Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

وأيد هذا العمل "أموال بدء التشغيل جامعة الدولة آيوا". جزئيا في تمويله هو زمالة ترينيكت جبهة الخلاص الوطني والاستاذية هوبة مانلي. T.J.M. أيده جزئيا كارين وزمالة كلية فوغن ديني. يشكر المؤلفون آيوا جامعة الدولة تدفق مرفق الخلوي ومختبر أبحاث جميع كيك للمساعدة مع الأسفار ودراسات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.

1-خلية ظروف الثقافة والتوجيه
ملاحظة: في التجارب التالية، ثلاث سلالات المستخدمة: BL21 كولاي (DE3) مع موجه فارغ، BL21 كولاي (DE3) مع البلازميدات بأفكا14 و pET28:green نيون البروتين (التجارة والنقل)، و BL21 كولاي (DE3) مع البلازميدات بافكب14 و pET28:GFP. وتزرع جميع سلالات في مر?...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

نقدم استراتيجية الفائق لكشف الروابط الخاصة فوكوسيلاتيد أوليجوساكتشاريديس اللبن البشري. كان ذلك عن طريق بناء خلية كله أجهزة استشعار العوامل البيولوجية عن طريق الهندسة وراثيا كولاي التي تستجيب مع إشارة فلورسنت عند الاستقراء مع جليكانس محددة. تفاصيل البروتوكول أيضا على كيف يمكن استخ?...

Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) هي مشتقة من اللاكتوز-oligosaccharides، عادة ما تتألف من ثلاث إلى ثماني السكر مونومرات. لديهم اللاكتوز (غال-β1، 4-جنة الضوء الأخضر) الحد من نهاية وهي ممدود المزيد من الروابط glycosidic (بيتا-1، 3-أو β-1، 6-) الجلوكوز (الأخضر)، واللبن (Gal)، أو ن-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك). وباﻹضافة إلى ذلك، فوكوسي (الجبهة، α-1، 2--أو α-1، 3-) أو حمض اللعابي (سيا أو نيواك، α-2 و 3-أو α-2، 6-) المخلفات غالباً ما يتم إضافة1.
التحليل الحالي أوليجوساكتشاريديس والكربوهيدرات الأخرى محدودة في الإنتاجية والنطاق بالحاجة إلى والمطيافيه الكروماتوغرافي/الكتلة (MS) التكنولوجيا2،3،،من45، 6 , 7، والذي يمكن أن يستغرق حوالي ساعة كل عينة، ناهيك عن الضرورة لمعدات غالية الثمن والأعمدة المتخصصة ووكلاء ديريفاتيزينج والخبرة في تشغيل هذه المعدات8. الروابط oligosaccharide تتسم بصعوبة خاصة لتحديد، تتطلب متقدمة MS9،10 أو تقنيات الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)11. التحسين السريع لتوليف لهذه أوليجوساكتشاريديس وبالتالي يحد من الإنتاجية من هذه الخطوة التحليلية بطيئة.
