Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

この作品は、アイオワ州立大学スタートアップ資金によって支えられました。F. e. は NSF Trinect 親睦とマンリー ホッピ教授によって部分的に資金を供給されました。T.J.M. は、カレンとデニー ・ ヴォーン教員フェローシップによって部分的に支えられました。著者らは、蛍光と LC MS 研究アイオワ州立大学流れ Cytometry 施設と支援のため W.m.keck メタボロミクス研究所をありがとうございます。

1. 細胞文化誘導条件
注: 次の実験では、3 系統が使用:エシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 空のベクターは、大腸菌BL21 と (DE3) プラスミド pAfcA14と pET28:green 蛍光蛋白質 (GFP) と大腸菌BL21 (DE3) プラスミドをpAfcB14と pET28:GFP。すべての菌株はルリア ベルターニカミラ スープ (LB) または適切な抗生物質で最小媒体で育ちます。水、脱イオン (DI) で 1,0...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

母乳オリゴ糖次のリンケージ固有の検出のための高スループット戦略を提案します。これは、大腸菌その特定の糖鎖を持つ誘導蛍光信号で応答を遺伝子工学で全細胞バイオ センサーを構築することにより達成されました。プロトコルは、バイオ センサーを使用して検出し、菌株の代謝改変で Hmo を定量化する方法についても詳しく説明します。
提案プロトコルで?...

母乳オリゴ糖 (Hmo) は通常 3 ~ 8 糖モノマーを含む乳糖由来のオリゴ糖です。彼らは乳糖 (Gal β 1, 4 Glc) の削減を終了し、グリコシド リンクによってさらに長くている (β-1, 3、β 1, 6-) n-アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース (Gal)、グルコース (Glc) します。また、フコース (α 1, 2 または α 1, 3 フコース-) やシアル酸 (Sia または示さ、α 2, 3 または α 2, 6-) 残基はしばしば1を追加しました。
オリゴ糖や他の炭水化物の現在の分析、ガスクロマト グラフ/質量分析 (MS) 技術2,3,4,5,の必要性によってスループットとスコープの制限します。6,7、ほぼ取ることができるこの装置8の操作に高価な機器、特殊な列と誘導体化剤および専門知識の必要性を述べないために、サンプルあたり 1 時間。オリゴ糖の連携は特に判断が難しい高度な MS9,10または核磁気共鳴 (NMR) 法11を必要とします。これらのオリゴ糖の合成の迅速な最適化従って、この遅い分析ステップのスループットによって制限されます。
本研究でリンケージ固有次三糖類の検出を示す乳糖ベース Hmo は、2'-fucosyllactose (2' FL) ヒトの乳汁中最も豊富な HMO にあるに焦点を当てて、遺伝的コード化を使用してエシェリヒア属大腸菌のセル全体4 mg/l. の検出限界を用いるバイオ センサーこのバイオ センサーの重要な特徴は、三糖類の異性体を区別する能力です。設計の原則は存在が順番蛍光信号を生成するlacオペロンによって検出された Hmo から乳糖を解放するエシェリヒア属大腸菌の特定の fucosidases の式に基づいています。我々 はリンケージ固有の fucosidase およびその他の蛍光レポーター蛋白質をかくまっている 1 つ 2 プラスミド システムを構築することによってこれを達成します。このバイオ センサー プラットフォームは、フローサイトメトリーやマイクロ プレート リーダーによる高スループット スクリーニングに適しています。また 2 階設計ひずみ12プロデュースの定量化におけるバイオ センサーの使用率を示します。本研究でまた提案する 3 つの戦略、バイオ センサーから偽の肯定的な信号につながる乳糖の選択的除去に関する設計プロデューサーひずみが乳糖で栽培されていることを考える。
一緒に取られて、遺伝的コード化バイオ センサー検出し、Hmo を定量化は困難もリンケージに固有の方法でことができるクロマトグラフィー、MS、または NMR テクニック。高スループットを実現、使いやすさのためこのメソッドは Hmo の合成と代謝工学の広範なアプリケーションに必要です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

母乳オリゴ糖 (Hmo) は、乳児の健康に豊富な利点を示す人間の母乳の複雑な炭水化物コンポーネントです。しかし、彼らのバイオ合成の最適化は、検出のスループットが比較的低くて、単糖類とリンケージの定量化によって制限されます。糖鎖解析技術には、オートメーションを使用せず一日あたりのサンプルの数百のスループットとガスクロマト グラフ/質量分析メソッドがあります。ここでは、高スループット、リンケージ固有の検出と定量化の次 HMO 構造, 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose、異種を介して実現遺伝的コード化細菌バイオ センサーを紹介します。fucosidases の式。乳糖牛乳またはバイオ プロセスの存在は、偽陽性につながるとまた異なる戦略を使用して乳糖から信号の減少を示します。この手法の高スループットによる HMO 製造の最適化を可能にする時間の問題で並列に多くの反応条件やバイオリアクター パラメーターを試金する可能性があります。

