Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Эта работа была поддержана средств запуска Айова государственного университета. Отвязка частично финансировалась NSF Trinect стипендий и Мэнли Hoppe профессора. T.J.M. был частично поддерживается Карен и Денни вон факультета стипендий. Авторы благодарят Айова государственного университета потока цитометрии фонда и W.M. Keck метаболомики научно-исследовательская лаборатория для помощи с флуоресценции и LC-MS исследования.

1. клетки культуры и индукции условия
Примечание: В следующих экспериментах, используются три штамма: E. coli BL21 (DE3) с пустой вектор, E. coli BL21 (DE3) с плазмид pAfcA14 и pET28:green флуоресцентный белок (КГВ) и E. coli BL21 (DE3) с плазмиды pAfcB14 и pET28:GFP. Все штаммы выращиваютс?...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

Мы представляем высок объём стратегию для выявления конкретных связей fucosylated олигосахаридов грудного молока. Это было достигнуто путем построения клеточных биодатчики, генетически инженерных E. coli , который после индукции с конкретными гликанов реагировать с флуоресцентного сиг?...

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются лактоза производные олигосахариды, обычно состоит из трех до восьми сахара мономеров. Они имеют лактозы (Гал β1, 4-Glc) уменьшение конец и далее вытянутые гликозидные связи (β-1,3 - или β-1,6-) глюкозы (КЗС), галактозу (Gal) или N-acetylglucosamine (GlcNAc). Кроме того Фукоза (ОФП, α-1,2 - или α-1,3-) или сиаловая кислота (Sia или NeuAc, α-2,3 - или α-2,6-) остатки часто добавляется1.
Текущий анализ олигосахаридов и других углеводов в пропускную способность и объем ограничен потребность хроматографии/масс-спектрометрии (МС) технология2,3,4,5, 6 , 7, который может занять примерно час образец, не говоря уже о необходимости дорогостоящего оборудования, специализированных столбцов и derivatizing агентов и специалистов по эксплуатации этого оборудования8. Олигосахариды связей особенно трудно определить, требующих передовых MS9,10 или методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР)11. Быстрая оптимизация синтеза этих олигосахариды ограничивается таким образом пропускная способность этой медленной аналитической шаг.
В этом исследовании, мы продемонстрировать связь конкретного выявления fucosylated Трисахариды лактозы основе поликлиниками, сосредоточив внимание на 2'-fucosyllactose (2'-FL), является наиболее распространенным HMO в человеческом молоке, с использованием генетически закодированный Escherichia coli клеточных Биосенсор с пределом обнаружения на 4 мг/л. Важной особенностью этой биодатчик является его способность различать изомерных Трисахариды. Принцип конструкции на основе выражения конкретных fucosidases в E. coli , освободить лактозы с поликлиниками, присутствие которых обнаруживается lac -оперона, который в свою очередь генерирует сигнал флуоресцентные. Мы добиться этого путем создания системы двух плазмиды, один укрывательство связь конкретных fucosidase и другой белок флуоресцентные репортер. Этот биодатчик платформа подходит для высокопроизводительного скрининга проточной цитометрии или микро плита читателя. Мы также демонстрируют использование биосенсор в количественном определении 2'-FL, производимые инженерии штамм12. В рамках этого исследования мы также представляем три стратегии на селективного удаления лактозы, что может привести к ложным положительный сигнал от биосенсор, учитывая, что штамм инженерии продюсер выращивается на лактозу.
Вместе взятые, генетически закодированный биодатчики позволяют нам выявлять и количественно HMOs связь конкретным образом, что трудно даже с хроматографического, MS, или ЯМР методами. Благодаря своей высокой пропускной способности и простоты использования этот метод должен иметь широкое применение в метаболический инжиниринг и синтез HMOs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются компонентами сложный углевод человеческого грудного молока, которые демонстрируют обильные преимущества детского здоровья. Однако оптимизации их биотехнологического синтеза ограничивается относительно низкую пропускную способность обнаружения и количественного определения моносахаридов и связей. Обычные методы анализа glycan включают хроматографии/масс спектрометрического методов с пропускной способностью порядка сотни образцов в день без автоматизации. Мы показываем здесь, генетически закодированный бактериальных биосенсора для высокой пропускной способности, связь конкретных обнаружения и количественного определения структур fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose и 3-fucosyllactose, которого мы достигли через гетерологичных выражение fucosidases. Как присутствие лактозы в молоке или в биотехнологических процессов может привести к ложным положительным результатам, мы также демонстрируют сокращение сигнала от лактозы, используя различные стратегии. Благодаря высокой пропускной способности этой техники много условий реакции или биореактор параметров может assayed параллельно в течение нескольких часов, что обеспечивает возможность оптимизации производства HMO.

