Name: analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Bu eser Iowa State Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir. Fe kısmen NSF Trinect Bursu ve Manley Hoppe profesörlük tarafından finanse edildi. T.J.M. kısmen Karen ve Denny Vaughn öğretim bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Floresans ve LC-MS çalışmaları ile Iowa State Üniversitesi Akış Sitometresi tesis ve incelemelerinden Keck Metabolomics araştırma laboratuvarı yardım için teşekkür ederiz.

1. hücre kültür ve indüksiyon koşulları
Not: aşağıdaki deneyler üç suşlar kullanılır: E. coli BL21 (DE3) boş bir vektör, E. coli BL21 ile (DE3) plazmid pAfcA14 ve pET28:green floresan protein (GFP) ve E. coli BL21 ile (DE3) Plasmid'ler ile pAfcB14 ve pET28:GFP. Tüm suşların Luria-Bertani suyu (LB) veya en az medya uygun antibiyotikler ile yetiştirilen. 1000 x sefaloridin (50 mg/mL) ve carbenicillin (100 mg/mL) hisse senedi çö...

<ol>
	<li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome.">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li><li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry:+a+review+of+recent+developments.">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li><li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides.">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li><li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies.">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection.">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li><li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+(Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers).">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li><li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture.">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li><li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides.">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).</li><li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+(HMOs)+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity.">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li><li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy.">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li><li>Baumg&#228;rtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2&#8217;-fucosyllactose.">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2&#8217;-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li><li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development.">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939 (2016).</li><li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli.">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li></ol>

Biz insan sütü oligosakkaritler yüksek üretilen iş stratejisi fucosylated bağlantı özgü tespiti için mevcut. Bu genetik olarak E. coli , indüksiyon belirli glukanlardir ile floresan bir sinyal ile yanıt mühendislik tarafından tüm cep telefonu biyosensörler yapı tarafından gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı da nasıl Biyoalgılayıcı algılamak ve metabolik olarak tasarlanmış bir bakteriyel yük HMOs ölçmek için kullanılabilir Tarih ayrıntıları.
Biz...

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) genellikle 3-8 şeker monomerleri oluşan oligosakkaritler, laktoz kaynaklı vardır. Onlar bir Laktoz (Gal-β1, 4-Glc) sona azaltmak ve daha fazla glycosidic bağlantılarıyla uzamıştır (β-1,3 - veya β-1,6-) (Glc) glikoz, galaktoz (Gal) veya N-peptidoglikan (GlcNAc). Buna ek olarak, fucose (Fuc, α-1, 2 veya α 1,3-) veya sialik asit (SIA veya NeuAc, α-2, 3 veya α 2,6-) artıkları kez1eklendi.
Geçerli analiz oligosakkaritler ve diğer karbonhidratlar Kromatografik/kütle spektrometrik (MS) teknolojisi2,3,4,5, için ihtiyaç ile üretilen iş ve kapsam içinde sınırlıdır 6 , hangi-ebilmek almak kabaca 7, pahalı donanımları, özel sütun ve saptırma ajanlar ve uzmanlık Bu ekipman8operasyonunda bahsetmiyorum örnek başına bir saat. Oligosakkarit bağlantıları gerektiren Gelişmiş MS9,10 ya da Nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri11belirlemek, özellikle zordur. Bu oligosakkaritler sentezi hızlı optimizasyonu böylece bu yavaş analitik adım işlem hacmi ile sınırlıdır.
Bu çalışmada, biz fucosylated trisaccharide tespiti bağlantı özgü göstermek laktoz tabanlı HMOs 2'-insan sütte en bol HMO olan fucosyllactose (2'-FL) odaklanan, genetik olarak kodlanmış kullanarak Escherichia coli tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı bir sınırı olan 4 mg/l, algılama Bu Biyoalgılayıcı önemli bir özelliği isomeric trisaccharides arasında ayırt etmek için onun yetenek var. Tasarım prensibi varlığı hangi sırayla bir floresan sinyali üretir lac operon tarafından algılanır laktoz HMOs, üzerinden kurtarmak belirli fucosidases E. coli olarak ifade temel alır. Biz bunu bir bağlantı özgü fucosidase ve diğer bir floresan muhabir protein barındıran bir iki-plazmid sistemi kurarak başarmak. Bu Biyoalgılayıcı platform yüksek üretilen iş tarama Akış Sitometresi veya mikro-plaka okuyucu için uygundur. Biz de 2'-FL bir mühendislik zorlanma12tarafından üretilen miktarının içinde Biyoalgılayıcı kullanımını göstermektedir. Verilen bu mühendislik yapımcı zorlanma laktoz üzerinde yetiştirilen bu çalışma içinde biz da üç stratejileri Biyoalgılayıcı yanlış olumlu sinyal sonuçlanabilir laktoz seçici kaldırılması üzerinde mevcut.
Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış biyosensörler algılamak ve HMOs bile zor bir bağlantı özgü şekilde ölçmek için bize izin Kromatografik, MS veya NMR teknikleri. Onun yüksek işlem hacmi ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem yaygın uygulamalar metabolik Mühendisliği ve HMOs sentezi olmalıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">2&#8217;-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carbosynth&#160;</td>
			<td style="width:204px;">41263-94-9</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Fucosyllactose&#160;</td>
			<td>Carbosynth&#160;</td>
			<td>41312-47-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbenicillin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>FACSCanto Plus RUO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>1100 Series HPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC Column</td>
			<td>Luna</td>
			<td></td>
			<td>C18 reversed phase column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11815024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth, Miller&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64044-51-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9, Minimimal Salts, 5x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate, Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Mass Selective Trap SL detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fucosylated human milk trisaccharides in biotechnological context using genetically encoded biosensors