2'-FL のオリゴ糖バイオ生産と組み合わせて使用できる固有セル全体バイオ センサーを考案しました。これは乳糖を生成するターミナルの糖を変更する特定の酵素胸の谷間に依存とそれにより比例する乳糖誘導性プロモーター レポーター蛍光タンパク質の発現につながるlacオペロンの活性化、2'-フロリダ州の量そのリンケージの特異性, 3-fucosyllactose (3 FL), を異?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

ハイスループット検出と細胞バイオ センサーを用いた次母乳オリゴ糖 (Hmo) の定量化ここで述べる。また示すここでは、このプラットフォーム HMO 生産菌株の解析に向けての適応信号対雑音比を改善に焦点を当てします。

遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコード バイオ センサー

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

この方法は、ヒト乳オリゴ糖の生産に関するいくつかの重要な質問に答えることができます。まず、製品の量はどれくらいですか?第二に、特定の炭水化物の結合は何ですか?ここでの目標は、これらのヒト乳オリゴ糖を定量化し、特徴付けるプロセスを簡素化し、スピードアップすることです。この方法は、現在の最先端に対して2つの利点を有する。まず、ハイスループットスクリーニングに適しています。だから, この技術を使用して、1 日で何千もの異なる条件、あるいはおそらく合成酵素のライブラリをテスト想像することができます。.また、自然が酵素で進化してきた独特の基質特異性を利用して、それらのオリゴ糖の炭水化物結合に関する情報を提供します。この方法は、ヒトの母乳オリゴ糖の生産を改善し、ヒトの母乳をより密接に模倣し、母乳と授乳中の赤ちゃんの間のギャップを埋めるのに役立つ、より質の高い乳児用フォーミュラにつながると考えています。コスト、スループット、および機器の可用性に基づいてラクトース除去に使用する方法を決定する際には、ユーザーの裁量が推奨されます。最適な乳糖除去を確実にするために注意する必要があります。.実験の前日には、無菌技術を用いた新鮮な細菌コロニーからカナマイシンおよびカルベニシリンを添加したLB培地の種子5ミリリットル。すべての文化を摂氏37度で一晩にインキュベートします。翌日、カナマイシンとカルベニシリンを用いて、一晩培養した50マイクロリットルを新鮮なLB M9培地の5ミリリットルに移す。培養がゼロポイント5とゼロポイント7の間のOD600に達するまで、連続的な揺れで摂氏37度でインキュベートします。まず、一晩培養物を1ポイント5ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を12、500倍gで1分間移す。上清を捨て、1xPBSの500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、単一の細胞懸濁液を調製する。単一セルのサスペンションをファクスチューブに移します。フローサイトメーターを使用してGFPを励起し、テキストプロトコルで概説されているようにFITC蛍光レベルを収集します。キャリブレーションカーブを作るためには、1リットル当たり0〜2500ミリグラムの範囲で標準2'FLの8〜10希釈を行います。2'FLバイオセンシング細胞を培養し、テキストプロトコルで概説されているように、標準的な希釈液でそれらを誘導する。LB培地の5ミリリットルで株を生産する2'FLの培養を開始し、摂氏37度で一晩成長させます。翌日、サブカルチャーは1%で250ミリリットルの最小限の培地を調製し、グリセロールを1リットル当たり10グラムの最終濃度に加える。培養が到達するまで摂氏37度でインキュベートし、ゼロポイント5とゼロポイント7の間でOD600をインキュベートします。その後、ゼロポイント5ミリモルとラクトースの最終濃度にIPTGを加え、1リットル当たり2グラムの最終濃度にします。24時間連続揺れで摂氏37度でインキュベート。翌日、15分間900回gで無菌50ミリリットルチューブと遠心分離機に一晩培養を移す。上清を捨て、脱イオン水でペレットを再び懸濁します。この洗浄を3回繰り返して、残ったラクトースを取り除きます。この後、ペレットを5ミリリットルの脱イオン水で再懸濁する。細胞を氷の上に置き、30秒パルスで30%のパワーで超音波処理器を使用して細胞懸濁液を取り付けます。2,000回gで25分間、細胞を遠心分離する。上清を取り除き、滅菌フィルターを通します。フィルター処理した上清を分析の準備ができるまで摂氏4度で保存します。次に、2'FLバイオセンシング細胞の培養を接種する。