem milligram 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 i 250 mikroliter av 0,9%natriumkloridlösning. För dextran arbetslösningen, strax före injektion, pipetter 55 mikroliter av 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 stamlösning på en bit tätning film.Lägg sedan till 55 mikroliter av tre kilodalton Dextran Texas Red stamlösning. Blanda och samla in 100 mikroliter till en engångsfinspruta. Därefter placerar du en sövd mus i den laterala positionen på bordet.Injicera intravenöst 100 mikroliter fluorescerande spårämnen i musen innan musen vaknar. Låt spårämnet cirkulera i 15 minuter innan du utför perfusion av möss som beskrivs i textprotokollet. Fyll en platt dewar behållare med krossad torris, och tillsätt 2-metylbutan tills vätskan når ungefär en centimeter ovanför torrisförpackningen.Täck med ett löst lock, till exempel en ishink täcka. Efter klippning av huvudet på perfused musen med vass sax, ta bort huden och öronen med hjälp av en mindre uppsättning sax. Dissekera försiktigt skullcapen, genom att klippa från foramen magnumen in mot bekläda på lämnad och den högra sidan, för att låta upfolding av skullcapen över hjärnan.Sedan försiktigt lyfta ut intakt hjärna från basen av skallen samtidigt bryta de optiska nerverna med hjälp av en platt metall spatel. Placera hjärnan på aluminiumfolie. Skär hjärnan i tre bitar genom att placera två korona snitt.De tre styckena representerar frontalhjärnan, mitten hjärnan, och lillhjärnan med hjärnstammen. Fyll en Cryomold till första kvartalet med optimal temperatur skärmatris. Placera sedan hjärnan skivor i Cryomold, med den främre sidan av varje hjärna bit nedåt.Täck vävnaden helt med matris. Placera Cryomold med vävnaden i en horisontell orientering i 2-metylbutan badet. Se till att vävnaden fryser från botten till toppen inom en minut genom att undvika att doppa hela vävnadsblocket i badet.Överför den frysta vävnaden till minus 80 grader Celsius för förvaring. Se textprotokollet för beredning av de frysta vävnadssektionerna. Hämta sex-micron, icke-fast hjärnvävnad sektioner som hade utarbetats från EAE möss.I en draghuv tina sektionerna inuti plastfrysningsdosan som innehåller kiselgel i locket för att undvika vätskeansamling i vävnaden. Separera två vävnadssektioner på en bild genom att rita linjer med en vattenavvisande penna. Centrifugera reaktionslösningar i fem minuter vid 13, 300 gånger g vid rumstemperatur, och förvarma till 37 grader Celsius med hjälp av ett vattenbad.Sedan, rehydrera vävnadssektionerna i fem minuter vid 37 grader Celsius med 1X reaktionsbuffert. Efter fem minuter, häll av 1X reaktionsbufferten. Lägg till reaktionslösning på vävnadssektionerna, och inkubera i fyra timmar vid 37 grader Celsius.Sedan tvätta diabilder fem gånger i dubbeldestillerat vatten. Nu, fixa sektionerna i fem minuter med iskall metanol vid minus 20 grader Celsius innan du tvättar dem en gång med PBS i rumstemperatur. Lägg till 1%BSA i PBS till sektionen, och inkubera i 20 minuter i rumstemperatur.Sedan, kasta bufferten från avsnittet genom att vända bilden på en vävnad. Tillsätt primär antikroppscocktail till sektionen och inkubera i en timme i rumstemperatur. Efter tvätt av sektionerna två gånger med PBS, tillsätt sekundär antikroppscocktail och inkubera i en timme i rumstemperatur.Sedan tvättar du sektionerna två gånger med PBS, och monterar du objektglasen med inbäddningslösning. Efter att låta de monterade sektionerna torka över natten i rumstemperatur, analysera färgade vävnadssektioner med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. EAE-sjukdomens svårighetsgrad ökar fram till toppen av sjukdomen, vilket kan förväntas mellan dag 16 och 20 efter EAE-induktion.Vid toppen av kliniska EAE, möss visade också den lägsta kroppsvikten, vilket ökar i korrelation till amelioration av EAE i eftergift fasen av sjukdomen. Visas här är en representativ bild av choroid plexus och den intilliggande hjärnan parenkym av en C57-Black/6 mus som lider av EAE. Musen injicerades intravenöst 15 minuter innan den offrades.Spårämnen sprids lätt över de fenestraterade mikrokärlen i stomi av choroid plexus, medan blod - hjärnbarriären inte tillåter diffusion av cirkulerande spårämnen i hjärnan parenkym, som därmed saknar någon fluorescerande signal. Dessa bilder visar representativa läckande blodkärl i lillhjärnan på en C57-Black/6 mus som lider av EAE. Pilspetsar indikerar spårämnen som sprids över hjärnans mikrokärl i CNS-parenkymet, vilket tyder på att blod - hjärnbarriären funktion är nedsatt i dessa fartyg.I CNS parenkym, grön och röd fluorescerande signal är synlig utanför blodkärlsväggarna. Korrekt subkutan placering av MOG-CFA emulsion är avgörande för att montera lämpliga immunsvar som leder till EAE. Intraperitoneal och intramuskulär injektion bör undvikas.Förbered CFA under en rökhuv för att undvika inandning av det försvagade Mycobacterium. Undvik också ens självinjektion med MOG-CFA-emulsionen, eftersom detta kan orsaka kondylom eller till och med leda till EAE hos individer som är genetiskt predisponerade. Hjärninfiltrerande immunceller kan isoleras från CNS av möss som lider av EAE för att kvantifiera infiltrera immuncellundergrupper under neuroinflammation genom flödescytometri.Att bedöma endotel- och gliahjärnbarriärernas integritet kan översättas till analys av genetiskt modifierade musmodeller eller till modeller av andra neurologiska sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Beredning av Mouse Hypofys Immunogen för induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis i SJL Möss

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducerad Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) hos C57BL / 6 möss

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Fastställande dämpa immunförsvaret mot CNS skydd för farmakologisk intervention i autoimmun Demyelinisering

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

En snabb, enkel och standardiserad homogeniseringsmetod för att framställa antigen/ adjuvansemulsioner för att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...