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) bebek sağlığı üzerinde bol yararları sorun oluşturan kompleks karbonhidrat bileşenleri insan anne sütü vardır. Ancak, onların Biyoteknolojik sentez duruma getirilmesi nispeten düşük akış verimi, algılama ve miktar yaşam ve bağlantıları sınırlıdır. Glycan analiz geleneksel teknikleri ile geçerek örnekleri otomasyon olmadan günde yüzlerce sırasına Kromatografik/kütle-spektrometrik yöntemleri içerir. Biz burada, yüksek işlem hacmi, bağlantı özel algılama ve miktar fucosylated HMO yapıları, 2'-fucosyllactose ve 3-fucosyllactose, biz Contegra yoluyla elde için genetik olarak kodlanmış bir bakteriyel Biyoalgılayıcı göstermek fucosidases ifadesidir. Laktoz süt veya Biyoteknolojik süreçler varlığı için yanlış pozitif neden olabilir gibi aynı zamanda farklı stratejiler kullanarak laktoz sinyal azalma göstermektedir. Bu teknik en yüksek üretimi nedeniyle, birçok reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametrelerini paralel HMO üretim optimizasyonu için izin saatlik bir konuda denetlesinler.

Biz tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı 2'-oligosakkarit Biyoteknolojik üretimi ile birlikte kullanılan FL için özel tasarlanmış. Bu terminal şekerler laktoz üreten değiştirmenin belirli enzimatik bölünme üzerinde dayanır ve böylece proportion için ifade bir Laktoz indüklenebilir organizatörü altında bir muhabir floresan proteinin önde gelen lac operon aktivasyonu 2'-FL miktarı Onun bağlantı özgüllük, 3-fucosyllactose (3-FL), bir izomer göstermek için...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors at JoVE.com

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Burada yüksek üretilen iş algılama ve fucosylated insan sütü oligosakkaritler (HMOs), tüm hücreli Biyoalgılayıcı kullanarak miktar açıklayın. Biz de burada, bu platform HMO üretim suşları, analizini doğru uyarlaması gürültü oranı sinyal geliştirmeye odaklanan göstermek.

Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Bu yöntem insan sütü oligosakkaritüretimi ile ilgili birkaç anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. İlk olarak, ürünün ne kadarı var? Ve ikincisi, spesifik karbonhidrat bağlantısı nedir?Burada amaç basitleştirmek ve bu insan sütü oligosakkaritler ölçme ve karakterize sürecini hızlandırmaktır. Bu yöntemin, geçerli son duruma göre iki avantajı vardır. İlk olarak, yüksek iş itimat taraması için uygun.Yani, binlerce farklı durumu ya da belki de bir sentez enzimleri kütüphanesini bir günde bu tekniği kullanarak test ettiğinizi hayal edebilirsiniz. Ayrıca, doğanın enzimlerde evrimleştiği eşsiz substrat özgüllüğünü kullanır ve bize bu oligosakkaritlerin karbonhidrat bağlantısı hakkında bilgi verir. Bu yöntemin insan sütü oligosakkaritüretimini artırabileceğine inanıyoruz, bu da insan anne sütünü daha yakından taklit eden ve anne sütüyle beslenen ve formülle beslenen bebekler arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olan daha kaliteli bebek formülüne yol açabilir.Maliyet, iş maliyeti ve ekipman kullanılabilirliğine bağlı olarak laktoz giderme için hangi yöntemin kullanılacağına karar verirken kullanıcı takdiri önerilir. En iyi laktoz giderilmesini sağlamaya özen dilmelidir. Deneyden bir gün önce, steril teknikler kullanarak taze bir bakteri kolonisinden kanamisin ve karbenicillin ile desteklenen 5 mililitre LB orta tohumu.Tüm kültürleri bir gecede 37 derecede ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kanamisin ve karbenicillin ile taze LB M9 medya beş mililitre içine bir gecede kültür 50 mikrolitre aktarın. Kültür sıfır noktası beş ve sıfır noktası yedi arasında bir OD600 ulaştı kadar sürekli sallayarak 37 santigrat derece kuluçka.İlk olarak, bir dakika için 12, 500 kez g bir nokta beş mililitre tüpler ve santrifüj içine gece kültürleri aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için 1x PBS'nin 500 mikrolitresinde eksnatantı atın ve peleti yeniden askıya alın. Tek hücreli süspansiyonu faks tüplerine aktarın.GFP'yi heyecanlandırmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi FITC floresan düzeylerini toplamak için bir akış sitometresi kullanın. Bir kalibrasyon eğrisi yapmak için, litre başına sıfır ve 2500 miligram arasında aralıkta standart 2'FL sekiz ila 10 seyreltme yapmak. Kültür 2'FL biyo-algılama hücreleri ve metin protokolünde belirtildiği gibi standart seyreltme ile onları ikna.LB medya beş mililitre bir 2'FL üreten bir kültür başlayın ve 37 santigrat derece bir gecede büyümek. Ertesi gün, hazırlanan minimal medya 250 mililitre% 1 alt kültür ve litre başına 10 gram son konsantrasyona gliserol ekleyin. Kültür ulaşana kadar 37 derecede kuluçkaya yat, oda600 ise sıfır noktası 5 ile sıfır noktası yedi arasında.Sonra litre başına iki gram son konsantrasyoniçin sıfır noktası beş milimolar ve laktoz son konsantrasyona IPTG ekleyin. 24 saat boyunca sürekli sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka. Ertesi gün, steril 50 mililitre tüpler ve santrifüj için 15 dakika boyunca 900 kez g gecede kültür aktarın.Supernatant atın ve deiyonize suda pelet yeniden askıya. Herhangi bir artık laktoz kaldırmak için bu yıkama üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, deiyonize su beş mililitre pelet yeniden askıya.Hücreleri buza yerleştirin ve hücre süspansiyonuna zar lamak için 30 saniyelik darbelerde %30 güçte bir sonicator kullanın. 25 dakika boyunca 2000 kez g lysed hücreleri santrifüj. Supernatant çıkarın ve steril bir filtre ile geçirin.Filtrelenmiş supernatant'ı analiz etmeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Sonra, 2'FL biyo-algılama hücrelerinin bir kültür aşılamak. Orta log aşamasında, kalibrasyon eğrisi yapmak için kullanılan bu 2'FL eşdeğer konsantrasyonlarda hücre lysate ile hücreleri indükler.Metin protokolünde belirtildiği gibi kalibrasyon gerçekleştirin. Bundan sonra, bir akış sitometre üzerinde örnekleri çalıştırın. Floresan çıktısını oligosakkarit konsantrasyonuna karşı çizerek bir doz yanıt eğrisi oluşturun ve standartların hücre lysate'sine verdiği yanıtı karşılaştırın.