في هذه الدراسة، ونظهر الكشف الخاصة بالربط من تريساكتشاريدي فوكوسيلاتيد إهمال يستند اللاكتوز، مع التركيز على 2 '--فوكوسيلاكتوسي (2-فلوريدا) هو مؤمن الأكثر وفرة في اللبن البشري، وراثيا تم ترميزه باستخدام خلية كله الإشريكيّة القولونية بيوسينسور حدا للكشف على 4 مغ/لتر. من السمات هامة لهذا بيوسينسور هو قدرته على التفريق بين تريساكتشاريديس متجازئه. يستند مبدأ التصميم إلى التعبير عن فوكوسيداسيس محددة في كولاي أن تحرير اللاكتوز من إهمال، هو الكشف عن وجود التي بها مشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي ، الذي يولد بدوره إشارة فلورسنت. يمكننا تحقيق ذلك من خلال بناء نظام بلازميد اثنين، واحد إيواء فوكوسيداسي الخاصة بالربط والآخر بروتين مراسل فلورسنت. منصة بيوسينسور هذا مناسبة للفرز الفائق بالتدفق الخلوي أو قارئ لوحة صغيرة. كما نبدي الاستفادة بيوسينسور في التحديد الكمي 2 '--فلوريدا التي تنتجها سلالة المهندسة12. ضمن هذه الدراسة، كما نقدم ثلاث استراتيجيات في إزالة انتقائية من اللاكتوز التي يمكن أن تسفر عن إشارة إيجابية كاذبة من بيوسينسور، نظراً لأن يزرع سلالة منتج هندسيا على اللاكتوز.
أخذت معا، هذه الأجهزة المشفرة جينياً يسمح لنا بكشف وتحديد إهمال في طريقة الربط على حدة، وصعبة حتى مع الكروماتوغرافي، مرض التصلب العصبي المتعدد، أو الرنين المغناطيسي تقنيات. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب نظراً للإنتاجية العالية وسهولة الاستخدام، تطبيقات على نطاق واسع في الهندسة الأيضية وتوليف من إهمال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Oligosaccharides اللبن البشري (إهمال) عناصر الكربوهيدرات المعقدة في لبن الثدي البشري الذي يحمل فوائد وفيرة على صحة الرضع. ومع ذلك، يقتصر التحسين على التوليف التكنولوجيا الحيوية الإنتاجية منخفضة نسبيا من الكشف والتحديد الكمي لأحادي والروابط. وتشمل التقنيات التقليدية لتحليل جليكان طرق الكروماتوغرافي/الجماهيري-والمطيافيه مع الإنتاجية بناء على أمر من مئات العينات يوميا دون التنفيذ التلقائي. نظهر هنا، بيوسينسور بكتيرية مرمزة وراثيا لكشف الفائق، والخاصة بالربط والتقدير الكمي لهياكل فوكوسيلاتيد مؤمن و 2-فوكوسيلاكتوسي 3-فوكوسيلاكتوسي، الذي يمكننا تحقيقه عن طريق مغايرة التعبير عن فوكوسيداسيس. كما يمكن أن يؤدي وجود اللاكتوز في الحليب أو في العمليات الحيوية لايجابيات كاذبة، علينا أن نبرهن أيضا الحد الإشارات من اللاكتوز استخدام استراتيجيات مختلفة. نظراً للإنتاجية العالية لهذه التقنية، يمكن جزيئي العديد من شروط رد فعل أو معلمات مفاعل حيوي في نفس الوقت في بضع ساعات، مما يسمح للاستفادة المثلى التصنيع مؤمن.

