Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’Iowa State University fonds de démarrage. F.E. a été partiellement financé par la NSF Trinect bourse et Manley Hoppe professorat. T a été partiellement prises en charge par le Karen et Denny Vaughn faculté Fellowship. Les auteurs remercient l’Iowa State University Flow Cytometry Facility et le laboratoire de recherche de métabolomique W.M. Keck d’assistance avec la fluorescence et SM-études.

1. cellules des conditions de culture et de l’induction
Remarque : Dans les expériences suivantes, trois souches sont utilisés : e. coli BL21 (DE3) avec un vecteur vide, e. coli BL21 (DE3) avec plasmides pAfcA14 et pET28:green protéine fluorescente (GFP) et e. coli BL21 (DE3) avec des plasmides pAfcB14 et pET28:GFP. Toutes les souches sont cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) ou un milieu minimal avec des antibiotiques appropriés...

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Nous présentons une stratégie haut-débit pour la détection de liaison spécifique de fucosylées oligosaccharides de lait maternel. Cela a été accompli en construisant des biocapteurs à germes entiers par génie génétique e. coli , qui, après induction par glycanes spécifiques, répondre avec un signal fluorescent. Le protocole détaille également sur comment le biocapteur peut être utilisé pour détecter et quantifier les HMO dans une souche bactérienne métaboliquement modifiée.
<p class="j...

Oligosaccharides de lait maternel (HMO) sont des oligosaccharides dérivé de lactose, généralement composée de trois à huit monomères de sucre. Ils ont une réduction de lactose (Gal-β1, 4-Glc) fin et sont plus allongées par des liaisons glycosidiques (β-1, 3 - ou β-1, 6-) de glucose (Glc), galactose (Gal) ou le N-acétylglucosamine (GlcNAc). En outre, fucose (Fuc, α-1, 2 - ou α-1, 3-) ou l’acide sialique (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2, 6-) résidus sont souvent ajoutés1.
Analyse actuelle des oligosaccharides et des autres glucides est limité en débit et en portée par la nécessité d’une chromatographie/spectrométrie de masse (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, qui peut prendre environ une heure par exemple, pour ne pas mentionner la nécessité d’équipements coûteux, colonnes spécialisées et agents de dérivatisation et expertise sur le fonctionnement de cet équipement8. Liens d’oligosaccharides sont particulièrement difficiles à déterminer, nécessitant des avancées MS9,10 ou de techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN)11. Optimisation rapide de la synthèse de ces oligosaccharides est donc limitée par le débit de cette étape analytique lente.
Dans cette étude, nous démontrons la liaison spécifique détection fucosylées trisaccharide ossi à base de lactose, en se concentrant sur la 2'-fucosyllactose (2'-FL) qui est le plus abondant HMO dans le lait maternel, en utilisant un génétiquement encodé Escherichia coli cellules entières biocapteur avec une limite de détection à 4 mg/L. Une caractéristique importante de ce biocapteur est sa capacité à distinguer les isomères trisaccharides. Le principe de conception est basé sur l’expression des fucosidases spécifiques chez e. coli qui libèrent le lactose de HMO, dont la présence est détectée par l’opéron lac , qui à son tour génère un signal fluorescent. Nous y parviendrons en construisant un système de deux-plasmide, on nourrissait la fucosidase de liaison spécifique et l’autre une protéine fluorescente journaliste. Cette plateforme de biocapteurs est adaptée pour le criblage à haut débit par cytométrie en flux ou micro-lecteur. Nous démontrons également l’utilisation du biocapteur pour quantifier la 2'-FL produite par une souche modifiée12. Dans cette étude, nous présentons trois stratégies sur l’élimination sélective de lactose qui peut entraîner des faux signaux positif depuis le biocapteur, étant donné que la souche producteur machiné est cultivée sur le lactose.
Pris ensemble, les biocapteurs codés génétiquement nous permettent de détecter et quantifier les HMO dans une manière de liaison spécifique, qui est difficile même avec chromatographique, MS ou NMR techniques. En raison de son haut rendement et facilité d’utilisation, cette méthode devrait avoir de nombreuses utilisations dans l’ingénierie métabolique et la synthèse des HMO.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Le lait humain oligosaccharides (HMO) sont les composants de hydrate de carbone complexe du lait maternel humain qui présentent de nombreux avantages sur la santé infantile. Cependant, l’optimisation de leur synthèse biotechnologique est limitée par le débit relativement faible de détection et de quantification des monosaccharides et des liens. Les techniques classiques d’analyse glycane comprennent des méthodes chromatographiques /-spectrométrie de masse avec le débit de l’ordre de plusieurs centaines d’échantillons par jour sans automation. Nous démontrons ici, un biocapteur bactérien génétiquement codé de haut-débit, assemblage spécifique de détection et de quantification des structures fucosylées HMO, 2'-fucosyllactose et 3-fucosyllactose, qui nous atteint via hétérologue expression de fucosidases. Comme la présence de lactose dans le lait ou dans les procédés biotechnologiques pourrait conduire à de faux positifs, nous démontrons également la réduction du signal du lactose en utilisant des stratégies différentes. En raison du débit élevé de cette technique, beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur pourraient être dosés en parallèle en quelques heures, ce qui permet l’optimisation de la fabrication de HMO.

