Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
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इस काम को आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी स्टार्टअप फंड्स ने सपोर्ट किया था । F.E. आंशिक रूप से NSF Trinect फैलोशिप और Manley Hoppe प्रोफेसरशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । T.J.M. आंशिक रूप से करेन और डेनी Vaughn संकाय फैलोशिप द्वारा समर्थित था । लेखक आयोवा राज्य विश्वविद्यालय फ्लो Cytometry सुविधा और प्रतिदीप्ति और नियंत्रण रेखा-एमएस अध्ययन के साथ सहायता के लिए आलमआरा Keck Metabolomics अनुसंधान प्रयोगशाला धंयवाद ।

1. सेल कल्चर और इंडक्शन कंडीशंस
नोट: निम्नलिखित प्रयोगों में, तीन उपभेदों का उपयोग किया जाता है: ई. कोलाई BL21 (DE3) एक खाली वेक्टर के साथ, ई. कोलाई BL21 (DE3) Plasmids pafca के साथ14 और pET28: ग्रीन फ्लोरोसेंट प्?...

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हम फुकोसिलेटेड मानव दूध ओलिगोसैकेराइड के लिंकेज विशेष पहचान के लिए एक उच्च थ्रौपुट रणनीति प्रस्तुत करते हैं । यह आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग ई. कोलाई जो विशिष्ट glycans के साथ प्रेरण पर एक फ्लोरोसेंट स...

मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (HMOs) लैक्टोज-व्युत्पंन ओलिगोसैकेराइड, आमतौर पर तीन से आठ चीनी मोनोमर शामिल हैं । वे एक लैक्टोज (gal-β1, 4-जीएलसी) अंत को कम करने और आगे ग्लाइकोसाइडिक लिंक (β-1, 3-या β-1, 6-) ग्लूकोज (glc), गैलेक्टोज (Gal), या एन acetylglucosamine (glcnac) द्वारा लम्बी हैं । इसके अलावा, फ्यूकोज़ (फक, α-1, 2-या α-1, 3-) या सियालिक अम्ल (Sia या NeuAc, α-2, 3-या α-2, 6-) अवशेष प्रायः1जोड़े जाते हैं ।
ओलिगोसैकेराइड और अन्य कार्बोहाइड्रेट्स का वर्तमान विश्लेषण क्रोमाग्राफिक/मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (MS) प्रौद्योगिकी की आवश्यकता द्वारा थ्रपुट और स्कोप में सीमित है2,3,4,5, 6 , 7, जो लगभग एक घंटे के नमूने के प्रति ले जा सकते हैं, महंगा उपकरण, विशेष कॉलम और derivatizing एजेंटों, और इस उपकरण के संचालन पर विशेषज्ञता के लिए आवश्यकता का उल्लेख नहीं8। ओलिगोसैकेराइड लिंकेज विशेष रूप से निर्धारित करने के लिए मुश्किल है, उंनत MS9,10 या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) तकनीकों की आवश्यकता11। इन ओलिगोसैकेराइड के संश्लेषण के तेजी से अनुकूलन इस तरह इस धीमी विश्लेषणात्मक कदम के थ्रूपुट द्वारा सीमित है ।
इस अध्ययन में, हम एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड Escherichia कोली पूरे सेल का उपयोग करते हुए कि मानव दूध में सबसे प्रचुर मात्रा में hmos है, 2 ' fucosyllactose (2 '-FL) पर ध्यान केंद्रित, fucosylated trisaccharide लैक्टोज आधारित hmos के लिंकेज-विशिष्ट पता लगाने का प्रदर्शन 4 एमजी/एल पर पता लगाने की एक सीमा के साथ बायोसेंसर । इस जैव संवेदक की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि आइसोमेरिक ट्राइसैकेराइड के बीच अंतर करने की क्षमता है । डिजाइन सिद्धांत ई. कोलाई में विशिष्ट fucosidases की अभिव्यक्ति पर आधारित है कि hmos से मुक्त लैक्टोज, जो की उपस्थिति lac operon, जो बारी में एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पंन द्वारा पता चला है । हम एक दो plasmid प्रणाली के निर्माण के द्वारा इस लक्ष्य को प्राप्त करने, एक लिंकेज विशिष्ट fucosidase और अंय एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन शरण । इस बायोसेंसर मंच प्रवाह cytometry या माइक्रो प्लेट रीडर द्वारा उच्च थ्र्पुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है । हम भी एक इंजीनियर तनाव12द्वारा उत्पादित मात्रा बढ़ाता में बायोसेंसर के उपयोग का प्रदर्शन. इस अध्ययन के भीतर, हम भी लैक्टोज के चयनात्मक हटाने कि biosensor से झूठी सकारात्मक संकेत में परिणाम कर सकते हैं पर तीन रणनीतियों वर्तमान, यह देखते हुए कि इंजीनियर निर्माता तनाव लैक्टोज पर उगाया जाता है.
एक साथ लिया, आनुवंशिक रूप से एनकोडेड biosensors हमें का पता लगाने और एक लिंकेज विशिष्ट तरीके से, जो भी chromatographic, एमएस, या NMR तकनीकों के साथ मुश्किल है में HMOs की मात्रा की अनुमति देते हैं । अपनी उच्च थ्रॉपुट और उपयोग में आसानी के कारण, इस विधि के चयापचय इंजीनियरिंग और HMOs के संश्लेषण में व्यापक अनुप्रयोगों होना चाहिए ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (HMOs) मानव स्तन के दूध के जटिल कार्बोहाइड्रेट घटक है कि शिशु स्वास्थ्य पर बहुतायत लाभ दर्शाते हैं । तथापि, उनके जैव प्रौद्योगिकीय संश्लेषण का इष्टतम पता लगाना और मोनोसैकेराइड और लिंकेज का मात्रा का परिमाणन अपेक्षाकृत कम थ्रपुट द्वारा सीमित किया जाता है । ग्लाइकन विश्लेषण की पारंपरिक तकनीकों में क्रोमाग्राफिक/मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक पद्धतियां शामिल हैं, जो स्वचालन के बिना प्रतिदिन सैकड़ों नमूनों के आर्डर पर थ्रपुट के साथ होती हैं । हम यहां प्रदर्शित करता है, एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड बैक्टीरियल बायोसेंसर उच्च थ्र्यूपुट के लिए, लिंकेज-विशिष्ट का पता लगाने और फुकोसिलेटेड hmo संरचनाओं के परिमाणन, 2 '-fucosyllactose और 3-fucosyllactose, जो हम द्वारा प्राप्त की विषमजातीय फ्यूकोसाइडसेस की अभिव्यक्ति. के रूप में दूध में लैक्टोज की उपस्थिति या जैव प्रौद्योगिकीय प्रक्रियाओं झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, हम भी लैक्टोज से संकेत की कमी प्रदर्शित विभिंन रणनीतियों का उपयोग । इस तकनीक के उच्च थ्रूपुट के कारण, कई प्रतिक्रिया शर्तों या बायोरिएक्टर मापदंडों समानांतर में घंटे के एक मामले में किया जा सकता है, hmo विनिर्माण के अनुकूलन के लिए अनुमति ।

हम एक पूरी सेल 2 ' के लिए विशिष्ट बायोसेंसर-FL कि ओलिगोसैकेराइड के बायोसेंसर उत्पादन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है डिजाइन । इस टर्मिनल को संशोधित करने के विशिष्ट एंजाइमी द?...

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Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

हम यहां का वर्णन उच्च थ्रॉपुट का पता लगाने और fucosylated मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (hmos) के एक पूरे सेल biosensor का उपयोग कर के परिमाणन । हम भी यहां प्रदर्शन, HMO उत्पादन उपभेदों के विश्लेषण की दिशा में इस मंच के अनुकूलन, शोर अनुपात को संकेत में सुधार पर ध्यान केंद्रित ।

जैव प्रौद्योगिकीय संदर्भ में फ्यूकोसिलेटेड मानव दूध ट्राइसैकेराइड का विश्लेषण आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Biotechnological का उपयोग

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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