Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Iowa State University oppstart midler. Fe var delvis finansiert av NSF Trinect fellesskap og Manley Hoppe professoratet. T.J.M. ble delvis støttet av Karen og Denny Vaughn fakultetet fellesskap. Forfatterne takker Iowa State University Flow cytometri anlegget og WM Keck Metabolomics forskningslaboratoriet for hjelp med fluorescens og LC-MS studier.

1. celle kultur og induksjon forhold
Merk: Følgende eksperimentene, tre påkjenningen brukes: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 og pET28:green fluorescerende protein (GFP) og E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 og pET28:GFP. Alle stammer er dyrket i Luria-Bertani kjøttkraft (LB) eller minimal media med aktuelle antibiotika. Klargjør lager løsninger 1000 x kanamycin (50 mg/mL) og carbenicillin (...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

Vi presenterer en høy gjennomstrømming strategi for kobling-spesifikke påvisning av fucosylated morsmelk oligosaccharides. Dette ble gjort ved å bygge hele cellen biosensors med genetisk engineering E. coli som ved induksjon med bestemte glykaner svare med et fluorescerende signal. Protokollen også detaljer på hvordan biosensor kan brukes til å oppdage og kvantifisere HMOs i en metabolically utviklet bakterielle belastningen.
Våre protokollen har fordeler over alternativ metod...

Morsmelk oligosaccharides (HMOs) er laktose-avledet oligosaccharides, vanligvis bestående av 3-8 sukker monomerer. De har en laktose (Gal-β1, 4-Glc) å redusere ende og er videre forlengede av glycosidic (β-1,3 - eller β-1,6-) glukose (Glc), galaktose (Gal) eller N-acetylglucosamine (GlcNAc). I tillegg fucose (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic syre (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) rester er ofte lagt1.
Gjeldende analyse av oligosaccharides og andre karbohydrater er begrenset i gjennomstrømming og omfanget av behovet for brukt kromatografiske/masse spectrometric (MS) teknologi2,3,4,5, 6 , 7, som kan ta omtrent en time per prøve, for ikke å nevne behovet for dyrt utstyr, spesialiserte kolonner og derivatizing agenter og ekspertise på drift av dette utstyret8. Oligosaccharide sammenhengene er spesielt vanskelig å fastslå, krever avansert MS9,10 eller kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) teknikker11. Rask optimalisering av syntese av disse oligosaccharides er derfor begrenset av gjennomstrømningen av dette langsom analytisk trinnet.
Denne studien vi viser sammenhengen-spesifikke påvisning av fucosylated trisaccharide laktose-baserte HMOs, med fokus på 2-fucosyllactose (2-FL) som er den rikeste HMO i morsmelk, ved hjelp av en genetisk kodet Escherichia coli hele cellen Biosensor med en grense på gjenkjenning på 4 mg/L. En viktig funksjon i dette biosensor er dens evne til å skille mellom isomere trisaccharides. Design prinsippet er basert på uttrykk for bestemte fucosidases i E. coli som frigjøre laktose fra HMOs, tilstedeværelse av som oppdages av lac operon, som igjen genererer et fluorescerende signal. Vi oppnå dette ved å bygge en to-plasmider system, en skjuler sammenhengen-spesifikke fucosidase og den andre et fluorescerende reporter protein. Denne biosensor-plattformen er egnet for høy gjennomstrømming screening av flowcytometri eller mikro-plate leseren. Vi viser også bruken av biosensor i kvantifisere 2-FL produsert av en utvikling belastning12. I denne studien presentere vi også tre strategier på selektiv fjerning av laktose som kan resultere i falske positive signalet fra biosensor, gitt at utvikling produsent belastningen er dyrket på laktose.
Sammen de genetisk kodet biosensors tillater oss å oppdage og kvantifisere HMOs på en kobling-spesifikk måte, som er vanskelig selv med brukt kromatografiske, MS eller NMR teknikker. Dens høy gjennomstrømning og brukervennlighet, bør denne metoden har omfattende programmer på metabolske engineering og syntese av HMOs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Morsmelk oligosaccharides (HMOs) er komplekse karbohydrater komponentene i morsmelk som viser rikelig fordeler på spedbarn helse. Imidlertid er optimalisering av deres bioteknologisk syntese begrenset av den relativt lav overføringshastighet gjenkjenning og måling av enkle sukkerarter og sammenhengene. Konvensjonelle teknikker for glycan analyse inkluderer brukt kromatografiske/masse-spectrometric metoder med gjennomstrømming på hundrevis av eksempler per dag uten automatisering. Vi viser her en genetisk kodet bakteriell biosensor av høy gjennomstrømning og sammenhengen-spesifikke kvantifisering av fucosylated HMO strukturer, 2-fucosyllactose og 3-fucosyllactose, som vi oppnådd via heterologous uttrykk for fucosidases. Som tilstedeværelse av laktose melk eller i bioteknologisk prosesser kan føre til falske positiver, viser vi også reduksjon av signalet fra laktose bruke ulike strategier. På grunn av høy gjennomstrømning av denne teknikken, kan mange reaksjonen forhold eller bioreactor parametere være assayed parallelt i løpet av noen timer, slik at optimalisering av HMO produksjon.

