Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
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这项工作得到了爱荷华州立大学创业基金的支持。F. e. 的部分资金来自 NSF Trecect 研究金和 Manley Hoppe 教授职位。T. j. m. 得到了 Karen 和 Denny Vaughn 学院研究金的部分支持。作者感谢爱荷华州立大学流式细胞仪设施和 w. m. Keck 代谢代谢研究实验室在荧光和 LC-MS 研究方面提供的协助。

1. 细胞培养和诱导条件
注: 在以下实验中, 使用了三种菌株: 带有空载体的大肠杆菌 BL21 (de3)、带有 pafca 14 和 Pet28:ge18 绿色荧光蛋白 (gfp)的大肠杆菌bl21 (de3) 和带有质粒的大肠杆菌bl21 (de3)pAfcB14和彼得 28: gfp。所有菌株生长在 Luria-Bertani 肉汤 (LB) 或最小的培养基与适当的抗生素。在去离子化 (DI) 水中制备 1, 000倍卡那霉素 (50 Mg/ml) 和卡比西林 (100...

<ol>
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我们提出了一种高通量的策略, 用于检测有豆科乳脂质的母乳低聚糖的链接。这是通过基因工程大肠杆菌构建整个细胞生物传感器来实现的, 在与特定糖类诱导时, 大肠杆菌会以荧光信号做出反应。该协议还详细介绍了如何利用生物传感器检测和量化代谢工程细菌株中的 Hmo。
与色谱质谱方法相比, 我们的协议具有较高的吞吐量, 并具有较高的替代方法优势。低检测极限和...

母乳低聚糖 (Hmo) 是乳糖衍生的低聚糖, 通常由3至8种糖单体组成。他们有乳糖 (Gal-β1, 4-glc) 减少端, 并进一步拉长糖基链 (Β-1, 3-或β-1, 6-) 到葡萄糖 (Glc), 半乳糖 (Gal), 或 n-乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)。此外, 经常添加岩藻糖 (Fuc, α-1, 2-或α-1, 3-) 或唾液酸 (Sia 或 NeuAc, α-2, 3 或α-2, 6-) 残留物1。
目前对低聚糖和其他碳水化合物的分析在吞吐量和范围上都受到色谱-质谱 (ms) 技术的需要,2,3,4, 5,6,7, 每个样品大约需要一个小时, 更不用说昂贵的设备、专用柱和衍生剂的必要性, 以及对该设备操作的专业知识.低聚糖的联系是特别难以确定, 需要先进的 ms9,10或核磁共振 (nmr)技术 11。因此, 这些低聚糖的合成的快速优化受到这一缓慢分析步骤的吞吐量的限制。
在这项研究中, 我们证明了基于甲丝化三糖乳糖的 Hmo 的联系特异性检测, 重点是 2 '-岩藻糖乳糖 (2 '-fl), 这是人类牛奶中最丰富的 HMO, 使用基因编码的大肠杆菌整个细胞在 4 mgl 时具有检测极限的生物传感器。这种生物传感器的一个重要特点是它能够区分异构三糖。设计原理是基于在大肠杆菌中分离乳糖的特定岩藻糖酶的表达, hmo 中的乳糖的存在被lac操作数检测到, 进而产生荧光信号。我们通过建立一个双质化系统来实现这一目标, 一个是具有链状岩溶酶的系统, 另一个是荧光报告蛋白。该生物传感器平台适用于流式细胞仪或微板读取器的高通量筛选。我们还演示了生物传感器在量化工程菌株12产生的 2 '-fl 中的应用.在这项研究中, 我们还提出了三种策略, 选择性去除乳糖, 这可能会导致来自生物传感器的假阳性信号, 因为工程生产者应变是在乳糖上生长的。
总之, 基因编码的生物传感器使我们能够以特定链接的方式检测和量化 Hmo, 即使使用色谱、MS 或 NMR 技术也很难这样做。由于其高吞吐量和易用性, 该方法应在 Hmo 的代谢工程和合成中得到广泛的应用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