中対数相で、細胞のライセートを、較正曲線の作成に使用した2'FLと同等の濃度で誘導する。テキストプロトコルに記載されているキャリブレーションを実行します。この後、フローサイトメーターでサンプルを実行します。蛍光量の出力をオリゴ糖濃度にプロットして用量応答曲線を生成し、細胞のリセートに対する標準の応答を比較します。まず、FLα分解したβガラクトシダーゼを1ミリモル塩化マグネシウムに1ミリリットル当たり1,000単位に溶解する。必要な酵素の最適濃度を決定するには、2'FLバイオセンシング細胞の接種を成長させ、中対数相でラクトースと2'FLで誘導します。100マイクロリットルの培養物に、12単位までのベータガラクトシダーゼの可変量を加える。連続的な揺れで37°Cで一晩文化を成長させてください。テキストプロトコルに記載されている蛍光を測定し、シグナルの所望の減衰を達成するために最小酵素濃度を決定することによって必要な酵素の最適単位を計算します。24時間成長した2'FL産生細胞に、βガラクトシダーゼの最適単位を加え、摂氏37度で一晩インキュベートし、前述のように2'FLの力を決定する。まず、2'FL産生株の25ミリリットル培養を開始する。中対数相で菌株が誘導されたら、24時間摂氏37度で培養を行う。次に、LB培地で大腸菌BL21培養物を接種する。摂氏37度で中ログ相に成長させ、24時間2'FL文化にこの文化の15ミリリットルを加えます。摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、前述のとおり 2'FL の titre を判別します。まず、2'FL産生株の25ミリリットル培養を開始する。中対数相で菌株が誘導されたら、24時間摂氏37度で培養を行う。100%エタノールを2巻の培養物に加え、よく振ります。摂氏37度で4時間インキュベートします。その後、懸濁液を900回gで15分間遠心する。上清を集め、摂氏4度で一晩インキュベートして乳糖を沈殿させます。溶液を濾紙を通して、沈殿したラクトースを除去する。細胞のライセートを含む濾液を収集し、前述のように2'FLのtitreを決定します。本研究では、フコシル化ヒト乳オリゴ糖のリンケージ特異的検出にハイスループット戦略を用いる。これは、特定のグリカンを誘導すると蛍光シグナルで応答する大腸菌を遺伝子工学することによって、全細胞バイオセンサーを構築することによって達成される。フローサイトメーターで分析した誘導の異なる条件下での蛍光シグナルは、3'FLの制御のみまたはバイオセンサーのベクターと比較して2'FLバイオセンサーを用いた蛍光の100倍以上の増加を示す。これは、バイオセンサーの高いリンケージ特異性を示す。アッセイの感度は、炭水化物レベルの変化を伴う用量応答曲線を生成することによって決定することができる。2'FL検出の動的線形範囲は、1リットル当たり40〜400ミリグラムの間であると見られ、検出の限界は1リットル当たり4ミリグラムである。このアッセイは、レポーター表現のダイナミクスのスナップショット測定に見られるように、作業日の間に行うことができる。バイオセンシング細胞は、読み出された信号が2'FL濃度に直接対応するように外因性ラクトースからの信号を減らすための多くの戦略を使用して、設計された2'FL生産者株から2'FLを検出し、定量化するために使用することができます。1つの戦略は、修飾乳糖に作用しないベータガラクトシダーゼを使用して乳糖を酵素的に分解することです。別の戦略は、ラクトースを選択的に沈殿させるだけでなく、細胞のライシスが必要なステップダウンストリームであるため、生産者細胞を分解するエタノールを利用した。最後に、最も効果的だが時間のかかる方法は、細胞内2'FLを放出するために細胞の細胞をペレットに洗浄し洗浄することです。この方法を確立すると、異なる酵素を用いてオリゴ糖標的のレパートリーを拡大することができました。現在、9種類のオリゴ糖を検出することができ、より多くの作業を行っています。このアッセイを最適化しながら、酵素の堅牢性により、約5分でリンケージ固有の読み出しを行う技術を考え出すようになりました。ここで使用される試薬はいずれも特に危険ではありませんが、この方法を使用する試薬は、適切なPPEの着用を含む標準的なバイオハザードおよびバイオ封じ込め手順に従う必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

安定炭素・酸素同位体分析の炭酸塩のサンプリングと歯のエナメル質の前処理

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコード バイオ センサー

遺伝子組み換え生物のコンテキストで次の人間ミルク三糖類の分析エンコードバイオセンサー