Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Detta arbete stöds av Iowa State University Startup medel. F.E. finansierades delvis av NSF Trinect gemenskap och Manley Hoppe professur. T.J.M. var delvis stöds av Karen och Denny Vaughn fakulteten Fellowship. Författarna tackar Iowa State University Flow flödescytometri anläggningen och W.M. Keck metabolomik forskningslaboratorium för hjälp med fluorescens och LC-MS studier.

1. cell kultur och induktion villkor
Obs: I följande experiment, tre stammar används: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 och pET28:green fluorescerande protein (GFP), och E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 och pET28:GFP. Alla stammar odlas i Luria-Bertani buljong (LB) eller minimal media med lämplig antibiotika. Förbereda stamlösningar av 1000 x kanamycin (50 mg/mL) och carbenicillin (100 mg/m...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

Vi presenterar en hög genomströmning strategi för koppling-specifik detektion av fucosylated bröstmjölk oligosackarider. Detta uppnåddes genom att bygga hela cellen biosensorer genom att genetiskt konstruera E. coli som vid induktion med specifika glycans svara med en fluorescerande signal. Protokollet är också Detaljer om hur biosensor kan användas för att påvisa och kvantifiera HMOs i en metaboliskt bakåtkompilerade bakteriestam.
Våra protokoll erbjuder fördelar jämf?...

Bröstmjölk oligosackarider (HMOs) är laktos-derived oligosackarider, som oftast består av tre till åtta socker monomerer. De har en laktos (Gal-β1, 4-Glc) att minska slut och är ytterligare avlånga av glycosidic länkar (β-1,3 - eller β-1,6-) till glukos (Glc), galaktos (Gal) eller N-acetylglukosamin (GlcNAc). Dessutom fukos (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic acid (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) rester läggs ofta1.
Aktuell analys av oligosackarider och andra kolhydrater är begränsad i genomströmning och omfattningen av behovet av kromatografiska/massa spektrometriska (MS) teknik2,3,4,5, 6 , 7, vilket kan ta ungefär en timme per prov, att inte nämna behovet av dyrbar utrustning, specialiserade kolumner och derivatizing agenter och expertis på driften av denna utrustning8. Oligosackarid kopplingar är särskilt svår att fastställa, kräver avancerad MS9,10 eller kärnmagnetisk resonans (NMR) teknik11. Snabb optimering av syntes av dessa oligosackarider begränsas således av genomströmning av detta långsam analytiska steg.
I denna studie visar vi kopplingen-detektering av fucosylated trisaccharide laktos-baserade HMOs, med fokus på 2'-fucosyllactose (2'-FL) som är den vanligast förekommande HMO i bröstmjölk, använder en genetiskt kodade Escherichia coli hela cellen Biosensor med en detektionsgräns på 4 mg/L. Ett viktigt inslag i denna biosensor är dess förmåga att skilja mellan isomera trisackarider. Designprincipen är baserad på uttrycket av specifika fucosidases i E. coli som befria laktos från HMOs, vars förekomst upptäcks av den lac operon, som i sin tur genererar en fluorescerande signal. Detta uppnår vi genom att bygga en två-plasmid systemet, en härbärgerat den koppling-specifika fucosidase och den andra ett fluorescerande reporter protein. Denna biosensor plattform är lämplig för high-throughput screening av flödescytometri eller mikro-plate reader. Vi visar också utnyttjandet av biosensor kvantifiera 2'-FL produceras av en konstruerad stam12. Inom denna studie presenterar vi också tre strategier på selektiv borttagning av laktos som kan resultera i falskt positiv signal från biosensor, med tanke på att den bakåtkompilerade producent stammen odlas på laktos.
Sammantaget de genetiskt kodade biosensorer tillåter oss att upptäcka och kvantifiera HMOs i ett länkage-specifika sätt, vilket är svårt även med HPLC, MS, eller NMR tekniker. På grund av dess hög genomströmning och användarvänlighet, bör denna metod har omfattande program inom metabola verkstads- och syntes av HMOs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

Bröstmjölk oligosackarider (HMOs) är komplexa kolhydrater, komponenter av bröstmjölk som uppvisar rikliga fördelar på spädbarns hälsa. Optimering av deras bioteknologiska syntes begränsas emellertid av relativt låg genomströmning av detektering och kvantifiering av monosackarid och kopplingar. Konventionella tekniker av glykananalys inkluderar kromatografiska/massa-spektrometriska metoder med genomströmning storleksordningen hundratals prover per dag utan automatisering. Vi visar här, en genetiskt kodade bakteriell biosensor för hög genomströmning, koppling-specifika detektering och kvantifiering av fucosylated HMO strukturer, 2'-fucosyllactose och 3-fucosyllactose, som vi uppnått via heterologa uttryck för fucosidases. Eftersom förekomsten av laktos i mjölk eller i biotekniska processer kan leda till falsklarm, Visa vi också minskning av signalen från laktos med hjälp av olika strategier. På grund av hög genomströmning av denna teknik, kunde många reaktion villkor eller bioreaktor parametrar analyseras parallellt i några timmar, vilket möjliggör optimering av HMO tillverkning.