Мы разработали клеточных биосенсора для 2' FL, который может использоваться в сочетании с биотехнологического производства олигосахариды. Это зависит от конкретных ферментативного расщепления изменения терминалов сахара генерации лактозы и тем самым активации lac </...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Мы опишем здесь высок объём обнаружения и количественного определения fucosylated олигосахаридов грудного молока (ОУМ) с помощью биосенсора поклеточного. Мы также демонстрируют здесь, адаптация этой платформы к анализу HMO производства штаммов, уделяя особое внимание улучшению соотношение сигнал-шум.

Анализ Трисахариды молока Fucosylated человека в биотехнологических контексте с использованием генетически закодированный биосенсоров

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Этот метод может помочь ответить на несколько ключевых вопросов, связанных с производством молока человека олигосахаридов. Во-первых, сколько продукта у меня есть? А во-вторых, какова конкретная углеводная связь?Цель здесь состоит в том, чтобы упростить и ускорить процесс количественной оценки и характеристики этих человеческих олигосахаридов молока. Этот метод имеет два преимущества по сравнению с современным состоянием. Во-первых, это подходят для высокой пропускной способности скрининга.Таким образом, вы можете себе представить тестирование тысяч различных условий или, возможно, даже библиотека ферментов синтеза в один день с помощью этой техники. Кроме того, он использует уникальную специфику субстрата, что природа развивалась в ферментах, чтобы дать нам информацию о углеводной связи этих олигосахаридов. Мы считаем, что этот метод может улучшить производство молока человека олигосахаридов, что, в свою очередь, может привести к улучшению качества детского питания, что более тесно имитирует грудное молоко человека и помочь закрыть разрыв между грудным вскармливанием и формулы кормили младенцев.Пользователь усмотрению рекомендуется при принятии решения о том, какой метод использовать для удаления лактозы на основе стоимости, пропускной способности и наличия оборудования. Следует позаботиться о оптимальном удалении лактозы. За день до эксперимента семена 5 миллилитров ЛБ среды дополнены канамицином и карбенициллином из свежей бактериальной колонии с использованием стерильных методов.Инкубировать все культуры ночь на 37 градусов по Цельсию с волнением. На следующий день, передача 50 микролитров ночной культуры в пять миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации LB M9 с канамицином и карбенициллином. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской, пока культура не достигла OD600 между нулевой точкой пять и ноль точки семь.Во-первых, перенесите ночные культуры в одну точку пять миллилитров труб и центрифуг в 12500 раз г в течение одной минуты. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в 500 микролитров 1x PBS, чтобы подготовить одноклеточную подвеску. Перенесите одноклеточную подвеску на факсы.Используйте цитометр потока для возбуждения GFP и сбора уровней флуоресценции FITC, как указано в текстовом протоколе. Чтобы сделать кривую калибровки, сделайте от 8 до 10 разбавлений стандартных 2'FL в диапазоне от нуля до 2500 миллиграммов на литр. Культура 2'FL био-зондирования клеток и вызвать их со стандартными разбавления, как указано в текстовом протоколе.Начните культуру 2'FL производства штамма в пяти миллилитров LB средств массовой информации и расти его в одночасье при 37 градусов по Цельсию. На следующий день субкультура на уровне 1%в 250 миллилитров подготовленных минимальных средств массовой информации и добавить глицерол в конечной концентрации 10 граммов на литр. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию, пока культура не достигнет и OD600 между нулевой точкой пять и ноль точки семь.Затем добавьте IPTG к окончательной концентрации нулевой точки пять миллимоляра и лактозы до конечной концентрации в два грамма на литр. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской в течение 24 часов. На следующий день перенесите ночную культуру на стерильные 50 миллилитровых трубок и центрифуг при 900 раз г в течение 15 минут.Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в деионизированной воде. Повторите это мыть три раза, чтобы удалить остатки лактозы. После этого повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров деионизированной воды.Поместите клетки на лед и используйте звуковой на 30% мощности в 30 секунд импульсов, чтобы подозировать подвеску клетки. Центрифуга лисированных клеток на 2000 раз г в течение 25 минут. Удалите супернатант и перейдите его через стерильный фильтр.Храните отфильтрованный супернатант при четырех градусах Цельсия до готовности к анализу. Далее, привить культуру 2'FL био-зондирования клеток. На фазе среднего журнала индуцировать клетки с лисями клетки в концентрациях, эквивалентных тем 2'FL, которые используются для калибровки кривой.