İlk olarak, fl alfalyzed beta galaktozidaz 1, 000 adet mililitre başına bir milimolar magnezyum klorür. Gerekli enzim optimum konsantrasyonu belirlemek için, 2'FL biyo-algılama hücrelerinin bir inoculum büyümek ve orta günlük aşamasında, laktoz ve 2'FL ile indüklemek. 100 mikrolitre lik kültürlere, 12 üniteye kadar değişken miktarda beta galaktosidaz ekleyin.Kültürler sürekli sallayarak 37 santigrat derece bir gecede büyümeye izin verin. Metin protokolünde açıklandığı gibi floresan ölçün ve sinyalin istenilen zayıflamasını elde etmek için minimum enzim konsantrasyonunu belirleyerek gerekli enzimin optimum birimlerini hesaplayın. 2'FL üreten hücreler için 24 saat boyunca beta galaktosidaz optimum birimleri ekleyin ve 37 santigrat derece gecede inkübat, daha önce açıklandığı gibi 2'FL titre belirlemek.İlk olarak, 2'FL üreten bir suş 25 mililitrelik bir kültür başlar. Suşun orta günlük evresinde indüklenmesinden sonra, kültürü 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. Ardından, LB medyada bir E.coli BL21 kültürünü aşılatın.37 santigrat derece orta günlük aşamasına büyümek sonra 24 saat 2'FL kültüre bu kültürün 15 mililitre ekleyin. 3saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi 2'FL titre belirleyin.Başlamak için, 2'FL üreten bir suş 25 mililitrelik bir kültür başlar. Suşun orta günlük evresinde indüklenmesinden sonra, kültürü 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. Kültüre %100 etanol iki cilt ekleyin ve iyice sallayın.4 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra süspansiyonu 900 kez g'de 15 dakika santrifüj edin. Laktozu çökeltmek için supernatant ve inkübat gece boyunca dört santigrat derece toplamak.Çökelmiş laktozu çıkarmak için çözeltiyi filtre kağıdından geçirin. Hücre lisatını içeren filtratı toplayın ve daha önce açıklandığı gibi 2'FL titresini belirleyin. Bu çalışmada fukozilen insan sütü oligosakkaritlerinin bağlantıya özgü tespiti için yüksek iş elde li bir strateji kullanılmıştır.Bu genetik mühendislik E.Coli tarafından tüm hücre biyo-sensörleri inşa ederek gerçekleştirilir, belirli glikanlar ile indüksiyon üzerine, bir floresan sinyali ile yanıt. Bir akış sitometre üzerinde analiz olarak indüksiyon farklı koşullar altında floresan sinyal, vektör sadece kontrol veya 3'FL için biyo-sensör ile karşılaştırıldığında 2'FL biyo-sensör ile floresan 100 kat artış gösterir. Bu biyo-sensör yüksek bağlantı özgüllüğünü gösterir.Talın hassasiyeti değişen karbonhidrat düzeyleri ile bir doz yanıt eğrisi oluşturarak belirlenebilir. 2'FL algılama dinamik doğrusal aralığı, litre başına 40 ve 400 miligram arasında olduğu görülmektedir ve algılama sınırı litre başına dört miligram. Bu titre, muhabir ifade dinamiklerinin anlık çekim ölçümlerinde görüldüğü gibi bir iş günü boyunca yapılabilir.Biyo-algılama hücreleri tespit etmek ve sinyal okumak böylece sinyal doğrudan 2'FL konsantrasyonu karşılık gelecek şekilde eksojen laktoz sinyal azaltmak için stratejiler bir dizi kullanarak mühendislik 2'FL üretici suşu 2'FL ölçmek için kullanılabilir. Bir strateji enzimatik modifiye laktoz üzerinde hareket etmez bir beta galaktoziaz kullanarak laktoz düşürmek tir. Başka bir strateji de laktozu seçici olarak çökeltmekle kalmamış, aynı zamanda hücre lisisi akışaşağı doğru gerekli bir adım olduğu için üretici hücrelerini de etkileyen etanol kullanılmıştır.Son olarak, en etkili ama zaman alıcı yöntem pelet ve hücre içi 2'FL serbest bırakmak için hücre lisis önce hücreleri yıkamaktır. Bu yöntemi oluşturduktan sonra, farklı enzimler kullanarak oligosakkarit hedeflerinin repertuarını genişletmeyi başardık. Şu anda, dokuz farklı oligosakkarit tespit edebilirsiniz ve daha fazla üzerinde çalışıyoruz.Bu analizi optimize ederken, enzimlerimizin sağlamlığının, yaklaşık beş dakika içinde belirli bir bağlantı okuması sağlayan bir teknik üretmesini sağladığını fark ettik. Burada kullanılan reaktiflerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamasına rağmen, bu yöntemi kullananlar uygun PPE takmak da dahil olmak üzere standart biyolojik tehlike ve biyolojik koruma prosedürlerini izlemelidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Örnekleme ve diş minesini Önarıtma kararlı karbon ve oksijen izotop analizi için karbonat

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...