Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio di Iowa State University. F.E. è stato parzialmente finanziato dal NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cattedra. T.J.M. è stato parzialmente sostenuto da Karen e Denny Vaughn Facoltà Fellowship. Gli autori ringraziano Iowa State University flusso Cytometry Facility e il laboratorio di ricerca metabolomica W.M. Keck per assistenza con fluorescenza e studi di LC-MS.

1. cella condizioni di cultura e induzione
Nota: Negli esperimenti seguenti, vengono utilizzati tre ceppi: e. coli BL21 (DE3) con un vettore vuoto, e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcA14 e pET28:green proteina fluorescente (GFP) ed e. coli BL21 (DE3) con plasmidi pAfcB14 e pET28:GFP. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo di Luria-Bertani (LB) o media minimi con gli antibiotici adatti. Preparare soluzioni di riserva di 1.000 x kanamicina (50 mg/mL...

<ol>
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Vi presentiamo una strategia ad alta produttività per la rilevazione di specifici del sollevatore di fucosylated gli oligosaccaridi del latte umano. Ciò è stata compiuta con la costruzione di biosensori di cellule intere di genetica e. coli che dopo induzione con specifici glicani rispondere con un segnale fluorescente. Il protocollo inoltre dettagli su come il biosensore può essere utilizzato per rilevare e quantificare HMOs in un metabolicamente derivati dal ceppo batterico.
Il ...

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) Sono oligosaccaridi lattosio-derivato, solitamente composto da tre a otto monomeri di zucchero. Essi hanno una riduzione del lattosio (Gal-β1, 4-Glc) fine e sono ulteriormente allungate da legami glicosidici (β-1,3 - o β-1,6-) di glucosio (cromatografia gaseoliquido), galattosio (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Inoltre, fucosio (Fuc, α-1,2 - o α-1,3-) o acido sialico (Sia o NeuAc, α-2,3 - o α-2,6-) residui vengono spesso aggiunti1.
Analisi corrente di oligosaccaridi e altri carboidrati sono limitato a velocità effettiva e la portata dalla necessità per spettrometria cromatografico/massa (MS) tecnologia di2,4,3,5, 6 , 7, che può durare circa un'ora per campione, per non parlare della necessità di attrezzature costose, colonne specializzate e agenti derivatizzanti e competenza sul funzionamento di questa apparecchiatura8. Oligosaccaride collegamenti sono particolarmente difficili da determinare, che richiede avanzate MS9,10 o di tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR)11. Rapida ottimizzazione di sintesi di questi oligosaccaridi è così limitato dalla velocità effettiva di questo lento passaggio analitico.
In questo studio, dimostriamo rilevazione sollevatore-specifica del trisaccaride fucosylated basati su lattosio HMOs, concentrandosi su 2'-fucosyllactose (2'-FL) che è il HMO più abbondante nel latte umano, utilizzando un codificato geneticamente Escherichia coli cellule intere biosensore con un limite di rilevazione 4 mg/l. Una caratteristica importante di questo biosensore è la sua capacità di distinguere tra trisaccaridi isomerica. Il principio di progettazione si basa sull'espressione di specifiche fucosidases in e. coli che liberare il lattosio da HMOs, la cui presenza è rilevata da operone lac , che a sua volta genera un segnale fluorescente. Raggiungiamo questo con la costruzione di un sistema di due-plasmide, uno che harboring il fucosidase specifiche del sollevatore e l'altra una proteina reporter fluorescente. Questa piattaforma di biosensore è adatta per high throughput screening di citometria a flusso o lettore di micropiastre. Inoltre dimostriamo l'utilizzo del biosensore nella quantificazione del 2'-FL prodotto da un ceppo derivati dal12. All'interno di questo studio, presentiamo anche tre strategie su rimozione selettiva di lattosio che può causare segnali positivi da biosensore, dato che il ceppo di derivati dal produttore viene coltivato il lattosio.
Presi insieme, i biosensori codificati geneticamente ci permettono di rilevare e quantificare HMOs in maniera sollevatore-specifica, che è difficile anche con cromatografica, MS, o NMR tecniche. Grazie alla sua alta produttività e facilità d'uso, questo metodo dovrebbe avere applicazioni diffuse nell'ingegneria metabolica e la sintesi di HMOs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMOs) sono dei carboidrati complessi componenti del latte materno umano che presentano abbondanti benefici sulla salute infantile. Tuttavia, ottimizzazione della loro sintesi biotecnologica è limitata dalla relativamente bassa velocità effettiva di rilevazione e quantificazione di monosaccaride e collegamenti. Le tecniche convenzionali di analisi glycan includono metodi cromatografici/massa-spettrometria con velocità di trasmissione dell'ordine di centinaia di campioni al giorno senza automazione. Qui, dimostriamo un biosensore batterico geneticamente codificato per la rilevazione di alto-rendimento, specifiche del sollevatore e quantificazione delle strutture fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, che abbiamo raggiunto via eterologa espressione di fucosidases. Come la presenza di lattosio nel latte o in processi biotecnologici potrebbe portare a falsi positivi, dimostriamo anche la riduzione del segnale da lattosio utilizzando diverse strategie. Dovuto l'alta velocità effettiva di questa tecnica, molte condizioni di reazione o bioreattore parametri potrebbero essere analizzati in parallelo in poche ore, consentendo l'ottimizzazione della produzione di HMO.

