Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Iowa State University start midler. F.E. var delvist finansieret af NSF Trinect Fellowship og Manley Hoppe professorat. T.J.M. blev delvist støttet af Karen og Denny Vaughn fakultet stipendium. Forfatterne takke Iowa State University Flow flowcytometri facilitet og WM Keck Metabolomics Research Laboratory for bistand med fluorescens og LC-MS undersøgelser.

1. celle kultur og induktion betingelser
Bemærk: I de følgende eksperimenter, bruges tre stammer: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 og pET28:green fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 og pET28:GFP. Alle stammer, der er dyrket i Luria-Bertani bouillon (LB) eller minimal medier med passende antibiotika. Forberede stamopløsninger af 1.000 x ...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

Vi præsenterer en høj overførselshastighed strategi for kobling-specifik påvisning af fucosylated modermælk oligosaccharider. Dette blev opnået ved at bygge hele cellen biosensorer af genetisk engineering E. coli som på induktion med specifikke glycans reagerer med en fluorescerende signal. Protokollen også detaljer om hvordan biosensor kan bruges til at detektere og kvantificere HMOs i en metabolisk manipuleret bakteriel stamme.
Vores protokol tilbyder fordele over alternativ...

Modermælk oligosaccharider (HMOs) er laktose-afledte oligosaccharider, normalt bestående af tre til otte sukker monomerer. De har en laktose (Gal-B1, 4-Glc) reducere ende og er yderligere aflange af glycosidic links (β-1,3 - eller β-1,6-) til glukose (Mona), galaktose (Gal) eller N-acetylglukosamin (GlcNAc). Derudover fucose (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic syre (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) restkoncentrationer er ofte tilsat1.
Aktuelle analyse af oligosaccharider og andre kulhydrater er begrænset i overførselshastighed og omfang af behovet for gaskromatografisk/masse spektrometrisk (MS) teknologi2,3,4,5, 6 , 7, som kan tage omkring en time pr. prøve, for ikke at nævne nødvendigheden af dyrt udstyr, specialiserede kolonner og afledende agenter og ekspertise på driften af dette udstyr8. Oligosaccharid forbindelser er særdeles vanskeligt at fastslå, der kræver avanceret MS9,10 eller Kernemagnetisk resonans (NMR) teknikker11. Hurtig optimering af syntesen af disse oligosaccharider er således begrænset af gennemløb af denne langsomme analytiske trin.
I denne undersøgelse, vi påvise kobling-specifik påvisning af fucosylated trisaccharide laktose-baserede HMOs, med fokus på 2'-fucosyllactose (2'-FL), er den mest rigelige HMO i modermælk, ved hjælp af en genetisk kodet Escherichia coli hele cellen biosensor med en grænse på opdagelse på 4 mg/L. Et vigtigt element i denne biosensor er dens evne til at skelne mellem isomer trisaccharider. Designprincip er baseret på udtryk for bestemt fucosidases i E. coli , at befri laktose fra HMOs, som registreres af lac operonen, som gengæld genererer en fluorescerende signal. Dette opnås ved at bygge en to-plasmid system, en husly kobling-specifikke fucosidase og den anden en fluorescerende reporter protein. Denne biosensor platform er velegnet til høj overførselshastighed screening ved flowcytometri eller mikro-Pladelæser. Vi viser også udnyttelsen af biosensor i kvantificere 2'-FL produceret af en manipuleret stamme12. Inden for denne undersøgelse præsentere vi også tre strategier på selektiv fjernelse af laktose, som kan resultere i falske positive signal fra biosensor, eftersom manipuleret producent stamme er vokset på lactose.
Tilsammen, de genetisk kodet biosensorer gør det muligt at detektere og kvantificere HMOs i en kobling-specifik måde, som er svære selv med kromatografiske, MS eller NMR teknikker. På grund af sin høje overførselshastighed og brugervenlighed, bør denne metode har udbredt programmer i metaboliske engineering og syntese af HMOs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Modermælk oligosaccharider (HMOs) er komplekse kulhydrater komponenter i modermælk, der udviser rigelige fordele infant sundhed. Men, optimering af deres bioteknologiske syntese er begrænset af den relativt lave dataoverførselshastighed i påvisning og kvantificering af monosakkarid og forbindelser. Konventionelle teknikker af glycan analyse omfatter kromatografiske/massespektrometrisk metoder med overførselshastighed på rækkefølgen af hundredvis af prøver pr. dag uden automatisering. Vi viser her, en genetisk kodet bakteriel biosensor for høj overførselshastighed, kobling-specifik påvisning og kvantificering af fucosylated HMO strukturer, 2'-fucosyllactose og 3-fucosyllactose, som vi opnåede via heterolog udtryk for fucosidases. Da tilstedeværelsen af laktose i mælk eller i bioteknologiske processer kan føre til falske positiver, vise vi også reduktion af signal fra laktose ved hjælp af forskellige strategier. På grund af den høje overførselshastighed på denne teknik, kunne mange reaktionsbetingelser eller bioreaktor parametre analyseres parallelt i løbet af få timer, giver mulighed for optimering af HMO fremstilling.