لقد قمنا بتصميم بيوسينسور خلية كله معينة إلى 2 '--فلوريدا التي يمكن استخدامها بالاقتران مع إنتاج التكنولوجيا الأحيائية oligosaccharide. وهذا يعتمد على الانقسام الانزيمية محددة لتعديل السكريات محطة توليد اللاكتوز وبالتالي تفعيل مشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي ، تؤدي إلى ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

يصف لنا هنا كشف الفائق والتقدير الكمي فوكوسيلاتيد لبن oligosaccharides (إهمال) استخدام بيوسينسور كامل الخلية. كما نبدي هنا، تكييف هذا البرنامج نحو تحليل لسلالات إنتاج مؤمن، مع التركيز على تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.

تحليل تريساكتشاريديس الحليب فوكوسيلاتيد الإنسان في سياق التكنولوجيا الأحيائية باستخدام جينياً ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية التي ينطوي عليها إنتاج حليب الأم oligosaccharides. أولاً، كم من المنتج لدي؟ وثانياً، ما هو الرابط المحدد للكربوهيدرات؟والهدف هنا هو تبسيط وتسريع عملية تحديد خصائص وسم هذه الدهون في الحليب البشري. هذه الطريقة لها ميزتان على الحالة الحالية للفن. أولاً، إنه قابل للفحص عالي الإنتاجية.لذلك، يمكنك أن تتخيل اختبار الآلاف من الظروف المختلفة أو ربما حتى مكتبة من الانزيمات التوليف في يوم واحد باستخدام هذه التقنية. أيضا، فإنه يستخدم خصوصية الركيزة الفريدة التي تطورت الطبيعة في الانزيمات لتعطينا معلومات حول ربط الكربوهيدرات تلك oligosaccharides. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة يمكن أن تحسن إنتاج حليب الأم oligosaccharides، والتي بدورها يمكن أن تؤدي إلى حليب الرضع نوعية أفضل أن يحاكي عن كثب حليب الثدي البشري وتساعد على سد الفجوة بين الأطفال الرضاعة الطبيعية والرضاعة الطبيعية.ويوصى المستخدم السلطة التقديرية عند اتخاذ قرار ما طريقة لاستخدام لإزالة اللاكتوز على أساس التكلفة والإنتاجية وتوافر المعدات. وينبغي توخي الحذر لضمان إزالة اللاكتوز الأمثل. في اليوم السابق للتجربة، بذور 5 ملليلتر من LB المتوسطة تكملها مع الكناميسين والكاربينسيلين من مستعمرة بكتيرية جديدة باستخدام تقنيات معقمة.احتضان جميع الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهياج. في اليوم التالي، نقل 50 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها إلى خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB M9 الطازجة مع الكناميسين والكاربينيسيلين. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر حتى الثقافة قد وصلت إلى OD600 بين نقطة الصفر 5 و صفر نقطة سبعة.أولاً، نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى نقطة واحدة خمسة أنابيب ملليلتر وطاردة مركزية في 12،500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من 1X برنامج تلفزيوني لإعداد تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية الواحدة إلى أنابيب الفاكس.استخدم مقياس تدفق للتدفق لإثارة GFP وجمع مستويات الفلورس في فيتC كما هو موضح في بروتوكول النص. لجعل منحنى المعايرة، وجعل ثمانية إلى 10 التخفيفات من 2'FL القياسية في نطاق بين صفر و 2500 ملليغرام للتر الواحد. ثقافة خلايا الاستشعار الحيوي 2'FL والحث عليها مع التخفيفات القياسية على النحو المبين في بروتوكول النص.بدء ثقافة من سلالة إنتاج 2'FL في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي, ثقافة فرعية في 1٪ في 250 ملليلتر من وسائل الإعلام أعدت الحد الأدنى وإضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 10 غراما للتر الواحد. احتضان في 37 درجة مئوية حتى تصل الثقافة وOD600 بين نقطة الصفر خمسة وصفر نقطة سبعة.ثم يضاف IPTG إلى تركيز نهائي من نقطة الصفر خمسة ملليمترات و اللاكتوز إلى تركيز نهائي من غرامين لكل لتر. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، نقل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنابيب 50 ملليلتر العقيمة والطرد المركزي في 900 مرة ز لمدة 15 دقيقة.تجاهل المابير وإعادة تعليق بيليه في المياه ديون. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات لإزالة أي اللاكتوز المتبقية. بعد هذا، إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المياه الأيونية.وضع الخلايا على الجليد واستخدام سونيكاتور في 30٪ السلطة في 30 ثانية نبضات لlyse تعليق الخلية. الطرد المركزي الخلايا lysed في 2، 000 مرة ز لمدة 25 دقيقة. إزالة ناظر وتمريره من خلال مرشح عقيم.تخزين مصفى مصفى في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للتحليل. المقبل، تلقيح ثقافة من 2'FL خلايا الاستشعار البيولوجي. في منتصف مرحلة السجل، والحث الخلايا مع الخلية lysate في تركيزات تعادل تلك التي 2'FL المستخدمة لجعل منحنى المعايرة.