Abbiamo progettato un biosensore intera cellula specifico a 2'-FL che può essere utilizzato in combinazione con la produzione biotecnologica dell'oligosaccaride. Questo si basa sulla scissione enzimatica specifica di modificare terminali zuccheri generazione di lattosio e quindi l'attivazione dell'operone lac , che conduce all'espressione di una proteina fluorescente reporter sotto un promotore inducibile di lattosio, in proporzione alla quantità di 2'-FL. Per dimostrare la sua...

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Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave coinvolte nella produzione di oligosaccaridi del latte umano. Innanzitutto, quanta parte del prodotto ho? E in secondo luogo, qual è il collegamento specifico dei carboidrati?L'obiettivo è semplificare e accelerare il processo di quantificazione e caratterizzazione di questi oligosaccaridi del latte umano. Questo metodo ha due vantaggi rispetto allo stato attuale dell'arte. In primo luogo, è suscettibile allo screening ad alta produttività.Quindi, potete immaginare di testare migliaia di condizioni diverse o forse anche una libreria di enzimi di sintesi in un giorno usando questa tecnica. Inoltre, utilizza l'esclusiva specificità del substrato che la natura ha evoluto negli enzimi per darci informazioni sul collegamento dei carboidrati di quegli oligosaccaridi. Riteniamo che questo metodo possa migliorare la produzione di oligosaccaridi del latte umano, il che a sua volta può portare a alimenti per lattanti di migliore qualità che imitano più da vicino il latte materno umano e aiutano a colmare il divario tra i bambini allattati al seno e nutriti con alimenti.La discrezione dell'utente è consigliata quando si decide quale metodo utilizzare per la rimozione del lattosio in base al costo, alla velocità effettiva e alla disponibilità delle apparecchiature. Si deve fare attenzione a garantire una rimozione ottimale del lattosio. Il giorno prima dell'esperimento, seme 5 millilitri di mezzo LB integrati con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca utilizzando tecniche sterili.Incubare tutte le culture durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, trasferire 50 microlitri di una coltura notturna in cinque millilitri di supporti LB M9 freschi con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti continui fino a quando la coltura non ha raggiunto un OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.In primo luogo, trasferire le colture notturne in un punto cinque tubi millilitro e centrifugare a 12.500 volte g per un minuto. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di 1x PBS per preparare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione a cella singola in tubi fax.Utilizzare un citometro a flusso per eccitare la GFP e raccogliere i livelli di fluorescenza FITC come delineato nel protocollo di testo. Per effettuare una curva di calibrazione, effettuare da otto a 10 diluizioni del 2'FL standard nell'intervallo compreso tra zero e 2500 milligrammi per litro. Culturare le cellule di biorilevamento 2'FL e indurle con le diluizioni standard delineate nel protocollo di testo.Inizia una cultura di un ceppo di produzione 2'FL in cinque millilitri di supporti LB e coltivalo durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, sottocultura all'1% in 250 millilitri di mezzi minimi preparati e aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la coltura e OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.Quindi aggiungere IPTG a una concentrazione finale di zero punti cinque millimolare e lattosio a una concentrazione finale di due grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento continuo per 24 ore. Il giorno successivo, trasferire la coltura notturna su tubi sterili da 50 millilitri e centrifugare a 900 volte g per 15 minuti.Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in acqua deionizzata. Ripetere questo lavaggio tre volte per rimuovere eventuali lattosio residuo. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di acqua deionizzata.Posizionare le cellule sul ghiaccio e utilizzare un sonicatore al 30% di potenza in impulsi di 30 secondi per lisciviare la sospensione cellulare. Centrifugare le cellule liti a 2.000 volte g per 25 minuti. Rimuovere il supernatante e passarlo attraverso un filtro sterile.Conservare il supernatante filtrato a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'analisi. Successivamente, inoculare una coltura di cellule di biorilevamento 2'FL. Nella fase di registro intermedio, indurre le cellule con il llysato cellulare a concentrazioni equivalenti a quelle di quei 2'FL utilizzati per effettuare la curva di taratura.Eseguire la calibrazione come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, eseguire i campioni su un citometro a flusso. Generare una curva di risposta alla dose tracciando l'uscita di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride e confrontare la risposta degli standard con il lisato cellulare.In primo luogo, sciogliere fl alfalyzed beta galattosidasi a 1.000 unità per millilitro in un cloruro di magnesio millimolare. Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, far crescere un inoculo di cellule di biorilevamento 2'FL e nella fase di registro intermedio, indurre con lattosio e 2'FL. A 100 colture di microliteri, aggiungere quantità variabili di beta galattosidasi fino a 12 unità.Lascia che le culture crescano durante la notte a 37 gradi Celsius con continui scuotimenti. Misurare la fluorescenza descritta nel protocollo di testo e calcolare le unità ottimali di enzima necessarie determinando la concentrazione minima enzimatica per ottenere l'attenuazione del segnale desiderata. A 2'FL cellule produttrici coltivate per 24 ore aggiungere le unità ottimali di beta galattosidasi e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.Per prima cosa, inizia una coltura da 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase di log medio, incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, inoculare una cultura E.coli BL21 nei media LB.Coltivalo fino alla fase di registro intermedio a 37 gradi Celsius, quindi aggiungi 15 millilitri di questa cultura alla cultura 2'FL di 24 ore. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.Per iniziare, inizia una coltura di 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase a metà log, incubare la coltura a 37 gradi celsius per 24 ore. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla coltura e agitare bene.Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, centrifugare la sospensione a 900 volte g per 15 minuti. Raccogliere il supernatante e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius per far precipitare il lattosio.Passare la soluzione attraverso la carta da filtro per rimuovere il lattosio precipitato. Raccogliere il filtrato che contiene il lisato cellulare e determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza. In questo studio, viene utilizzata una strategia ad alta produttività per il rilevamento specifico del collegamento di oligosaccaridi di latte umano fucosilati.Ciò si ottiene costruendo bio-sensori interi a cellule dall'ingegneria genetica E.Coli che, al momento dell'induzione con glicani specifici, rispondono con un segnale fluorescente. Il segnale fluorescente in diverse condizioni di induzione, come analizzato su un citometro di flusso, mostra un aumento di 100 volte della fluorescenza con il biosensore 2'FL rispetto al controllo solo vettoriale o al biosensore per 3'FL. Questo mostra l'elevata specificità di collegamento del biosensore.La sensibilità del saggio può essere determinata generando una curva di risposta alla dose con vari livelli di carboidrati. La gamma lineare dinamica di rilevamento 2'FL, è considerata compresa tra 40 e 400 milligrammi per litro e il limite di rilevamento è di quattro milligrammi per litro. Questo saggio può essere effettuato nel corso di una giornata lavorativa come si vede nelle misurazioni a scatto della dinamica dell'espressione del reporter.Le cellule di biorilevamento possono essere utilizzate per rilevare e quantificare 2'FL da un ceppo di produzione 2'FL ingegnerizzato utilizzando una serie di strategie per ridurre il segnale dal lattosio esogeno in modo che il segnale letto corrisponda direttamente alla concentrazione di 2'FL. Una strategia è quella di degradare enzimaticamente il lattosio usando una beta galattosidasi che non agisce sul lattosio modificato. Un'altra strategia ha utilizzato l'etanolo che non solo precipita selettivamente il lattosio, ma lelysisce anche le cellule produttrici poiché lalisi delle cellule è un passo verso il basso necessario.Infine, il metodo più efficace ma dispendioso in termini di tempo è quello di pelletare e lavare le cellule prima dellalisi cellulare per rilasciare il 2'FL intracellulare. Una volta stabilito questo metodo, siamo stati in grado di espandere il repertorio di bersagli di oligosaccaridi usando diversi enzimi. Attualmente, possiamo rilevare nove diversi oligosaccaridi e stiamo lavorando su di più.Durante l'ottimizzazione di questo saggio, abbiamo notato che la robustezza dei nostri enzimi ci ha permesso di trovare una tecnica che dà un collegamento specifico letto in circa cinque minuti. Sebbene nessuno dei reagenti qui utilizzati sia particolarmente pericoloso, coloro che utilizzano questo metodo dovrebbero seguire procedure standard di biohazard e biocontenimento, incluso l'uso di DPI adeguati.

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Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Protocollo di dosing stepwise per aumentare la velocità effettiva nei dati GPCR basati su impeditto per etichetta

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...