Vi har designet en hel celle biosensor specifikke for 2'-FL der kan bruges i forbindelse med den bioteknologiske produktion af oligosaccharid. Dette er baseret på specifikke enzymatisk kløvningen af modificerer terminal sukker skaber laktose og dermed aktivering af lac operonen, fører til udtryk af en reporter fluorescerende protein en laktose inducerbar promotor, i forhold til den mængden af 2'-FL. For at demonstrere sin kobling specificitet, 3-fucosyllactose (3-FL), en isom...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Vi beskriver her høj overførselshastighed påvisning og kvantificering af fucosylated modermælk oligosaccharider (HMOs) ved hjælp af en helhed-celle biosensor. Vi viser også her, en tilpasning af denne platform til analyse af HMO produktionsstammer, fokuserer på at forbedre signal-støj-forholdet.

Analyse af Fucosylated Human mælk trisaccharider i bioteknologiske sammenhæng ved hjælp af genetisk kodet biosensorer

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare flere centrale spørgsmål, der er involveret i produktionen af modermælk oligosaccharider. For det første, hvor meget af produktet har jeg? Og for det andet, hvad er den specifikke kulhydrat forbindelse?Målet her er at forenkle og fremskynde processen med kvantificering og karakterisering af disse modermælk oligosaccharider. Denne metode har to fordele i forhold til det aktuelle niveau. For det første er det modtageligt for høj-throughput screening.Så du kan forestille dig at teste tusindvis af forskellige betingelser eller måske endda et bibliotek af synteseenzymer på en dag ved hjælp af denne teknik. Også, det bruger den unikke substrat specificitet, at naturen har udviklet sig i enzymer til at give os oplysninger om kulhydrat sammenkok af disse oligosaccharider. Vi mener, at denne metode kan forbedre produktionen af modermælk oligosaccharider, hvilket igen kan føre til bedre kvalitet modermælkserstatning, der i højere grad efterligner modermælk og hjælpe med at lukke kløften mellem ammede og formel-fodret babyer.Bruger skøn anbefales, når det besluttes, hvilken metode til at bruge til laktose fjernelse baseret på omkostninger, gennemløb og udstyr tilgængelighed. Der skal sørges for optimal fjernelse af laktose. Dagen før forsøget, frø 5 milliliter LB medium suppleret med kanamycin og carbenicillin fra en frisk bakteriekoloni ved hjælp af sterile teknikker.Inkuber alle kulturer natten over ved 37 grader Celsius med agitation. Den næste dag, overføre 50 mikroliter af en overnight kultur i fem milliliter friske LB M9 medier med kanamycin og carbenicillin. Inkubere ved 37 grader Celsius med kontinuerlig rystelser, indtil kulturen har nået en OD600 mellem nulpunkt fem og nul punkt syv.Først overføres natten kulturer i et punkt fem milliliter rør og centrifuge ved 12, 500 gange g i et minut. Kassér supernatanten og re-suspendere pellet i 500 mikroliter af 1x PBS at forberede en enkelt celle suspension. Overfør enkeltcellesuspensionen til faxrør.Brug et flowcytometer til at ophidse GFP og indsamle FITC-fluorescensniveauer som beskrevet i tekstprotokollen. For at gøre en kalibrering kurve, gøre otte til 10 fortyndinger af standard 2'FL i intervallet mellem nul og 2500 milligram per liter. De 2'FL-biosensorceller og inducer dem med standardfortyndingerne som beskrevet i tekstprotokollen.Start en kultur af en 2'FL producerer stamme i fem milliliter LB medier og vokse det natten over ved 37 grader Celsius. Den næste dag, subkultur på 1% i 250 milliliter forberedt minimal medier og tilføje glycerol til en endelig koncentration på 10 gram per liter. Inkubere ved 37 grader Celsius, indtil kulturen når og OD600 mellem nulpunkt fem og nulpunkt syv.Derefter tilsættes IPTG til en endelig koncentration af nulpunkt fem millimolar og laktose til en endelig koncentration på to gram per liter. Inkuber ved 37 grader Celsius med kontinuerlig omrystning i 24 timer. Den næste dag, overføre natten kultur til sterile 50 milliliter rør og centrifuge ved 900 gange g i 15 minutter.Kassér supernatanten og re-suspendere pellet i deioniseret vand. Gentag denne vask tre gange for at fjerne eventuelle resterende laktose. Derefter skal pelleten re-suspenderes i fem milliliter deioniseret vand.Placer cellerne på is og bruge en sonicator på 30% magt i 30 sekunder pulser til lyse celle suspension. Centrifuge de lysede celler ved 2,000 gange g i 25 minutter. Fjern supernatanten og før den gennem et sterilt filter.Opbevar den filtrerede supernatant ved fire grader Celsius, indtil den er klar til at analysere. Dernæst vaccinere en kultur af 2'FL bio-sensing celler. I midten af logfasen fremkaldes cellerne med cellen i koncentrationer svarende til de 2'FL, der anvendes til at lave kalibreringskurven.Udfør kalibreringen som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter skal