Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי איווה המדינה אוניברסיטת הפעלה כספים. הקיבולות נשמר מומן בחלקו על ידי ה-NSF Trinect אחוות מנלי Hoppe פרופסורה. T.J.M. מומן בחלקו על ידי קרן דני מלגת הפקולטה ווהן. המחברים תודה איווה המדינה אוניברסיטת Flow Cytometry המתקן את מעבדת המחקר גליקומיקס קק W.M. לקבלת סיוע עם פלורסצנטיות ולימודי LC-MS.

1. תרבות התא ותנאי אינדוקציה
הערה: בניסויים הבאים, שלושה זנים משמשים: e. coli BL21 (DE3) עם וקטור ריק, e. coli BL21 (DE3) עם פלסמידים pAfcA14 ו- pET28:green חלבון פלואורסצנטי (GFP), e. coli BL21 (DE3) עם פלסמידים pAfcB14 ו- pET28:GFP. כל הזנים גדלים מרק לוריא-Bertani (LB) או תקשורתי מזערי באנטיביוטיקה ...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

אנו מציגים אסטרטגיה תפוקה גבוהה לאיתור ספציפי הצמדה fucosylated בחלב oligosaccharides. דבר זה הושג על ידי בניית התא כולו ביולוגיים באמצעות הנדסה גנטית e. coli אשר על אינדוקציה עם glycans מסוימים מגיבים אות ניאון. הפרוטוקול מפרט גם על איך החיישן יכול לשמש כדי לזהות ולכמת קופות החולים בזן חיידקי סמויה מהו?...

Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם לקטוז, נגזר oligosaccharides, הכוללת בדרך כלל 3 עד 8 סוכר מונומרים. הם יש לקטוז (גל-β1, 4-Glc) הפחתת בסוף, הם עוד יותר מאורך על-ידי קישורים glycosidic (β-1, 3 - או β-1, 6-) (Glc) גלוקוז, גלקטוז (Gal) או N-acetylglucosamine (GlcNAc). בנוסף, fucose (Fuc, α-1, 2 - או α-1, 3-) או חומצה sialic (Sia או NeuAc, α-2, 3 - או α-2, 6-) שאריות לעיתים קרובות נוספות1.
הניתוח הנוכחי של oligosaccharides ופחמימות אחרות מוגבל התפוקה ואת היקף על ידי הצורך כרומטוגרפי/מסה spectrometric (MS) טכנולוגיה2,3,4,5, 6 , 7, אשר יכול לקחת בערך שעה עבור דגימה, שלא לדבר על הצורך של ציוד יקר, עמודות מיוחדים סוכנים derivatizing, ואת המומחיות על המבצע של ציוד זה8. פחמימה # מיון הפחמימות קישורים קשים במיוחד לקבוע, הדורשים MS מתקדם9,10 או טכניקות תהודה מגנטית גרעינית (NMR)11. אופטימיזציה מהירה של סינתזה של אלה oligosaccharides ובכך מוגבל על ידי התפוקה של שלב זה אנליטי איטי.
במחקר זה, נדגים זיהוי ספציפי הצמדה של fucosylated trisaccharide קופות מבוססות-לקטוז, התמקדות 2'-fucosyllactose (2'-פל) הנמצא שקמתי הנפוץ ביותר בחלב, באמצעות מקודדים גנטית Escherichia coli כל התא ביוסנסור עם מגבלה של זיהוי-4 מ ג/ל' תכונה חשובה של ביוסנסור זו, היא יכולתה להבחין בין isomeric trisaccharides. עקרון העיצוב מבוסס על הביטוי של fucosidases ספציפי ב e. coli זה לשחרר לקטוז של קופות חולים, הנוכחות של אשר הוא זוהה על ידי הלקטוז, אשר בתורו מפיק אות ניאון . נוכל להשיג זאת על ידי בניית מערכת דו-פלסמיד, אחד מסתיר את fucosidase ספציפיים הצמדה והשני חלבון כתב פלורסנט. הפלטפורמה ביוסנסור מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה על-ידי cytometry זרימה או מיקרו-plate הקורא. אנחנו גם להוכיח את הניצול של החיישן ב לכימות 2'-FL המיוצר על ידי זן מהונדסים12. במסגרת מחקר זה, אנו מציגים גם שלוש אסטרטגיות על הסרה סלקטיבית של לקטוז שיכול לגרום אות חיובי כוזב החיישן, בהתחשב בכך המתח מפיק מהונדסים התרגלתי לקטוז.
יחדיו ביולוגיים מקודדים גנטית מאפשרים לנו לזהות ולכמת קופות החולים באופן ספציפי הצמדה, אשר קשה אפילו עם כרומטוגרפי, MS, או NMR טכניקות. בשל תפוקה גבוהה שלה קלות שימוש, שיטה זו צריך יישומים נפוצים הנדסה מטבולית, סינתזה של קופות החולים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם פחמימות מורכבות מרכיבים של חלב אם אנושי כי התערוכה בשפע הטבות על בריאות התינוק. עם זאת, אופטימיזציה של סינתזה ביוטכנולוגי שלהם מוגבל על ידי את התפוקה נמוכה יחסית של זיהוי, כימות של חד-סוכר למוטות וחיבורים. טכניקות שגרתיות של ניתוח glycan כוללות שיטות כרומטוגרפי/מסה-spectrometric עם תפוקה של הסדר מאות דוגמאות ליום ללא אוטומציה. נדגים כאן, של ביוסנסור חיידקי מקודדים גנטית תפוקה גבוהה, הצמדה ספציפי זיהוי, כימות של מבנים fucosylated קופות החולים, 2'-fucosyllactose 3-fucosyllactose, אשר השגנו ויה heterologous ביטוי של fucosidases. משום הנוכחות של לקטוז בחלב או בתהליכים הביו-טכנולוגיה עלול לגרום תוצאות חיוביות שגויות, אנחנו גם להוכיח ההפחתה של האות מ לקטוז באמצעות אסטרטגיות שונות. בשל התפוקה הגבוהה של טכניקה זו, תנאי ריאקציה או ביוריאקטור פרמטרים רבים יכול להיות לבדיקה במקביל תוך מספר שעות, המאפשרות אופטימיזציה של קופות החולים הייצור.

