Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
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Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização Universidade do estado de Iowa. Fe foi parcialmente financiado pela NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cátedra. T.J.M. foi parcialmente apoiado pela Karen e Denny Vaughn faculdade Fellowship. Os autores agradecer o Iowa University fluxo Cytometry instituição estadual e do W.M. Keck Metabolomics Research Laboratory para assistência com fluorescência e estudos de LC-MS.

1. condições de cultura e indução de célula
Nota: Nos experimentos seguintes, três cepas são utilizadas: Escherichia coli BL21 (DE3) com um vetor vazio, Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcA14 e pET28:green proteína fluorescente (GFP) e Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcB14 e pET28:GFP. Todas as cepas são cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) ou media mínimos com antibióticos apropriados. Prepare soluções es...

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Apresentamos uma estratégia de alto rendimento para a detecção de ligação específica de fucosilado oligossacarídeos do leite humano. Isso foi conseguido através da construção de biossensores de célula inteira por engenharia genética de e. coli , que, após indução com os glicanos específicos, responder com um sinal fluorescente. O protocolo também detalhes sobre como o biosensor pode ser usado para detectar e quantificar a planos de saúde em uma estirpe bacteriana metabolicamente engenharia....

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são derivados de lactose oligossacarídeos, geralmente composto por monômeros de açúcar de três a oito. Eles têm uma redução de lactose (Gal-β1, 4-Glc) terminam e são mais alongados por ligações glicosídicas (β-1,3 - ou β-1,6-) para glicose (Glc), galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc). Além disso, a fucose (Fuc, α-1,2 - ou α-1,3-) ou ácido siálico (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2,6-) resíduos são frequentemente adicionados1.
Análise atual de oligossacarídeos e outros carboidratos é limitada em escopo e throughput pela necessidade de espectrometria cromatográfica/de massa (MS) tecnologia2,3,4,5, 6 , 7, que pode demorar mais ou menos uma hora por exemplo, para não mencionar a necessidade de equipamento caro, colunas especializadas e agentes derivatizing e conhecimentos sobre o funcionamento deste equipamento8. Ligações de oligossacarídeo são particularmente difíceis de determinar, exigir avançado MS9,10 ou de técnicas de ressonância magnética nuclear (NMR)11. Otimização rápida da síntese desses oligossacarídeos assim é limitada pela taxa de transferência deste passo lento e analítico.
Neste estudo, demonstramos a deteção de ligação específica de fucosilado trissacarídeo baseada em lactose planos de saúde, enfocando o 2'-fucosyllactose (2'-FL) que é o HMO mais abundante no leite humano, usando um geneticamente codificado toda célula Escherichia coli Biosensor com um limite de detecção em 4 mg/L. Uma característica importante deste biosensor é sua capacidade de distinguir entre trissacarídeos isoméricos. O princípio de projeto baseia-se na expressão de fucosidases específico em e. coli que liberar à lactose de planos de saúde, cuja presença é detectada pelo operon lac , que por sua vez, gera um sinal fluorescente. Conseguimos isso através da construção de um sistema de dois-plasmídeo, um abrigando o enlace específico fucosidase e o outro uma proteína fluorescente repórter. Esta plataforma de biosensor é apropriada para seleção da elevado-produção por citometria de fluxo ou leitor de microplaca. Também demonstramos a utilização do biosensor para quantificar o 2'-FL produzido por uma cepa de engenharia12. Dentro deste estudo, também apresentamos três estratégias na remoção seletiva de lactose que pode resultar em falso sinal positivo do biosensor, dado que a tensão de engenharia produtor é cultivada em lactose.
Os biosensores geneticamente codificados tomados em conjunto, permitem-nos detectar e quantificar a planos de saúde de uma forma de ligação específica, que é difícil mesmo com cromatografia em fase gasosa, MS, ou NMR técnicas. Devido a sua alta produtividade e facilidade de uso, este método deve ter difundidas aplicações na engenharia metabólica e síntese dos planos de saúde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são componentes de hidrato de carbono complexo do leite materno que exibem abundantes benefícios na saúde infantil. No entanto, otimização de sua síntese biotecnológica é limitada pela relativamente baixa taxa de transferência da deteção e quantificação de monossacarídeo e ligações. Técnicas convencionais de análise de glicano incluem métodos cromatográficos/massa-espectrometria com taxa de transferência na ordem de centenas de amostras por dia sem automação. Aqui, demonstramos um biossensor bacteriano geneticamente codificado para a elevado-throughput, enlace específico detecção e quantificação das estruturas fucosilado HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, que alcançamos através de heteróloga expressão de fucosidases. Como a presença de lactose no leite ou em processos biotecnológicos poderia levar a falsos positivos, demonstraremos também a redução do sinal de lactose usando diferentes estratégias. Devido a alta taxa de transferência desta técnica, muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas, permitindo a otimização da fabricação de HMO.