Nous avons conçu un biocapteur à germes entiers spécifique à 2'-FL qui peut être utilisé en conjonction avec la production biotechnologique de l’oligosaccharide. Celle-ci repose sur le clivage enzymatique spécifique de modifier des sucres terminaux générant au lactose et donc l’activation de l’opéron lac , conduisant à l’expression d’une protéine fluorescente journaliste sous un promoteur inductible au lactose, dans proportionnelle à la quantité de 2'-FL. ...

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Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.

Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Cette méthode peut aider à répondre à plusieurs questions clés impliquées dans la production d’oligosaccharides de lait humain. Tout d’abord, quelle quantité de produit ai-je? Et deuxièmement, quel est le lien spécifique hydrate de carbone?L’objectif ici est de simplifier et d’accélérer le processus de quantification et de caractérisation de ces oligosaccharides de lait humain. Cette méthode présente deux avantages par rapport à l’état actuel de l’art. Tout d’abord, il est agréable à un criblage à haut débit.Ainsi, vous pouvez imaginer tester des milliers de conditions différentes ou peut-être même une bibliothèque d’enzymes de synthèse en une seule journée en utilisant cette technique. En outre, il utilise la spécificité unique du substrat que la nature a évolué en enzymes pour nous donner des informations sur le lien glucides de ces oligosaccharides. Nous croyons que cette méthode peut améliorer la production d’oligosaccharides de lait humain, ce qui peut à son tour conduire à des préparations pour nourrissons de meilleure qualité qui imitent plus étroitement le lait maternel humain et aident à combler l’écart entre les bébés allaités et nourris au lait maternisé.La discrétion de l’utilisateur est recommandée pour décider quelle méthode utiliser pour l’élimination du lactose en fonction du coût, du débit et de la disponibilité de l’équipement. Il faut prendre soin d’assurer une élimination optimale du lactose. La veille de l’expérience, les graines de 5 millilitres de LB moyen complété par la kanamycine et la carbenicilline d’une colonie bactérienne fraîche en utilisant des techniques stériles.Incubez toutes les cultures du jour au lendemain à 37 degrés Celsius avec agitation. Le lendemain, transférez 50 microlitres d’une culture nocturne en cinq millilitres de médias LB M9 frais avec kanamycine et carbenicilline. Incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses continues jusqu’à ce que la culture a atteint un OD600 entre zéro point cinq et zéro point sept.Tout d’abord, transférer les cultures de nuit en un seul point cinq tubes millilitres et centrifugeuse à 12, 500 fois g pendant une minute. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en 500 microlitres de 1x PBS pour préparer une suspension à cellule unique. Transférer la suspension d’une seule cellule dans des tubes à télécopieur.Utilisez un cytomètre d’écoulement pour exciter GFP et recueillir les niveaux de fluorescence FITC tels que décrits dans le protocole de texte. Pour faire une courbe d’étalonnage, faire huit à 10 dilutions de la norme 2'FL dans la gamme entre zéro et 2500 milligrammes par litre. Culturez les cellules de biodétection 2'FL et induisez-les avec les dilutions standard décrites dans le protocole de texte.Commencez une culture d’une souche de production de 2'FL en cinq millilitres de médias LB et cultivez-la du jour au lendemain à 37 degrés Celsius. Le lendemain, sous-culture à 1% dans 250 millilitres de médias minimaux préparés et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10 grammes par litre. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la culture atteint et OD600 entre zéro point cinq et zéro point sept.Ajouter ensuite l’IPTG à une concentration finale de zéro point cinq millimolaire et lactose à une concentration finale de deux grammes par litre. Incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses continues pendant 24 heures. Le lendemain, transférez la culture de la nuit dans des tubes stériles de 50 millilitres et une centrifugeuse à 900 fois g pendant 15 minutes.Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille dans de l’eau déionisée. Répétez ce lavage trois fois pour éliminer tout lactose résiduel. Après cela, suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres d’eau déionisée.Placez les cellules sur la glace et utilisez un sonicateur à 30% de puissance en impulsions de 30 secondes pour lyser la suspension cellulaire. Centrifugeuse les cellules lysées à 2000 fois g pendant 25 minutes. Retirez le surnatant et passez-le à travers un filtre stérile.Conserver le surnatant filtré à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à analyser. Ensuite, inoculer une culture de cellules de biodétection 2'FL. À la phase médiane, induire les cellules avec la cellule lysate à des concentrations équivalentes à celles de ces 2'FL utilisé pour faire la courbe d’étalonnage.Effectuez l’étalonnage tel qu’il est décrit dans le protocole de texte. Après