תיכננו ביוסנסור התא כולו ספיציפית 2'-FL שיכול לשמש בשילוב עם ייצור ביוטכנולוגי פחמימה # מיון הפחמימות. זה מסתמך על המחשוף אנזימטי ספציפי של שינוי מסוף סוכרים ליצירת לקטוז וע י הפעלת אופרון הלקטוז, המוביל לביטוי של חלבון פלואורסצנטי כתב תחת מקדם inducible לקטוז, ב proportion כמו...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

נתאר כאן את כימות של fucosylated חלב oligosaccharides (קופות החולים) באמצעות ביוסנסור תאים שלמים וזיהוי תפוקה גבוהה. גם נדגים כאן, את העיבוד של פלטפורמה זו לקראת ניתוח זנים לייצור קופות החולים, תוך התמקדות בשיפור את האות לרעש יחס.

ניתוח של האדם Fucosylated Trisaccharides חלב בהקשר ביוטכנולוגי באמצעות גנטית מקודד ביולוגיים

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על מספר שאלות מרכזיות המעורבות בייצור אוליגוסכרידים חלב אנושי. ראשית, כמה מהמוצר יש לי? ושנית, מהי ההקשר הספציפי לפחמימות?המטרה כאן היא לפשט ולהאיץ את תהליך הכימות והאפיון של אוליגוסכרידים חלב אנושיים אלה. לשיטה זו יש שני יתרונות על פני המצב הנוכחי של האמנות. ראשית, זה נוח להקרנת תפוקה גבוהה.אז, אתה יכול לדמיין בדיקת אלפי תנאים שונים או אולי אפילו ספרייה של אנזימי סינתזה ביום אחד באמצעות טכניקה זו. כמו כן, הוא משתמש בספות המצע הייחודית שהטבע התפתח באנזימים כדי לתת לנו מידע על הקשר הפחמימות של אותם אוליגוסכרידים. אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה לשפר את הייצור של אוליגוסכרידים חלב אנושי, אשר בתורו יכול להוביל נוסחת תינוקות באיכות טובה יותר המחקה באופן הדוק יותר חלב אם אנושי ולעזור לסגור את הפער בין תינוקות יונקים מוזנים נוסחה.שיקול דעת המשתמש מומלץ בעת ההחלטה באיזו שיטה להשתמש להסרת לקטוז בהתבסס על עלות, תפוקה וזמינות ציוד. יש לנקוט בזהירות כדי להבטיח הסרת לקטוז אופטימלית. יום לפני הניסוי, זרעים 5 מיליליטר של מדיום LB בתוספת קנמיצין ו קרבניצילין מושבה חיידקית טרייה באמצעות טכניקות סטריליות.דגירה כל התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה. למחרת, להעביר 50 microliters של תרבות לילה לחמישה מיליליטר של מדיה LB M9 טרי עם קנמיצין ו קרבניצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמשכות עד התרבות הגיעה OD600 בין נקודת אפס חמש ואפס נקודה שבע.ראשית, להעביר את תרבויות הלילה לנקודה אחת חמש צינורות מיליליטר וצנטריפוגה ב 12, 500 פעמים g לדקה אחת. להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters של 1x PBS להכין השעיה תא יחיד. העבר את ההשעיה של תא יחיד לצינורות פקס.השתמש בציטומטר זרימה כדי לרגש GFP ולאסוף רמות פלואורסצנטיות FITC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי ליצור עקומת כיול, בצע 8 עד 10 דילולים של ה- 2'FL הסטנדרטי בטווח שבין אפס ל- 2500 מיליגרם לליטר. תרבות תאי חישה ביולוגית 2'FL ולהשרות אותם עם דילול סטנדרטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.