Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Iowa State University opstarten middelen. VB. werd gedeeltelijk gefinancierd door de NSF Trinect Fellowship en Manley Hoppe hoogleraarschap. T.J.M. werd gedeeltelijk ondersteund door de Karen en Denny Vaughn faculteit Fellowship. De auteurs danken de Iowa State University Stroom Cytometry faciliteit en het W.M. Keck metabolomica onderzoekslaboratorium voor hulp met fluorescentie en LC-MS studies.

1. cel cultuur en inductie voorwaarden
Opmerking: De volgende experimenten, drie stammen worden gebruikt: E. coli BL21 (DE3) met een lege vector, E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcA14 en pET28:green fluorescente proteïne (GFP) en E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcB14 en pET28:GFP. Alle stammen worden gekweekt in Luria Bertani broth (LB) of minimale media met de juiste antibiotica. Bereiden van stamoplossingen van 1.000 x kanamycine (50 mg/m...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

We presenteren een high-throughput strategie voor de koppeling-specifieke detectie van fucosylated menselijke melk oligosacchariden. Dit werd bereikt door het bouwen van hele cel biosensoren door genetisch engineering E. coli die na inductie met specifieke glycanen reageren met een fluorescerende signaal. Het protocol is ook van details over hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een metabolisch gemanipuleerde bacteriële stam.
<p class="jove_content...

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn lactose-afgeleide oligosacharide, meestal bestaande uit drie tot acht suiker monomeren. Ze hebben een lactose (Gal-β1, 4-Glc) verminderen beëindigen en verder door glycosidic links zijn langwerpig (β-1,3 - of β-1,6-) glucose (Glc), galactose (Gal) of N-acetylglucosamine (GlcNAc). Daarnaast fucose (Fuc, α-1,2 - of α-1,3-) of sialic zuur (Sia of NeuAc, α-2,3 - of α-2,6-) residuen worden vaak toegevoegd1.
Huidige analyse van de oligosacchariden en andere koolhydraten in doorvoer en reikwijdte begrensd door de behoefte aan spectrometrische chromatografische/massa (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, dat ongeveer duren kan een uur per monster, niet te vergeten de noodzaak voor dure apparatuur, gespecialiseerde kolommen en Derivatiserings agenten en expertise over de werking van deze apparatuur8. Oligosaccharide verbanden zijn bijzonder moeilijk te bepalen, waarvoor geavanceerde MS9,10 of11technieken nucleaire magnetische resonantie (NMR). Snelle optimalisatie van synthese van deze oligosachariden is dus beperkt door de doorvoer van deze trage analytische stap.
In deze studie, tonen we koppeling-specifieke detectie van fucosylated trisaccharide lactose gebaseerde zorgorganisaties, gericht op 2'-fucosyllactose (2'-FL) thats de overvloedigste HMO in menselijke melk, met behulp van een genetisch gecodeerde Escherichia coli hele cel biosensor met een limiet van detectie op 4 mg/L. Een belangrijk kenmerk van deze biosensor is haar vermogen om te onderscheiden tussen isomere trisacharide. De ontwerpprincipe is gebaseerd op de expressie van specifieke fucosidases in E. coli die bevrijden lactose van zorgorganisaties, waarvan de aanwezigheid wordt gedetecteerd door het lac -operon, die op zijn beurt een fluorescent signaal genereert. Dit bereiken we door het bouwen van een twee-plasmide-systeem, een herbergen de koppelings-specifieke fucosidase en anderzijds een fluorescerende verslaggever eiwit. Dit platform biosensor is geschikt voor high-throughput screening door stroom cytometry of micro-afleesapparaat. We tonen ook het gebruik van de biosensor in 2'-FL geproduceerd door een gemanipuleerde stam12te kwantificeren. Binnen deze studie presenteren we ook drie strategieën op selectieve verwijdering van lactose die leiden valse positieve signaal van de biosensor tot kan, gezien het feit dat de gemanipuleerde producent stam wordt verbouwd op lactose.
Samen genomen, de genetisch gecodeerde biosensoren laten detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een koppeling-specifieke wijze, die moeilijk zelfs met is chromatografische, MS of NMR technieken. Vanwege de hoge doorvoer en gebruiksgemak moet deze methode wijdverbreide toepassingen in de metabole engineering en synthese van zorgorganisaties.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn onderdelen van de complexe koolhydraten van menselijke moedermelk die overvloedig voordelen op de gezondheid van de baby vertonen. Optimalisatie van hun biotechnologische synthese wordt echter beperkt door de relatief lage doorvoer van detectie en kwantificering van monosaccharide en verbanden. Conventionele technieken van glycan analyse omvatten chromatografische/Massaspectrometrische methoden met doorvoer over de volgorde van honderden monsters per dag zonder automatisering. Wij tonen hier, een genetisch gecodeerde bacteriële biosensor voor de high-throughput, koppelings-specifieke detectie en kwantificering van de fucosylated HMO structuren, 2'-fucosyllactose en 3-fucosyllactose, die we via heterologe bereikt expressie van fucosidases. Als de aanwezigheid van lactose in melk of in biotechnologische processen tot valse positieven leiden kan, tonen we ook de vermindering van signaal uit lactose met behulp van verschillende strategieën. Vanwege de hoge doorvoer van deze techniek, kunnen veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters vehiculumcontrolegroep worden parallel in een kwestie van uren, waardoor voor de optimalisatie van de HMO verwerkende industrie.