Nós projetamos um biossensor celular específico para o 2'-FL que pode ser usado em conjunto com a produção biotecnológica do oligossacarídeo. Isto baseia-se na clivagem enzimática específica de modificação de açúcares terminais gerando à lactose e, assim, a ativação do operon do lac , levando à expressão de uma proteína fluorescente repórter sob um promotor inducible à lactose, proporcionalmente à quantidade de 2'-FL. Para demonstrar a sua especificidade de l...

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Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave envolvidas na produção de oligossacarídeos de leite humano. Primeiro, quanto do produto eu tenho? E segundo, qual é a ligação específica de carboidratos?O objetivo aqui é simplificar e acelerar o processo de quantificação e caracterização desses oligossacarídeos de leite humano. Este método tem duas vantagens em relação ao estado atual da arte. Primeiro, é agradável para a triagem de alto rendimento.Então, você pode imaginar testar milhares de condições diferentes ou talvez até mesmo uma biblioteca de enzimas de síntese em um dia usando essa técnica. Além disso, usa a especificidade única do substrato que a natureza evoluiu nas enzimas para nos dar informações sobre a ligação de carboidratos desses oligossacarídeos. Acreditamos que este método pode melhorar a produção de oligossacarídeos de leite humano, o que, por sua vez, pode levar a uma fórmula infantil de melhor qualidade que imita mais de perto o leite materno humano e ajuda a diminuir a distância entre bebês amamentados e alimentados com fórmulas.Recomenda-se a discrição do usuário ao decidir qual método usar para remoção de lactose com base no custo, rendimento e disponibilidade do equipamento. Deve-se tomar cuidado para garantir a remoção ideal da lactose. Um dia antes do experimento, sementes 5 mililitros de meio LB suplementados com kanamicina e carbenicilina de uma colônia bacteriana fresca usando técnicas estéreis.Incubar todas as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, transfira 50 microliters de uma cultura noturna em cinco mililitros de mídia LB M9 fresca com kanamicina e carbenicilina. Incubar a 37 graus Celsius com agitação contínua até que a cultura tenha atingido um OD600 entre zero ponto cinco e zero ponto sete.Primeiro, transfira as culturas da noite para um ponto cinco mililitros e centrífuga a 12.500 vezes g por um minuto. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 500 microliters de 1x PBS para preparar uma única suspensão celular. Transfira a suspensão de célula única para tubos de fax.Use um cítmetro de fluxo para excitar o GFP e coletar níveis de fluorescência FITC conforme descrito no protocolo de texto. Para fazer uma curva de calibração, faça de oito a 10 diluições do padrão 2'FL na faixa entre zero e 2500 miligramas por litro. Cultue as células de biosensoante de 2'FL e induza-as com as diluições padrão, conforme descrito no protocolo de texto.Inicie uma cultura de uma cepa de produção de 2'FL em cinco mililitros de mídia LB e cresça durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, a subcultura a 1%em 250 mililitros de mídia mínima preparada e adiciona glicerol a uma concentração final de 10 gramas por litro. Incubar a 37 graus Celsius até que a cultura atinja e OD600 entre zero ponto cinco e zero ponto sete.Em seguida, adicione IPTG a uma concentração final de zero ponto cinco milimólares e lactose a uma concentração final de dois gramas por litro. Incubar a 37 graus Celsius com agitação contínua por 24 horas. No dia seguinte, transfira a cultura da noite para tubos estéreis de 50 mililitros e centrífuga a 900 vezes g por 15 minutos.Descarte o supernatante e suspenda a pelota em água deionizada. Repita esta lavagem três vezes para remover qualquer lactose residual. Depois disso, suspenda a pelota em cinco mililitros de água deionizada.Coloque as células no gelo e use um sonicator a 30% de potência em pulsos de 30 segundos para lise a suspensão da célula. Centrifugar as células líssedas a 2.000 vezes g por 25 minutos. Remova o supernante e passe-o através de um filtro estéril.Armazene o supernante filtrado a quatro graus Celsius até estar pronto para analisar. Em seguida, inocular uma cultura de células biosensiculadas de 2'FL. Na fase de tronco médio, induza as células com o lisecelular em concentrações equivalentes às das 2'FL usadas para fazer a curva de calibração.Realize a calibração conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, execute as amostras em um citómetro de fluxo. Gere uma curva de resposta de dose plotando a saída de