התחל תרבות של זן ייצור 2'FL בחמישה מיליליטר של מדיה LB ולהגדיל אותו בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, תת תרבות ב 1%in 250 מיליליטר של מדיה מינימלית מוכנה ולהוסיף גליצרול לריכוז סופי של 10 גרם לליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד התרבות מגיעה ו OD600 בין נקודת האפס חמש ונקודת אפס שבע.לאחר מכן מוסיפים IPTG לריכוז סופי של נקודת אפס חמש מילימולר ולקטוז לריכוז סופי של שני גרם לליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות רצופות במשך 24 שעות. למחרת, להעביר את תרבות הלילה סטרילי 50 צינורות מיליליטר צנטריפוגה ב 900 פעמים g במשך 15 דקות.השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור במים דה-מיוניים. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים כדי להסיר כל שאריות לקטוז. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מים deionized.מניחים את התאים על קרח ולהשתמש sonicator ב 30% כוח ב 30 פולסים השני כדי lyse ההשעיה התא. צנטריפוגה התאים lysed ב 2, 000 פעמים גרם במשך 25 דקות. הסר את העל-טבעי והעביר אותו דרך מסנן סטרילי.אחסן את העל-טבעי המסונן בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לניתוח. לאחר מכן, לחסן תרבות של 2'FL ביו חישה תאים. בשלב אמצע הרישום, לגרום לתאים עם lysate התא בריכוזים שוות ערך לזה של אלה 2'FL המשמש כדי להפוך את עקומת הכיול.בצע את הכיול כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפעל את הדגימות על ציטומטר זרימה. צור עקומת תגובה מינון על ידי התוויית פלט פלואורסצנטיות נגד ריכוז oligosaccharide ולהשוות את התגובה של הסטנדרטים ללייט התא.ראשית, להמיס FL אלפאליזה בטא galactosidase ל 1, 000 יחידות למיליליטר במגנזיום כלוריד מילימולר אחד. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של האנזים הדרוש, לגדל inoculum של 2'FL ביו חישה תאים בשלב באמצע הרישום, לגרום עם לקטוז ו 2'FL. ל-100 תרבויות מיקרוליטר, הוסיפו כמויות משתנות של בטא גלקטוזידאז עד 12 יחידות.תן לתרבויות לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמשכות. למדוד את הפלואורסצנטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולחשב את היחידות האופטימליות של האנזים הדרוש על ידי קביעת ריכוז האנזים המינימלי כדי להשיג את ההטמה הרצויה של אות. כדי 2'FL ייצור תאים גדל במשך 24 שעות להוסיף את היחידות האופטימליות של בטא galactosidase ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לקבוע את 2'FL titre כפי שתואר קודם לכן.ראשית, להתחיל תרבות 25 מיליליטר של זן ייצור 2'FL. ברגע שהזן מושרה בשלב אמצע הרישום, הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, לחסן תרבות E.coli BL21 במדיה LB.