cela, exécuter les échantillons sur un cytomètre d’écoulement. Générer une courbe de réponse à la dose en traçant la sortie de fluorescence par rapport à la concentration d’oligosaccharide et comparer la réponse des normes au lysate cellulaire.Tout d’abord, dissoudre fl alphalyzed bêta galactosidase à 1000 unités par millilitre dans un chlorure de magnésium millimolaire. Pour déterminer la concentration optimale d’enzymes nécessaires, cultivez un inoculum de cellules de biodétection 2'FL et à la phase médiane, induire avec du lactose et 2'FL. À 100 cultures de microlitres, ajoutez des quantités variables de bêta galactosidase jusqu’à 12 unités.Laissez les cultures se développer du jour au lendemain à 37 degrés Celsius avec des secousses continues. Mesurer la fluorescence telle que décrite dans le protocole textuel et calculer les unités optimales d’enzymes nécessaires en déterminant la concentration minimale d’enzymes pour atteindre l’atténuation souhaitée du signal. À 2'FL cellules productrices cultivées pendant 24 heures ajouter les unités optimales de bêta galactosidase et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius, déterminer le titre 2'FL comme décrit précédemment.Tout d’abord, commencer une culture de 25 millilitres d’une souche productrice de 2'FL. Une fois que la souche est induite à la phase médiane, incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, inoculer une culture E.coli BL21 dans les médias LB.Poussez-le à mi-phase de notation à 37 degrés Celsius puis ajoutez 15 millilitres de cette culture à la culture 24 heures 2'FL. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, déterminez le titre 2'FL tel que décrit précédemment.Pour commencer, commencez une culture de 25 millilitres d’une souche productrice de 2'FL. Une fois que la souche est induite à la phase médiane, incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajouter deux volumes de 100% d’éthanol à la culture et bien trembler.Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, centrifugez la suspension à 900 fois g pendant 15 minutes. Recueillir le supernatant et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius pour précipiter le lactose.Passez la solution à travers du papier filtre pour éliminer le lactose précipité. Recueillir le filtrate qui contient la cellule lysate et de déterminer le titre 2'FL comme décrit précédemment. Dans cette étude, une stratégie à haut débit est utilisée pour la détection spécifique de liaison des oligosaccharides fucosylated de lait humain.Ceci est accompli en construisant des bio-capteurs cellulaires entiers en génie génétique E.Coli qui, lors de l’induction avec des glycanes spécifiques, répondent par un signal fluorescent. Le signal fluorescent dans différentes conditions d’induction tel qu’analysé sur un cytomètre d’écoulement, montre plus d’une augmentation de 100 fois de la fluorescence avec le bio-capteur 2'FL par rapport au seul vecteur de contrôle ou le bio-capteur pour 3'FL. Cela montre la spécificité de liaison élevée du bio-capteur.La sensibilité de l’essai peut être déterminée en générant une courbe de réponse de dose avec des niveaux variables d’hydrate de carbone. La plage linéaire dynamique de détection 2'FL, est considérée comme se situe entre 40 et 400 milligrammes par litre et la limite de détection est de quatre milligrammes par litre. Cet essai peut être effectué au cours d’une journée de travail comme on le voit dans les mesures snap shot de la dynamique de l’expression des journalistes.Les cellules de biodétection peuvent être utilisées pour détecter et quantifier 2'FL à partir d’une souche de producteur de 2'FL d’ingénierie utilisant un certain nombre de stratégies pour réduire le signal du lactose exogène de sorte que le signal lu correspondrait directement à la concentration de 2'FL. Une stratégie consiste à dégrader enzymatiquement le lactose à l’aide d’une bêta galactosidase qui n’agit pas sur le lactose modifié. Une autre stratégie a utilisé l’éthanol qui non seulement précipite sélectivement le lactose, mais lyse également les cellules productrices puisque la lyse des cellules est une étape nécessaire vers le bas du cours d’eau.Enfin, la méthode la plus efficace mais la plus longue est de pelleter et laver les cellules avant la lyse cellulaire pour libérer l’intracellulaire 2'FL. Une fois que nous avons établi cette méthode, nous avons été en mesure d’élargir le répertoire des cibles oligosaccharide en utilisant différentes enzymes. Actuellement, nous pouvons détecter neuf oligosaccharides différents et nous travaillons sur d’autres.Tout en optimisant cet essai, nous avons remarqué que la robustesse de nos enzymes nous a permis de trouver une technique qui donne un lien spécifique lu en environ cinq minutes. Bien qu’aucun des reagents utilisés ici ne soit particulièrement dangereux, ceux qui utilisent cette méthode devraient suivre des procédures standard de biodanger et de bioconférence, y compris le port d’EPI approprié.

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Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...