Vi laget en hel celle biosensor gjelder for 2-FL som kan brukes i forbindelse med bioteknologisk produksjonen av oligosaccharide. Dette er avhengig av bestemt enzymatisk cleavage avendring terminal sukker generere laktose og dermed aktivering av lac operon, fører til uttrykk for en reporter fluorescerende protein under en laktose induserbart promoter, i den antall 2-FL. For å demonstrere sin kobling spesifisitet, 3-fucosyllactose (3-FL), en isomer, ble også testet. Genetisk kr...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Vi beskriver her høy gjennomstrømming gjenkjenning og kvantifisering av fucosylated morsmelk oligosaccharides (HMOs) bruker en hel celle biosensor. Også viser vi her, tilpasning av denne plattformen mot analyse av HMO produksjon stammer, fokusere på å forbedre signal til støyforhold.

Analyse av Fucosylated Human melk Trisaccharides i bioteknologisk sammenheng med genetisk kodet Biosensors

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Denne metoden kan bidra til å svare på flere viktige spørsmål som er involvert i produksjonen av morsmelk oligosakkarider. Først, hvor mye av produktet har jeg? Og for det andre, hva er den spesifikke karbohydratkoblingen?Målet her er å forenkle og fremskynde prosessen med å kvantifisere og karakterisere disse humane melke oligosakkarider. Denne metoden har to fordeler over dagens toppmoderne. For det første er det mottagelig for høy gjennomstrømningsscreening.Så, du kan forestille deg å teste tusenvis av forskjellige forhold eller kanskje til og med et bibliotek av syntese enzymer på en dag ved hjelp av denne teknikken. Den bruker også den unike substratspesifisiteten som naturen har utviklet seg i enzymer for å gi oss informasjon om karbohydratkoblingen til de oligosakkarider. Vi tror at denne metoden kan forbedre produksjonen av morsmelk oligosakkarider, noe som igjen kan føre til bedre kvalitet morsmelkerstatning som nærmere etterligner morsmelk hos mennesker og bidrar til å lukke gapet mellom ammet og formelmatede babyer.Brukerskjønn anbefales når du bestemmer hvilken metode som skal brukes til laktosefjerning basert på kostnad, gjennomstrømming og utstyrstilgjengelighet. Det bør tas hensyn til optimal laktosefjerning. Dagen før eksperimentet, frø 5 milliliter lb medium supplert med kanamycin og karbabacillin fra en frisk bakteriell koloni ved hjelp av sterile teknikker.Inkuber alle kulturer over natten ved 37 grader Celsius med agitasjon. Neste dag, overføre 50 mikroliter av en overnatting kultur i fem milliliter av friske LB M9 media med kanamycin og karbabacillin. Inkuber på 37 grader Celsius med kontinuerlig risting til kulturen har nådd en OD600 mellom nullpunkt fem og null punkt syv.Først overfører du overnattingskulturene til ett punkt fem milliliter rør og sentrifuge på 12, 500 ganger g i ett minutt. Kast den overnaturlige og re-suspendere pellet i 500 mikroliter av 1x PBS for å forberede en enkelt celle suspensjon. Overfør enkeltcellesuspensjonen til faksrør.Bruk et strømningssytometer til å opphisse GFP og samle inn FITC-fluorescensnivåer som beskrevet i tekstprotokollen. For å lage en kalibreringskurve, lag åtte til 10 fortynninger av standard 2'FL i området mellom null og 2500 milligram per liter. Kultur 2'FL bio-sensing celler og indusere dem med standard fortynninger som beskrevet i tekstprotokollen.Start en kultur av en 2'FL produserende belastning i fem milliliter LB media og vokse den over natten på 37 grader Celsius. Neste dag, subkultur på 1% i 250 milliliter forberedt minimal media og legge glyserol til en endelig konsentrasjon på 10 gram per liter. Inkuber på 37 grader Celsius til kulturen når og OD600 mellom null punkt fem og null punkt syv.Deretter legger IPTG til en endelig konsentrasjon på nullpunkt fem millimolar og laktose til en endelig konsentrasjon på to gram per liter. Inkuber ved 37 grader Celsius med kontinuerlig risting i 24 timer. Neste dag, overføre overnatting kultur til sterile 50 milliliter rør og sentrifuge på 900 ganger g i 15 minutter.Kast det overnaturlige og suspender pelleten i avionisert vann. Gjenta denne vasken tre ganger for å fjerne eventuelle rester laktose. Etter dette, re-suspendere pellet i fem milliliter av deionisert vann.Plasser cellene på is og bruk en sonicator på 30% strøm i 30 sekunder pulser for å lyse celle suspensjon. Sentrifuger de lysede cellene ved 2000 ganger g i 25 minutter. Fjern det overnaturlige og send det gjennom et sterilt filter.Oppbevar den filtrerte supernatanten ved fire grader Celsius til den er klar til å analysere. Deretter inokulerer en kultur av 2'FL bio-sensing celler. I midtloggfasen induserer cellene med cellelylat ved konsentrasjoner tilsvarende de 2'FL som brukes til å lage kalibreringskurven.Utfør kalibreringen