We ontwierpen een hele cel biosensor specifiek voor 2'-FL die kan worden gebruikt in combinatie met de biotechnologische productie van de oligosaccharide. Dit is gebaseerd op de specifieke enzymatische splitsing van wijzigen terminal suikers genereren van lactose en daarmee activering van het lac -operon, leidt tot expressie van een verslaggever fluorescent proteïne onder een lactose afleidbare promotor, in verhouding staan tot de hoeveelheid 2'-FL. Om aan te tonen van de specif...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een aantal belangrijke vragen die betrokken zijn bij de productie van menselijke melk oligosaccharides. Ten eerste, hoeveel van het product heb ik? En ten tweede, wat is de specifieke koolhydraat koppeling?Het doel hier is om het proces van kwantificeren en karakteriseren van deze menselijke melk oligosadariden te vereenvoudigen en te versnellen. Deze methode heeft twee voordelen ten opzichte van de huidige stand van de techniek. Ten eerste is het vatbaar voor high-throughput screening.Dus, je je voorstellen dat je duizenden verschillende omstandigheden test of misschien zelfs een bibliotheek van syntheseenzymen in één dag met behulp van deze techniek. Ook maakt het gebruik van de unieke substraat specificiteit die de natuur heeft ontwikkeld in enzymen om ons informatie over de koolhydraat koppeling van die oligosadariden. Wij geloven dat deze methode de productie van menselijke melk oligosaccharides kan verbeteren, wat op zijn beurt kan leiden tot een betere kwaliteit zuigelingenvoeding die menselijke moedermelk beter nabootst en helpt de kloof tussen borstvoeding en formulegevoede baby's te dichten.De discretie van de gebruiker wordt aanbevolen bij de beslissing welke methode te gebruiken voor lactose-verwijdering op basis van kosten, doorvoer en beschikbaarheid van apparatuur. Zorg moet worden genomen om een optimale lactose-verwijdering te garanderen. De dag voor het experiment, zaad 5 milliliter LB medium aangevuld met kanamycine en carbenicilline uit een verse bacteriële kolonie met behulp van steriele technieken.Broed alle culturen 's nachts bij 37 graden Celsius met agitatie. De volgende dag, breng 50 microliters van een nachtelijke cultuur in vijf milliliter verse LB M9 media met kanamycine en carbenicilline. Incubeer bij 37 graden Celsius met ononderbroken schuddend tot de cultuur od600 tussen nul punt vijf en nul punt zeven heeft bereikt.Ten eerste, breng de nachtelijke culturen in een punt vijf milliliter buizen en centrifuge op 12, 500 keer g voor een minuut. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 500 microliter van 1x PBS om een enkele celsuspensie voor te bereiden. Breng de eencellige suspensie over naar faxbuizen.Gebruik een stroomcytometer om GFP op te wekken en FITC-fluorescentieniveaus te verzamelen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om een kalibratiecurve te maken, maak acht tot 10 verdunningen van de standaard 2'FL in het bereik tussen nul en 2500 milligram per liter. Kweek de 2'FL bio-sensing cellen en induceren ze met de standaard verdunningen zoals beschreven in het tekstprotocol.Start een cultuur van een 2'FL produceren stam in vijf milliliter van LB media en groeien 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag, subcultuur op 1%in 250 milliliter van bereide minimale media en voeg glycerol aan een uiteindelijke concentratie van 10 gram per liter. Incubeer bij 37 graden Celsius tot de cultuur bereikt en OD600 tussen nul punt vijf en nul punt zeven.Voeg vervolgens IPTG toe aan een uiteindelijke concentratie van nulpunt vijf millimolar en lactose tot een uiteindelijke concentratie van twee gram per liter. Incubeer bij 37 graden Celsius met continu schudden voor 24 uur. De volgende dag, breng de nachtcultuur naar steriele 50 milliliter buizen en centrifuge op 900 keer g gedurende 15 minuten.Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in gedeïmiseerd water. Herhaal deze was drie keer om eventuele resterende lactose te verwijderen. Daarna, opnieuw opschorten de pellet in vijf milliliter van gedeïsized water.Plaats de cellen op ijs en gebruik een sonicator op 30% vermogen in 30 seconden pulsen om de cel suspensie lyse. Centrifugeren de lysed cellen op 2.000 keer g gedurende 25 minuten. Verwijder de supernatant en geef het door een steriel filter.Bewaar de gefilterde supernatant op vier graden Celsius tot het klaar is om te analyseren. Vervolgens inenten een cultuur van 2'FL bio-sensing cellen. In het midden van de logfase, induceren de cellen met de cel lysaat bij concentraties gelijk aan die van die 2'FL gebruikt om de kalibratie curve te maken.Voer de kalibratie uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer hierna de monsters uit op een stroomcytometer. Genereer een dosisresponscurve door de fluorescentieoutput in kaart te brengen tegen de