Vi har utformat en hel cell biosensor specifika för 2'-FL som kan användas i samband med bioteknisk produktion av oligosaccharide. Detta är beroende av specifik enzymatisk klyvning av ändra terminal sockerarter genererar laktos och därmed aktivering av de lac operon, leder till uttryck för en reporter fluorescerande protein under laktos inducerbara främjare, i proportion till den kvantitet av 2'-FL. För att demonstrera dess koppling särart, 3-fucosyllactose (3-FL), en is...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Vi beskriver här hög genomströmning detektering och kvantifiering av fucosylated bröstmjölk oligosackarider (HMOs) använder en hela-cell biosensor. Vi visar även här, anpassning av denna plattform mot analys av HMO produktion stammar, med fokus på att förbättra signal-brusförhållande.

Analys av Fucosylated mänskliga mjölk trisackarider i biotekniska sammanhang med genetiskt kodade biosensorer

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara flera viktiga frågor som är inblandade i produktionen av human mjölk oligosackarider. Först, hur mycket av produkten har jag? Och för det andra, vad är den specifika kolhydratlänkage?Målet här är att förenkla och påskynda processen för att kvantifiera och karakterisera dessa mänskliga mjölk oligosackarider. Denna metod har två fördelar jämfört med den aktuella tekniken. För det första är det mottagligt för screening med hög genomströmning.Så, du kan tänka dig att testa tusentals olika villkor eller kanske till och med ett bibliotek av syntesenzymer på en dag med hjälp av denna teknik. Dessutom använder den unika substrat specificitet som naturen har utvecklats i enzymer för att ge oss information om kolhydratlänkage av dessa oligosackarider. Vi tror att denna metod kan förbättra produktionen av bröstmjölk oligosackarider, vilket i sin tur kan leda till bättre kvalitet modersmjölksersättning som närmare efterliknar bröstmjölk och bidra till att minska klyftan mellan ammade och formel-fed spädbarn.Användar diskretion rekommenderas vid beslut om vilken metod som ska användas för laktos borttagning baserat på kostnad, genomströmning och utrustning tillgänglighet. Man bör se till att säkerställa optimal laktosborttagning. Dagen före experimentet, frö 5 milliliter lb medium kompletteras med kanamycin och karbaticillin från en färsk bakteriekoloni med hjälp av sterila tekniker.Inkubera alla kulturer över natten vid 37 grader Celsius med agitation. Nästa dag, överför 50 mikroliter av en övernattning kultur i fem milliliter färska LB M9 media med kanamycin och carbenicillin. Inkubera vid 37 grader Celsius med kontinuerlig skakning tills kulturen har nått en OD600 mellan nollpunkt fem och noll punkt sju.För det första överför du natten kulturer i en punkt fem milliliter rör och centrifug på 12, 500 gånger g i en minut. Kassera supernatanten och dra in pelleten på nytt i 500 mikroliter på 1x PBS för att förbereda en enda cellsuspension. Överför encellsupphängningen till faxrör.Använd en flödescytmeter för att excitera GFP och samla in FITC-fluorescensnivåer som de beskrivs i textprotokollet. För att göra en kalibreringskurva, gör åtta till 10 utspädningar av standarden 2'FL i intervallet mellan noll och 2500 milligram per liter. Odla 2'FL-bioavkänningscellerna och framkalla dem med standardutspädningarna enligt textprotokollet.Starta en kultur av en 2'FL producerar stam i fem milliliter LB media och odla den över natten på 37 grader Celsius. Nästa dag, subkultur på 1%i 250 milliliter av beredda minimal media och tillsätt glycerol till en slutlig koncentration av 10 gram per liter. Inkubera vid 37 grader Celsius tills kulturen når och OD600 mellan nollpunkt fem och nollpunkt sju.Lägg sedan till IPTG till en slutlig koncentration av nollpunkt fem millimolar och laktos till en slutlig koncentration på två gram per liter. Inkubera vid 37 grader Celsius med kontinuerlig skakning i 24 timmar. Nästa dag överför du övernattningskulturen till sterila 50 milliliterrör och centrifug vid 900 gånger g i 15 minuter.Kassera supernatanten och dra upp pelleten på ny lydelse i avjoniserat vatten. Upprepa denna tvätt tre gånger för att avlägsna eventuell kvarvarande laktos. Efter detta, åter upphäva pelleten i fem milliliter av avjoniserat vatten.Placera cellerna på is och använda en sonicator på 30%power i 30 sekunders pulser för att lysa cellen suspension. Centrifugera de lysade cellerna vid 2, 000 gånger g i 25 minuter. Ta bort supernatanten och för den genom ett sterilt filter.Förvara den filtrerade supernatanten i fyra grader Celsius tills den är redo att analysera. Därefter inokulera en kultur av 2'FL bio-sensing celler. Vid mitten av log-fasen, inducera cellerna med cellen lysate vid koncentrationer motsvarande den för de 2'FL som används för att göra kalibreringskurvan.Utför kalibreringen enligt