הגדל אותו לשלב אמצע הרישום ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 15 מיליליטר של תרבות זו לתרבות 24 שעות ביממה 2'FL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, קבע את הטיטר 2'FL כפי שתואר קודם לכן.כדי להתחיל, להתחיל תרבות 25 מיליליטר של זן ייצור 2'FL. לאחר שהזן מושרה בשלב אמצע הרישום, הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. הוסף שני כרכים של 100% אתנול לתרבות ולנער היטב.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה ב 900 פעמים g במשך 15 דקות. לאסוף את על טבעי דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרז את לקטוז.להעביר את הפתרון באמצעות נייר סינון כדי להסיר את לקטוז זירז. לאסוף את הסינון המכיל את התא lysate ולקבוע את titre 2'FL כפי שתואר קודם לכן. במחקר זה, אסטרטגיה תפוקה גבוהה משמשת לגילוי ספציפי קישור של אוליגוסכרידים חלב אנושי fucosylated.זה מושג על ידי בניית חיישנים ביולוגיים של תא שלם על ידי הנדסה גנטית E.Coli אשר, עם אינדוקציה עם גליקנים ספציפיים, להגיב עם אות פלואורסצנטי. אות הפלואורסצנט בתנאים שונים של אינדוקציה כפי שנותחו על ציטומטר זרימה, מראה מעל 100 פי עלייה פלואורסצנטיות עם 2'FL ביו חיישן לעומת וקטור רק שליטה או ביו-חיישן עבור 3'FL. זה מראה את הספציפיות הגבוהה של הקישור של הביו-חיישן.הרגישות של ההתב"ע יכולה להיקבע על ידי יצירת עקומת תגובה מינון עם רמות פחמימות משתנות. הטווח ליניארי דינמי של זיהוי 2'FL, הוא ראה להיות בין 40 ל 400 מיליגרם לליטר ואת מגבלת הגילוי הוא ארבעה מיליגרם לליטר. חקירה זו יכולה להתבצע במהלך יום עבודה כפי שניתן לראות במדידות הצמד ירה של הדינמיקה של ביטוי הכתב.ניתן להשתמש בתאי הביו-חישה כדי לזהות ולכימת 2'FL מזן מפיק 2'FL מהונדס באמצעות מספר אסטרטגיות להפחתת האות מלקטוז אקסוגני כך שהאות המוקרא יתאים ישירות לריכוז 2'FL. אסטרטגיה אחת היא להשפיל אנזימטית לקטוז באמצעות בטא גלקטוזידאז שאינו פועל על לקטוז שונה. אסטרטגיה נוספת מנוצלת אתנול אשר לא רק מזרז לקטוז באופן סלקטיבי, אלא גם lyses תאי המפיק מאז תות תאים הוא צעד הכרחי במורד הזרם.לבסוף, השיטה היעילה ביותר אך זמן רב היא גלולה ולשטוף את התאים לפני תוד התא לשחרר את תאי 2'FL. ברגע שאנו קובעים שיטה זו, הצלחנו להרחיב את הרפרטואר של מטרות אוליגוסכריד באמצעות אנזימים שונים. נכון לעכשיו, אנחנו יכולים לזהות תשעה אוליגוסכרידים שונים ואנחנו עובדים על יותר.תוך כדי אופטימיזציה של ההתגוננות הזו, שמנו לב החוסן של האנזימים שלנו אפשר לנו לבוא עם טכניקה שנותנת קישור ספציפי לקרוא בעוד כחמש דקות. למרות שאף אחד מהריגטים המשמשים כאן אינם מסוכנים במיוחד, אלה המשתמשים בשיטה זו צריכים לעקוב אחר הליכים ביו-האזרד וביו-בידור סטנדרטיים, כולל לבישת PPE תקין.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

דגימה רעלני של זגוגית השן פחמתי פחמן יציב וניתוח איזוטופ החמצן

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...