oligosaccharideconcentratie en de reactie van de normen op het cellysaat te vergelijken.Los fl alfalyseerde bètagalactosidase eerst op tot 1.000 eenheden per milliliter in één millimolar magnesiumchloride. Om de optimale concentratie van enzym nodig te stellen, kweekt u een entmateriaal van 2'FL bio-sensing cellen en in het midden van de logfase, induceren met lactose en 2'FL. Voeg tot 100 microliterculturen variabele hoeveelheden bètagalactosidase toe tot 12 eenheden.Laat de culturen 's nachts groeien op 37 graden Celsius met continu schudden. Meet de fluorescentie zoals beschreven in het tekstprotocol en bereken de optimale enzymeenheden die nodig zijn door de minimale enzymconcentratie te bepalen om de gewenste demping van het signaal te bereiken. Aan 2'FL producerende cellen geteeld voor 24 uur voeg de optimale eenheden van beta galactosidase en incubaal 's nachts bij 37 graden Celsius, bepalen de 2'FL titre zoals eerder beschreven.Ten eerste, start een 25 milliliter cultuur van een 2'FL producerende stam. Zodra de stam wordt geïnduceerd in het midden van de log fase, inculuberen de cultuur op 37 graden Celsius voor 24 uur. Vervolgens inenten een E.coli BL21 cultuur in LB media.Kweek het tot halverwege de logfase bij 37 graden Celsius en voeg vervolgens 15 milliliter van deze cultuur toe aan de 24-uurs 2'FL-cultuur. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende drie uur. Bepaal vervolgens de 2'FL titre zoals eerder beschreven.Om te beginnen, start een 25 milliliter cultuur van een 2'FL producerende stam. Zodra de stam wordt geïnduceerd in het midden van de log fase, inculuberen de cultuur op 37 graden Celsius voor 24 uur. Voeg twee volumes van 100% ethanol toe aan de cultuur en schud goed.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende vier uur. Dan, centrifuge de schorsing op 900 keer g gedurende 15 minuten. Verzamel de supernatant en incubeer 's nachts op vier graden Celsius om de lactose neer te halen.Geef de oplossing door middel van filterpapier om de neergeslagen lactose te verwijderen. Verzamel het filtraat dat het cellysaat bevat en bepaal de 2'FL titer zoals eerder beschreven. In deze studie wordt een strategie voor hoge doorvoer gebruikt voor de koppelingsspecifieke detectie van gefusyleerde menselijke melkoliigosadariden.Dit wordt bereikt door het bouwen van hele cel bio-sensoren door genetisch-engineering E.Coli die, bij inductie met specifieke glycanen, reageren met een fluorescerend signaal. Het fluorescerende signaal onder verschillende omstandigheden van inductie zoals geanalyseerd op een stroomcytometer, toont meer dan een 100 voudige toename van fluorescentie met de 2'FL bio-sensor in vergelijking met de vector alleen controle of de bio-sensor voor 3'FL. Dit toont de hoge koppeling specificiteit van de bio-sensor.De gevoeligheid van de test kan worden bepaald door het genereren van een dosis respons curve met verschillende koolhydraten niveaus. Het dynamische lineaire bereik van 2'FL detectie, wordt gezien als tussen de 40 en 400 milligram per liter en de limiet van detectie is vier milligram per liter. Deze test kan worden uitgevoerd in de loop van een werkdag, zoals te zien in de snap shot metingen van de dynamiek van de verslaggever expressie.De bio-sensing cellen kunnen worden gebruikt om 2'FL van een gemanipuleerde 2'FL-producentenstam op te sporen en te kwantificeren met behulp van een aantal strategieën om het signaal van exogene lactose te verminderen, zodat het uitgelezen signaal direct overeenkomt met de 2'FL-concentratie. Een strategie is om enzymatisch degraderen van de lactose met behulp van een beta galactosidase die niet werkt op gemodificeerde lactose. Een andere strategie gebruikt ethanol die niet alleen selectief lactose neerslaat, maar ook de producentencellen lyses aangezien de cellen lysis een noodzakelijke stap onderaan stroom is.Ten slotte is de meest effectieve, maar tijdrovende methode om de cellen te pelleteren en te wassen voorafgaand aan cellyse om de intracellulaire 2'FL vrij te geven. Zodra we deze methode vast te stellen, waren we in staat om het repertoire van oligosaccharide doelen uit te breiden met behulp van verschillende enzymen. Op dit moment kunnen we negen verschillende oligosadariden detecteren en werken we aan meer.Terwijl het optimaliseren van deze test, merkten we de robuustheid van onze enzymen konden we komen met een techniek die een koppeling specifieke uitgelezen geeft in ongeveer vijf minuten. Hoewel geen van de hier gebruikte reagentia bijzonder gevaarlijk is, moeten degenen die deze methode gebruiken standaard biohazard- en biocontainmentprocedures volgen, waaronder het dragen van de juiste beschermingsmiddelen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Monstername en voorbehandeling van tandglazuur carbonaat voor stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...