fluorescência contra a concentração de oligossacarídeo e compare a resposta dos padrões ao liseto celular.Primeiro, dissolver fl alfalisado beta galactosidase para 1.000 unidades por mililitro em um cloreto de magnésio milimila. Para determinar a concentração ideal de enzima necessária, cresça um inóculo de células biosensíveis de 2'FL e na fase de tronco médio, induza com lactose e FL de 2'FL. Para 100 culturas de microliter, adicione quantidades variáveis de beta galactosidase até 12 unidades.Que as culturas cresçam da noite para o dia a 37 graus Celsius com agitação contínua. Meça a fluorescência conforme descrito no protocolo de texto e calcule as unidades ideais de enzima necessárias, determinando a concentração mínima de enzimas para alcançar a atenuação desejada do sinal. Às células produtoras de 2'FL cultivadas por 24 horas, adicione as unidades ideais de beta galactosidase e incubar durante a noite a 37 graus Celsius, determinar a titulação de 2'FL como descrito anteriormente.Primeiro, inicie uma cultura de 25 mililitros de uma cepa produtora de 2'FL. Uma vez que a cepa é induzida na fase de registro médio, incubar a cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, inocular uma cultura E.coli BL21 na mídia LB.Cresça-o até a fase de registro médio a 37 graus Celsius e adicione 15 mililitros desta cultura à cultura 24 horas 2'FL. Incubar a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, determine a titulação de 2'FL como descrito anteriormente.Para começar, inicie uma cultura de 25 mililitros de uma cepa produtora de 2'FL. Uma vez que a cepa é induzida na fase de registro médio, incubar a cultura a 37 graus celsius por 24 horas. Adicione dois volumes de 100% de etanol à cultura e agite bem.Incubar a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, centrifufique a suspensão em 900 vezes g por 15 minutos. Colete o supernaspe e incubar durante a noite a quatro graus Celsius para precipitar a lactose.Passe a solução através do papel filtro para remover a lactose precipitada. Colete o filtrado que contém o lisecelular e determine o titulação de 2'FL como descrito anteriormente. Neste estudo, uma estratégia de alto rendimento é utilizada para a detecção específica de ligação de oligossacarídeos de leite humano fucosilados.Isso é feito através da construção de bio-sensores celulares inteiros pela engenharia genética E.Coli que, após indução com glicanos específicos, respondem com um sinal fluorescente. O sinal fluorescente sob diferentes condições de indução, conforme analisado em um citômetro de fluxo, mostra mais de 100 vezes um aumento na fluorescência com o biosenso de 2'FL em comparação com o controle do vetor apenas ou o biosenso para 3'FL. Isso mostra a alta especificidade de ligação do biosenso.A sensibilidade do ensaio pode ser determinada gerando uma curva de resposta a doses com diferentes níveis de carboidratos. A faixa linear dinâmica de detecção de 2'FL, é vista entre 40 e 400 miligramas por litro e o limite de detecção é de quatro miligramas por litro. Este ensaio pode ser realizado ao longo de um dia de trabalho, como visto nas medições de snap shot da dinâmica da expressão do repórter.As células de biosensação podem ser usadas para detectar e quantificar 2'FL de uma cepa de produtor de 2'FL projetada usando uma série de estratégias para reduzir o sinal de lactose exógena de modo que o sinal lido corresponderia diretamente à concentração de 2'FL. Uma estratégia é degradar enzimaticamente a lactose usando uma galactosidase beta que não age sobre lactose modificada. Outra estratégia utilizou o etanol que não só precipita seletivamente a lactose, mas também lise as células produtoras, uma vez que a lise celular é um passo necessário para baixo do fluxo.Finalmente, o método mais eficaz, mas demorado, é a dotização e lavagem das células antes da lise celular para liberar o fl intracelular de 2'FL. Uma vez estabelecido esse método, conseguimos expandir o repertório de alvos oligossacarídeos usando diferentes enzimas. Atualmente, podemos detectar nove oligossacarídeos diferentes e estamos trabalhando em mais.Ao otimizar este ensaio, notamos que a robustez de nossas enzimas nos permitiu chegar a uma técnica que dá uma leitura específica de linkage em cerca de cinco minutos. Embora nenhum dos reagentes utilizados aqui seja particularmente perigoso, aqueles que utilizam este método devem seguir procedimentos padrão de risco biológico e bioconsínuo, incluindo o uso de EPI adequado.

Research

JoVE Journal

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Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...