du køre prøverne på et flow cytometer. Der genereres en dosisresponskurve ved at afbilde fluorescensproduktionen mod oligosaccharidkoncentrationen, og standardernes respons sammenlignes med cellens lysat.Først opløses FL alphalyzed beta galactosidase til 1.000 enheder pr. milliliter i en millimolar magnesiumchlorid. For at bestemme den optimale koncentration af det nødvendige enzym skal der dyrkes et inokulum af 2'FL biosensorceller og i midten af logfasen, fremkalde med laktose og 2'FL. Til 100 mikroliter kulturer, tilføje variable mængder af beta galactosidase op til 12 enheder.Lad kulturerne vokse natten over ved 37 grader Celsius med kontinuerlig rystelser. Fluorescens som beskrevet i tekstprotokollen måles, og de optimale enzymenheder, der er nødvendige, ved at bestemme den mindste enzymkoncentration for at opnå den ønskede dæmpning af signalet. Til 2'FL producerende celler dyrket i 24 timer tilføje de optimale enheder af beta galactosidase og inkubere natten over ved 37 grader Celsius, bestemme 2'FL titer som tidligere beskrevet.Først skal du starte en 25 milliliter kultur af en 2'FL producerer stamme. Når stammen er induceret i midten af log fase, inkubere kulturen ved 37 grader Celsius i 24 timer. Dernæst vaccinere en E.coli BL21 kultur i LB medier.Dyrk det til midten af log fase ved 37 grader Celsius derefter tilføje 15 milliliter af denne kultur til 24 timers 2'FL kultur. Inkubere ved 37 grader Celsius i tre timer. Derefter bestemme 2'FL titer som tidligere beskrevet.Til at begynde, starte en 25 milliliter kultur af en 2'FL producerer stamme. Når stammen er induceret i midten af log fase, inkubere kulturen ved 37 grader celsius i 24 timer. Tilsæt to bind af 100% ethanol til kulturen og ryst godt.Inkubere ved 37 grader Celsius i fire timer. Derefter centrifuge suspensionen ved 900 gange g i 15 minutter. Saml supernatant og inkubere natten over ved fire grader Celsius at udfælde laktose.Før opløsningen gennem filterpapir for at fjerne den udfældede laktose. Filtratet, der indeholder cellen, lyser, opsamls, og 2'FL-titeren bestemmes som tidligere beskrevet. I denne undersøgelse, en høj-throughput strategi anvendes til sammenkobling specifik påvisning af fucosylated modermælk oligosaccharider.Dette opnås ved at bygge hele celle bio-sensorer ved gensplejsning E.Coli, som ved induktion med specifikke glycans, reagere med et fluorescerende signal. Fluorescerende signal under forskellige betingelser for induktion som analyseret på et flow cytometer, viser over en 100 gange stigning i fluorescens med 2'FL bio-sensor i forhold til vektor eneste kontrol eller bio-sensor for 3'FL. Dette viser den høje sammenkædningsspecifikitet af biosensoren.Analysens følsomhed kan bestemmes ved at generere en dosisresponskurve med varierende kulhydratniveauer. Den dynamiske lineære område af 2'FL afsløring, ses at være mellem 40 og 400 mg / liter og grænsen for detektion er fire milligram per liter. Denne analyse kan udføres i løbet af en arbejdsdag som det ses i snap shot målinger af dynamikken i reporter udtryk.Bio-sensing celler kan bruges til at detektere og kvantificere 2'FL fra en manipuleret 2'FL producent stamme ved hjælp af en række strategier for at reducere signal fra udefrakommende laktose, således at signalet læses op ville direkte svarer til 2'FL koncentration. En strategi er at enzymatisk nedbryde laktose ved hjælp af en beta galactosidase, der ikke virker på modificeret laktose. En anden strategi udnyttede ethanol, som ikke kun selektivt udfælder laktose, men også lyser producentcellerne, da cellerlyse er et nødvendigt skridt ned strøm.Endelig er den mest effektive, men tidskrævende metode at pelletere og vaske cellerne før cellelyse for at frigive den intracellulære 2'FL. Når vi etablerer denne metode, vi var i stand til at udvide repertoiret af oligosaccharid mål ved hjælp af forskellige enzymer. I øjeblikket kan vi opdage ni forskellige oligosaccharider, og vi arbejder på mere.Mens optimere denne analyse, bemærkede vi robustheden af vores enzymer tillod os at komme med en teknik, der giver en linkage specifikke læse ud i omkring fem minutter. Selv om ingen af de reagenser, der anvendes her, er særlig farlige, bør de, der anvender denne metode, følge standardprocedurer for biologisk fare og biocontainment, herunder brug af korrekt PV.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøveudtagning og forbehandling af tand emalje carbonat for stabil Carbon og Oxygen isotop analyser

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Hurtig fluorescens-baserede karakterisering af enkelt ekstracellulære vesikler i humant blod med nanopartikler-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Trinvis doseringprotokol for øget overførselstid i label-free impedansbaserede GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...