تنفيذ المعايرة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، قم بتشغيل العينات على مقياس تدفق. توليد منحنى استجابة جرعة عن طريق رسم الانتاج fluorescence ضد تركيز oligosaccharide ومقارنة استجابة المعايير لlysate الخلية.أولاً، حل FL alphalyzed بيتا galactosidase إلى 1،000 وحدة لكل ملليلتر في كلوريد المغنيسيوم ملليمولار واحد. لتحديد التركيز الأمثل للإنزيمات اللازمة، تنمو inoculum من 2'FL خلايا الاستشعار البيولوجي وفي مرحلة منتصف سجل، والحث مع اللاكتوز و2'FL. إلى 100 الثقافات microliter، إضافة كميات متغيرة من بيتا galactosidase تصل إلى 12 وحدة.دع الثقافات تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر. قياس الفلوريس كما هو موضح في بروتوكول النص وحساب الوحدات المثلى من الانزيم اللازمة عن طريق تحديد الحد الأدنى من تركيز الانزيم لتحقيق التوهين المطلوب من إشارة. إلى 2'FL إنتاج الخلايا التي نمت لمدة 24 ساعة إضافة وحدات الأمثل من بيتا galactosidase واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وتحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا.أولاً، ابدأ ثقافة 25 ملليلتر من سلالة إنتاج 2'FL. وبمجرد أن يتم تحفيز السلالة في مرحلة منتصف السجل، قم باحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تلقيح ثقافة E.coli BL21 في وسائط LB.تنمو إلى منتصف مرحلة السجل في 37 درجة مئوية ثم إضافة 15 ملليلتر من هذه الثقافة إلى ثقافة 2'FL 24 ساعة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم، تحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا.للبدء، بدء ثقافة 25 ملليلتر من سلالة إنتاج 2'FL. وبمجرد أن يتم تحفيز السلالة في مرحلة منتصف السجل، قم باحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إضافة مجلدين من الإيثانول 100٪ إلى الثقافة وتهز جيدا.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ثم، الطرد المركزي تعليق في 900 مرة ز لمدة 15 دقيقة. جمع فائقة واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية لتسريع اللاكتوز.تمرير الحل من خلال ورقة مرشح لإزالة اللاكتوز المترسب. جمع الترشيح الذي يحتوي على lysate الخلية وتحديد 2'FL titre كما هو موضح سابقا. في هذه الدراسة، يتم استخدام استراتيجية عالية الإنتاجية للكشف عن الربط المحدد من oligosaccharides الحليب البشري fucosylated.ويتم ذلك عن طريق بناء كامل الخلية البيولوجية أجهزة الاستشعار عن طريق الهندسة الوراثية E.Coli التي، عند الاستقراء مع الجليكان محددة، والاستجابة مع إشارة الفلورسنت. إشارة الفلورسنت في ظل ظروف مختلفة من الحث كما تم تحليلها على تدفق مقياس التحلل، ويظهر أكثر من 100 ضعف زيادة في الفلورسيه مع 2'FL الاستشعار الحيوي مقارنة مع ناقلات فقط التحكم أو الاستشعار الحيوي ل3'FL. وهذا يدل على خصوصية الربط العالية للمستشعر الحيوي.يمكن تحديد حساسية المقايسة عن طريق توليد منحنى استجابة الجرعة مع مستويات الكربوهيدرات متفاوتة. ويعتبر النطاق الخطي الديناميكي للكشف 2'FL، ليكون بين 40 و 400 ملليغرام للتر الواحد والحد من الكشف هو أربعة ملليغرام للتر الواحد. يمكن إجراء هذا الفحص على مدار يوم عمل كما يتضح في قياسات اللقطة المفاجئة لديناميات تعبير المراسل.يمكن استخدام خلايا الاستشعار الحيوي للكشف عن وقياس 2'FL من سلالة منتج 2'FL المهندسة باستخدام عدد من الاستراتيجيات للحد من الإشارة من اللاكتوز الخارجية بحيث تكون الإشارة التي تم قراءتها تتوافق مباشرة مع تركيز 2'FL. استراتيجية واحدة هي أن تتحلل الأنزيمية اللاكتوز باستخدام جلاككتوزيدز بيتا التي لا تعمل على اللاكتوز المعدلة. استراتيجية أخرى تستخدم الإيثانول الذي ليس فقط بشكل انتقائي يعجل اللاكتوز ولكن أيضا lyses الخلايا المنتجة منذ الخلايا تحلل هو خطوة ضرورية إلى أسفل تيار.وأخيرا، فإن الأسلوب الأكثر فعالية ولكن مضيعة للوقت هو بيليه وغسل الخلايا قبل تحلل الخلايا للافراج عن 2'FL داخل الخلايا. وبمجرد أن نؤسس هذه الطريقة، تمكنا من توسيع نطاق ذخيرة الأهداف oligosaccharide باستخدام إنزيمات مختلفة. حاليا، يمكننا الكشف عن تسعة oligosaccharides مختلفة ونحن نعمل على أكثر من ذلك.في حين أن الأمثل هذا الفحص، لاحظنا متانة الإنزيمات لدينا سمح لنا بالخروج مع تقنية تعطي ربط محدد قراءة في حوالي خمس دقائق. وعلى الرغم من أن أياً من الكواشف المستخدمة هنا لا يتسم بالخطورة على وجه الخصوص، فإن أولئك الذين يستخدمون هذه الطريقة ينبغي أن يتبعوا إجراءات المخاطر البيولوجية والاحتواء البيولوجي القياسية بما في ذلك ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

أخذ العينات والمعالجة المسبقة لميناء الأسنان كربونات الكربون مستقرة وتحليل نظائر الأكسجين

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...