母乳低聚糖 (Hmo) 是母乳中复杂的碳水化合物成分, 对婴儿健康有丰富的益处。然而, 由于单糖及其联系的检测和定量吞吐量相对较低, 其生物技术合成的优化受到限制。传统的糖类分析技术包括色谱/质谱法, 每天吞吐量约为数百种, 没有自动化。我们在这里演示了一种基因编码的细菌生物传感器, 用于高通量、链接特异性检测和定量的岩藻酰化 HMO 结构, 2 '-岩藻糖乳糖和 3-岩藻淀粉乳糖, 我们通过异源实现岩藻的表达。由于乳糖在牛奶或生物技术过程中的存在可能导致误报, 我们也证明了使用不同的策略来减少乳糖的信号。由于该技术的高吞吐量, 许多反应条件或生物反应器参数可以在几小时内并行检测, 从而优化了 HMO 的制造。

我们设计了一个专门针对 2 '-fl 的完整细胞生物传感器, 可与低聚糖的生物技术生产结合使用。这依赖于特定的酶裂解产生乳糖, 从而激活乳酸操作子, 导致在乳糖诱导启动子下的报告荧光蛋白的表达, 与2 '-fl 的数量。为了证明其连锁特异性, 还对异构体--3-岩藻糖 (3-FL) 进行了测试。基因电路包含两个部分: 一个岩藻苷酶基因, Afc或afcA, 由一个构成启动子?...

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Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

本文介绍了利用全细胞生物传感器对岩藻糖类母乳低聚糖 (Hmo) 进行高通量检测和定量的研究。我们还在这里演示了这个平台的适应, 以分析 HMO 生产菌株, 重点是提高信噪比。