som beskrevet i tekstprotokollen. Etter dette, kjør prøvene på et strømningscytometer. Generer en doseresponskurve ved å plotte fluorescensproduksjonen mot oligosakkaridkonsentrasjonen og sammenligne responsen fra standardene med cellelysatet.Først oppløse FL alfalysert beta galaktosidase til 1000 enheter per milliliter i en millimolar magnesiumklorid. For å bestemme den optimale konsentrasjonen av enzymet som trengs, vokse et inoculum av 2'FL bio-sensing celler og i midten av logfasen, indusere med laktose og 2'FL. Til 100 mikroliterkulturer legger du til variable mengder beta galaktosidase opptil 12 enheter.La kulturene vokse over natten ved 37 grader Celsius med kontinuerlig risting. Mål fluorescensen som beskrevet i tekstprotokollen og beregn de optimale enzymenhetene som trengs ved å bestemme minimumenzymkonsentrasjon for å oppnå ønsket demping av signal. Til 2'FL produserende celler dyrket i 24 timer legge til de optimale enheter av beta galaktosidase og inkubere over natten på 37 grader Celsius, bestemme 2'FL titre som tidligere beskrevet.Først starter du en 25 milliliter kultur av en 2'FL produserende belastning. Når belastningen er indusert i midtloggfasen, inkubere kulturen ved 37 grader Celsius i 24 timer. Deretter inokulerer en E.coli BL21-kultur i LB-medier.Vokse den til midten av loggfasen på 37 grader Celsius deretter legge til 15 milliliter av denne kulturen til 24 timers 2'FL kultur. Inkuber ved 37 grader Celsius i tre timer. Deretter bestemmer du 2'FL titre som tidligere beskrevet.Til å begynne med, start en 25 milliliter kultur av en 2'FL produserende belastning. Når belastningen er indusert i midtloggfasen, inkubere kulturen ved 37 grader celsius i 24 timer. Legg til to volumer av 100% etanol til kulturen og rist godt.Inkuber ved 37 grader Celsius i fire timer. Deretter sentrifuger suspensjonen på 900 ganger g i 15 minutter. Samle supernatant og inkuber over natten på fire grader Celsius for å utløse laktose.Før oppløsningen gjennom filterpapir for å fjerne den utfelte laktose. Samle filtrat som inneholder cellelylat og bestemme 2'FL titre som tidligere beskrevet. I denne studien brukes en strategi med høy gjennomstrømning for koblingsspesifikt påvisning av fukosylert humant melk oligosakkarider.Dette oppnås ved å bygge hele cellebiosensorer ved genteknologi E.Coli som ved induksjon med spesifikke glykomaner reagerer med et fluorescerende signal. Fluorescerende signal under forskjellige induksjonsforhold som analysert på et strømningssytometer, viser over en 100 ganger økning i fluorescens med 2'FL biosensor sammenlignet med vektorens eneste kontroll eller biosensoren for 3'FL. Dette viser biosensorens høye koblingsspesifisitet.Følsomheten til analysen kan bestemmes ved å generere en doseresponskurve med varierende karbohydratnivåer. Den dynamiske lineære rekkevidden av 2'FL deteksjon, er sett å være mellom 40 og 400 milligram per liter og grensen for deteksjon er fire milligram per liter. Denne analysen kan utføres i løpet av en arbeidsdag sett i snap shot målinger av dynamikken i reporter uttrykk.Bio-sensing cellene kan brukes til å oppdage og kvantifisere 2'FL fra en konstruert 2'FL produsent belastning ved hjelp av en rekke strategier for å redusere signal fra eksogen laktose slik at signalet leses ut vil direkte tilsvare 2'FL konsentrasjon. En strategi er å enzymatisk forringe laktose ved hjelp av en beta galaktosidase som ikke virker på modifisert laktose. En annen strategi benyttet etanol som ikke bare selektivt utløser laktose, men også lyses produsentcellene siden celler lysis er et nødvendig skritt ned strømmen.Til slutt er den mest effektive, men tidkrevende metoden å pellet og vaske cellene før cellelysis for å frigjøre intracellulær 2'FL. Når vi etablerte denne metoden, var vi i stand til å utvide repertoaret av oligosakkaridmål ved hjelp av forskjellige enzymer. For øyeblikket kan vi oppdage ni forskjellige oligosakkarider, og vi jobber med mer.Mens vi optimaliserte denne analysen, la vi merke til robustheten til enzymene våre tillot oss å komme opp med en teknikk som gir en koblingsspesifikk lest ut på omtrent fem minutter. Selv om ingen av reagensene som brukes her er spesielt farlige, bør de som bruker denne metoden følge standard biohazard- og biocontainment prosedyrer, inkludert bruk av riktig PPE.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Disseksjon av Human netthinnen og RPE-akkord for Proteomic analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøvetaking og forbehandling av tannemaljen karbonat stabil karbon-og oksygen isotop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Trinnvis Doseringsprotokoll for økt gjennomstrømming i etikettfrie impedansbaserte GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...