Выполните калибровку, изложенную в текстовом протоколе. После этого запустите образцы на цитометре потока. Создайте кривую реакции дозы, наплантовив выход флуоресценции против концентрации олигосахарида и сравните реакцию стандартов на лизат клетки.Во-первых, растворить FL альфализе бета-галактозидазы до 1000 единиц на миллилитр в одном миллимолярный хлорид магния. Чтобы определить оптимальную концентрацию необходимого фермента, вырастите инокулум из 2'FL био-чувствуютых клеток и на фазе среднего журнала, индуцировать лактозой и 2'FL. К 100 культурам микролитров добавьте переменное количество бета-галактозидазы до 12 единиц.Пусть культуры растут в одночасье при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской. Измерьте флуоресценцию, описанную в текстовом протоколе, и рассчитайте оптимальные единицы фермента, необходимые для определения минимальной концентрации ферментов для достижения желаемого лечения сигнала. К 2'FL производящие клетки, выращенные в течение 24 часов, добавляют оптимальные единицы бета-галактозидазы и инкубируют на ночь при 37 градусах по Цельсию, определяют 2'FL titre, как описано ранее.Во-первых, начать 25 миллилитров культуры 2'FL производства штамма. После того, как штамм индуцируется в середине этапа журнала, инкубировать культуру при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Далее, привить E.coli BL21 культуры в LB СМИ.Вырастить его до середины журнала фазы на 37 градусов по Цельсию, а затем добавить 15 миллилитров этой культуры в 24 часа 2'FL культуры. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов. Затем определите титр 2'FL, как описано ранее.Для начала начните 25-миллилитровую культуру штамма 2'FL. После того, как штамм индуцируется в середине этапа журнала, инкубировать культуру на 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Добавить два тома 100% этанола в культуру и хорошо встряхнуть.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Затем центрифугировать подвеску при 900 раз г в течение 15 минут. Соберите супернатант и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию, чтобы вызвать лактозу.Перейдите раствор через фильтровальную бумагу, чтобы удалить осажденной лактозы. Соберите фильтрат, содержащий лизат клетки, и определите 2'FL titre, как описано ранее. В этом исследовании используется стратегия высокой пропускной способности для увязки конкретного обнаружения фукозилированного человеческого молока олигосахаридов.Это достигается путем создания целых клеточных биосенсоров с помощью генно-инженерной E.Coli, которая при индукции с конкретными гликанами реагирует флуоресцентным сигналом. Флуоресцентный сигнал в различных условиях индукции, проанализированный на цитометре потока, показывает более чем в 100 раз увеличение флуоресценции с био-сенсором 2'FL по сравнению с вектором только контроль или био-сенсор для 3'FL. Это свидетельствует о высокой специфичности связи био-датчика.Чувствительность анализа может быть определена путем генерации кривой реакции дозы с различными уровнями углеводов. Динамический линейный диапазон обнаружения 2'FL, как видно, между 40 и 400 миллиграммов на литр и предел обнаружения составляет четыре миллиграмма на литр. Этот анализ может быть проведен в течение рабочего дня, как видно из оснастки выстрел измерений динамики выражения репортера.Био-зондирования клетки могут быть использованы для обнаружения и количественной оценки 2'FL от инженерии 2'FL производитель штамма с использованием ряда стратегий для уменьшения сигнала от экзогенной лактозы, так что сигнал зачитал будет непосредственно соответствовать концентрации 2'FL. Одна из стратегий заключается в том, чтобы энзиматично деградировать лактозу с помощью бета-галактозидазы, которая не действует на модифицированную лактозу. Другая стратегия использовала этанол, который не только выборочно осаждает лактозу, но и лизает клетки-производители, так как лиз клеток является необходимым шагом вниз по течению.Наконец, наиболее эффективным, но трудоемким методом является гранулирование и мыть клетки до клеточного лиза, чтобы освободить внутриклеточный 2'FL. Как только мы установим этот метод, мы смогли расширить репертуар олигосахарида целей с использованием различных ферментов. В настоящее время мы можем обнаружить девять различных олигосахаридов, и мы работаем над более.При оптимизации этого анализа, мы заметили, надежность наших ферментов позволило нам придумать метод, который дает связь конкретных зачитал примерно за пять минут. Хотя ни один из реагентов, используемых здесь, не является особенно опасным, те, кто использует этот метод, должны следовать стандартным процедурам биоопасности и биоконтента, включая ношение надлежащего СИЗ.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Выборки и предварительной обработки эмали зубов карбонат для стабильной углерода и кислорода изотопный анализ

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...