生物技术环境下的氟黏膜化人乳三糖--用基因编码生物传感器分析

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

这种方法可以帮助回答生产母乳寡糖所涉及的几个关键问题。首先，我有多少产品？其次，具体的碳水化合物联系是什么？这里的目标是简化和加快这些母乳寡糖的量化和特征化过程。与目前的技术状态相比，此方法有两个优点。首先，它支持高吞吐量筛选。所以，你可以想像在一天使用这种技术测试数千种不同的条件，甚至可能是一个合成酶库。此外，它利用自然在酶中进化的独特基质特异性，为我们提供有关这些寡糖的碳水化合物链接的信息。我们相信，这种方法可以改善母乳寡糖的生产，进而能产生更优质的婴儿配方奶粉，更密切地模仿母乳，有助于缩小母乳喂养和配方奶喂养的婴儿之间的差距。在根据成本、吞吐量和设备可用性决定使用哪种方法去除乳糖时，建议用户自行决定。应注意确保最佳的乳糖去除。实验前一天，使用无菌技术，用卡那霉素和卡贝尼西林补充了5毫升的LB介质。在37摄氏度的温度下孵育所有培养物。第二天，将50微升的隔夜培养剂转移到5毫升的新鲜LB M9介质中，用卡那霉素和卡贝尼西林。在37摄氏度下孵育，持续摇晃，直到培养达到OD600之间零点5和零点7。首先，将隔夜培养物转移到一点五毫升管中，以12，500次g离心，一分钟。丢弃上一提液，在 500 微升 1x PBS 中重新悬浮颗粒，以准备单个电池悬浮液。将单单元悬架传输到传真管。使用流量细胞计激发GP并收集文本协议中概述的 FITC 荧光水平。要制定校准曲线，在每升零到 2500 毫克的范围内对标准 2'FL 进行 8 到 10 次稀释。培养2'FL生物传感细胞，并诱导它们与标准稀释，如文本协议中概述。在五毫升 LB 介质中启动 2'FL 产生菌株的培养，并在 37 摄氏度下一夜之间生长。第二天，亚培养在1%在250毫升准备的最小介质和添加甘油到每升10克的最终浓度。在37摄氏度下孵育，直到培养达到，OD600在零点5和零点7之间。然后将IPTG加入到零点五毫摩尔和乳糖的最终浓度中，最终浓度为每升2克。在37摄氏度下孵育，连续摇晃24小时。第二天，将隔夜培养转移到无菌的50毫升管和离心机在900倍g15分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新悬浮在去压水中。重复此洗涤三次，以去除任何残留乳糖。在此之后，将颗粒重新悬浮在五毫升的去化水中。将细胞放在冰上，在30秒脉冲中以30%的功率使用声波器来使细胞悬浮液。将 2，000 次 g 的细胞离心 25 分钟。取出上清液，并通过无菌过滤器。将过滤的上清液存放在摄氏四度，直到准备好进行分析。接下来，接种2'FL生物传感细胞的培养物。在中日志阶段，诱导细胞与细胞的细胞以相当于用于进行校准曲线的2'FL的浓度。执行文本协议中概述的校准。在此之后，在流式测速仪上运行样本。通过绘制荧光输出与寡糖浓度并比较标准与细胞酸盐的响应，生成剂量响应曲线。首先，将FLαlyzedβ乳酸酶溶解到每毫升1000个单位，在一毫摩尔氯化镁中。为了确定所需的酶的最佳浓度，生长2'FL生物感应细胞的 inolum，并在中日志阶段，诱导乳糖和2'FL。到 100 微升培养物，添加可变数量的β乳糖酶，最多 12 个单位。让文化在37摄氏度下一夜之间随着持续摇晃而生长。测量文本协议中描述的荧光，通过确定最小酶浓度来计算所需的酶最佳单位，以实现所需的信号衰减。到2'FL产生细胞生长24小时添加β乳糖酶的最佳单位，并在37摄氏度过夜孵育，确定2'FL滴答声，如前面所述。首先，开始2'FL生产菌株的25毫升培养。一旦在中原阶段诱导该菌株，在37摄氏度下孵育培养24小时。接下来，在 LB 介质中接种大肠杆菌 BL21 培养。在 37 摄氏度下将其生长到中日志阶段，然后将 15 毫升的这种培养添加到 24 小时 2'FL 培养中。在37摄氏度下孵育3小时。然后，确定如前所述的 2'FL 奶嘴。首先，开始2'FL生产菌株的25毫升培养。一旦在中原位诱导该菌株，在37摄氏度下孵育培养24小时。在培养中加入两卷 100% 乙醇，并摇好。在37摄氏度下孵育4小时。然后，将悬浮液在 900 次 g 下离心 15 分钟。收集上清液和孵育过夜在4摄氏度沉淀乳糖。通过滤纸将溶液传递，以去除沉淀的乳糖。收集包含细胞赖化的滤盐，并确定如前所述的 2'FL 滴答声。本研究采用高通量策略，对富二氧化硅氧化硅进行联杆检测。这是通过基因工程E.Coli构建全细胞生物传感器实现的，当用特定的甘油诱导时，用荧光信号进行响应。在流量细胞仪上分析的不同感应条件下的荧光信号显示，与仅对病媒或 3'FL 的生物传感器相比，2'FL 生物传感器的荧光度增加了 100 倍以上。这表明生物传感器具有高联动特异性。通过生成具有不同碳水化合物水平的剂量反应曲线，可以确定测定的敏感性。2'FL 检测的动态线性范围，见为每升 40 至 400 毫克，检测限值为每升 4 毫克。此检测可以在工作日进行，如记者表达式动力学的快照测量中显示的。生物传感细胞可用于检测和量化工程2'FL生产菌株的2'FL，使用许多策略来减少来自外源乳糖的信号，使读出的信号直接对应于2'FL浓度。一种策略是使用对改性乳糖不采取行动的β乳糖酶。另一种策略是利用乙醇，它不仅选择性地沉淀乳糖，而且使产生细胞，因为细胞解解是一个必要的。最后，最有效但耗时的方法是细胞解解前对细胞进行颗粒和洗涤，以释放细胞内2'FL。一旦我们建立了这种方法，我们能够使用不同的酶扩展寡糖靶的系列。目前，我们可以检测出9种不同的寡糖，我们正在研究更多。在优化这种测定时，我们注意到酶的鲁棒性使我们能够想出一种技术，在大约五分钟内给出一个链接特定的读出。虽然这里使用的试剂都不是特别危险的，但使用这种方法的试剂应遵循标准的生物危害和生物控制程序，包括穿着适当的 PPE。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到<em&gt;取值</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

科研

生物化学

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

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BioID 细胞环境中特异蛋白复合物的分离-蛋白质组学分析

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