textprotokollet. Efter detta, kör proverna på en flödescytometer. Generera en dos responskurva genom att rita fluorescensutgången mot oligosackaridkoncentrationen och jämför standards respons till cellen lysate.Först, lös FL alfalyserad beta galactosidase till 1, 000 enheter per milliliter i en millimolar magnesiumklorid. För att bestämma den optimala koncentrationen av enzymet som behövs, växa ett inokulat av 2'FL bio-sensing celler och i mitten av log-fasen, inducera med laktos och 2'FL. Till 100 microliter kulturer, lägga till variabla mängder beta galactosidase upp till 12 enheter.Låt kulturerna växa över natten vid 37 grader Celsius med kontinuerlig skakning. Mät fluorescensen enligt beskrivningen i textprotokollet och beräkna de optimala enzymenheter som behövs genom att bestämma den minsta enzymkoncentrationen för att uppnå önskad dämpning av signal. Till 2'FL producerar celler som odlas i 24 timmar lägga till de optimala enheterna av beta galactosidase och inkubera över natten vid 37 grader Celsius, bestämma 2'FL titer som tidigare beskrivits.Börja först en 25 milliliter kultur av en 2'FL producerar stam. När stammen induceras i mitten av log-fasen, inkubera kulturen vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Därefter inokulera en E.coli BL21 kultur i LB media.Odla den till mitten av log fas vid 37 grader Celsius sedan lägga till 15 milliliter av denna kultur till 24 timmars 2'FL kultur. Inkubera vid 37 grader Celsius i tre timmar. Sedan, bestämma 2'FL titer som tidigare beskrivits.Till att börja med starta en 25 milliliter kultur av en 2'FL producerar stam. När stammen framkallas i mitten av log-fasen, inkubera kulturen vid 37 grader celsius i 24 timmar. Tillsätt två volymer av 100%etanol till kulturen och skaka väl.Inkubera vid 37 grader Celsius i fyra timmar. Därefter centrifug suspensionen vid 900 gånger g i 15 minuter. Samla supernatanten och inkubera över natten vid fyra grader Celsius för att fälla laktosen.För lösningen genom filterpapper för att avlägsna den utfällda laktosen. Samla in filtratet som innehåller cellen lysate och bestämma 2'FL titer som tidigare beskrivits. I denna studie, en hög genomströmning strategi används för sammanlänkning specifik detektion av fucosylated human mjölk oligosackarider.Detta åstadkoms genom att bygga hela cellbio-sensorer genom genteknik E.Coli som vid induktion med specifika glyaner svarar med en fluorescerande signal. Den fluorescerande signalen under olika förhållanden av induktion som analyseras på ett flöde cytometer, visar över en 100 faldig ökning av fluorescens med 2'FL bio-sensor jämfört med vektorn endast kontroll eller bio-sensorn för 3'FL. Detta visar biosensorns höga länkningssär specificitet.Analysens känslighet kan bestämmas genom att generera en dosresponskurva med varierande kolhydratnivåer. Den dynamiska linjära räckvidd 2'FL upptäckt, ses vara mellan 40 och 400 milligram per liter och gränsen för upptäckt är fyra milligram per liter. Denna analys kan utföras under loppet av en arbetsdag som ses i snap shot mätningar av dynamiken i reporteruttryck.Bioavkänningscellerna kan användas för att detektera och kvantifiera 2'FL från en konstruerad 2'FL-producentstam med hjälp av ett antal strategier för att minska signalen från exogen laktos så att signalen som avläses direkt skulle motsvara 2'FL-koncentrationen. En strategi är att enzymatiskt bryta ned laktosen med hjälp av en betagalactosidase som inte verkar på modifierad laktos. En annan strategi utnyttjas etanol som inte bara selektivt fällningar laktos men också lyses producentcellerna eftersom celler lysis är ett nödvändigt steg ner ström.Slutligen är den mest effektiva men tidskrävande metoden att pelleta och tvätta cellerna före celllysen för att frigöra den intracellulära 2'FL. När vi väl har upprättat denna metod kunde vi expandera repertoaren av oligosackaridmål med hjälp av olika enzymer. För närvarande kan vi upptäcka nio olika oligosackarider och vi arbetar på mer.Samtidigt optimera denna analys, märkte vi robusthet våra enzymer tillät oss att komma med en teknik som ger en koppling specifik läsas upp i cirka fem minuter. Även om ingen av de reagenser som används här är särskilt farliga, bör de som använder denna metod följa standardförfaranden för biorisk och bioinneshållning inklusive att bära korrekt personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Provtagning och förbehandling av tandemaljen karbonat för stabil kol och syre isotoper analys

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snabb fluorescens-baserade karakterisering av enda extracellulär blåsor i människans blod med nanopartiklar-tracking analys

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stegvis doseringsprotokoll för ökat dataflöde i etikettfria Impedansbaserade GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...