Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

وينوه المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة IGERT-0903715)، وجامعة يوتا (منحة بذور الهندسة الكيميائية وجائزة زمالة بحوث الدراسات العليا)، ومعهد سكولكوفو للعلوم والتكنولوجيا (زمالة سكولتيك).

1. عزل المركبات الكهربائية من السوائل الحيوية
<ol><li>عزل المركبات الكهربائية بإحدى الطرق المعمول بها، مثل التفاضل الفائقجداً 8، هطول الأمطار، أو الكروماتوغرافيا ذات الاستبعاد الكبير9.</li>
	<li>تأكيد وجود العلامات الحيوية السطحية والقطنية المتوقعة وعدم وجو?...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

إن تجميد المركبات الكهربائية من سائل بيولوجي، ومسح سطحي، وتحليل الصور هي الخطوات الأساسية للبروتوكول المطور لتوصيف AFM للمركبات الكهربائية في السائل. عدد الحويصلات القابلة لموازين التصوير AFM مع المساحة السطحية المصورة والتركيز السطحي للحويصلات المعطلة على الركيزة. نظرا لإمكانات زيتا ال?...

توجد الحويصلات خارج الخلية (EVs) في جميع سوائل الجسم، بما في ذلك الدم والبول واللعاب والحليب والسائل السلوي. تشكل Exosomes فئة منطقة من المركبات الكهربائية المتمايزة عن المركبات الكهربائية الأخرى عن طريق التكوين الحيوي الأنبي، وعلامات المسار الأنبي، وأصغر حجم بين جميع المركبات الكهربائية. وكثيرا ً ما يتم الإبلاغ عن حجم الاكسوسوسوم مع تباين كبير بين الدراسات. تم العثور على نتائج التحجيم لتكون تعتمد على طريقة، مما يعكس الفرق في المبادئ المادية المستخدمة من قبل تقنيات تحليلية مختلفة لتقدير أحجام EV1،2. على سبيل المثال، يقدر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) - وهو تقنية توصيف الحجم الأكثر استخداماً - حجم المركبات الكهربائية كأقطار هاديدينامية، والتي تميز مقاومة حركة البراونيان للمركبات الكهربائية في الحل. قطر هيدرودينامي أكبر من الحويصلة ينطوي على انخفاض حركتها في السائل. الطبقة الإكليلية حول الحويصلات، تتكون من البروتينات السطحية والجزيئات الأخرى الراسية أو الممتزة على سطح الغشاء، تعيق إلى حد كبير التنقل وتزيد من الحجم الهيدرودينامي للمركبات الكهربائية. ومن الناحية النسبية، فإن هذه الزيادة كبيرة بشكل خاص بالنسبة للإكسوسوم3، كما هو موضح في الشكل 1.
التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (CRYO-TEM) هو تقنية نهائية في تحديد أحجام الحويصلات ومورفولوجيا في حالاتها المرطبة. ومع ذلك، فإن التكلفة العالية للأجهزة والخبرة المتخصصة اللازمة لاستخدامها بشكل صحيح تحفيز استكشاف التقنيات البديلة التي يمكن أن تصور المركبات الكهربائية رطب. وهناك عدد صغير نسبيا من المركبات الكهربائية التي لوحظت أو تتميز في الصور المكتسبة بالتبريد TEM هو عيب ملحوظ آخر من هذه التقنية.
تصور مجهرية القوة الذرية (AFM) الطوبوغرافيا ثلاثية الأبعاد للمركبات الكهربائية المرطبة أو المجففة4و5و6عن طريق مسح مسبار عبر الركيزة لتنقيط صورة الجسيمات على السطح. وترد في هذه الدراسة الخطوات الأساسية للبروتوكول الذي يميز المركبات الكهربائية من جانب AFM. قبل تصوير الحويصلات في السائل، يجب أن تكون معطلة على الركيزة إما عن طريق الربط إلى سطح وظيفي، ومحاصرة في مرشح، أو عن طريق الجذب الكهروستاتيكي7. التثبيت الكهروستاتيكي على الركيزة المشحونة بشكل إيجابي هو خيار مناسب بشكل خاص لشل من exosomes المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية. ومع ذلك، فإن نفس القوى الكهروستاتيكية التي تعطل الحويصلات خارج الخلية على السطح تشوه أيضا شكلها، مما يجعل تحليل البيانات بعد التصوير ضروريًا. نقوم بتفصيل هذه النقطة من خلال وصف الخوارزمية التي تقدر حجم الحويصلات الكروية في الحل استناداً إلى بيانات AFM على الشكل المشوه للاكسوسوم اتّبأ على السطح.
في البروتوكول المطور، يتم عرض إجراء تجميد الحويصلات الكهروستاتيكي القوي، وتليه الخطوات اللازمة لإجراء تصوير القوة الذرية في الدول المرطبة أو المجففة. يتم تحديد العوامل التي تؤثر على التركيز السطحي للحويصلات المعطلة. وتُعطى الإرشادات بشأن كيفية إجراء عملية التعطيل الكهروستاتيكي للعينات ذات التركيزات المختلفة للمركبات الكهربائية في الحل. ويناقش اختيار الظروف التجريبية التي تسمح بتقدير توزيعات الاحتمالات التجريبية لمختلف الخصائص البيوفيزيائية استنادا إلى عدد كبير بما فيه الكفاية من الحويصلات المعطلة. وترد أمثلة على تحليل ما بعد التصوير لبيانات AFM. وعلى وجه التحديد، يتم وصف خوارزمية لتحديد حجم الحويصلات في الحل استناداً إلى توصيف AFM للمركبات الكهربائية المعطلة. وتظهر النتائج التمثيلية اتساق التحجيم الحويصلة من قبل AFM مع نتائج التصوير بالتبريد TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

إكسوسومات وغيرها من الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المجمعات الجزيئية تتكون من حويصلة غشاء الدهون، والديكور السطحي من قبل بروتينات الغشاء والجزيئات الأخرى، والمحتوى الإنارة المتنوعة الموروثة من الخلية الأم، والتي تشمل RNAs، البروتينات، وDNAs. وقد أصبح توصيف الأحجام الهيدرودينامية للمركبات الكهربائية، الذي يعتمد على حجم الحويصلة وطبقته الإكليلية التي تشكلها الزخارف السطحية، أمرا روتينيا. بالنسبة للاكسوسوسوم، أصغر المركبات الكهربائية، الفرق النسبي بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلات كبير. ولا يزال توصيف أحجام الحويصلات بواسطة التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (cryo-TEM)، وهو تقنية قياسية ذهبية، يشكل تحدياً بسبب تكلفة الأداة، والخبرة المطلوبة لإجراء إعداد العينة، والتصوير، و تحليل البيانات، وعدد قليل من الجسيمات التي غالبا ما لوحظت في الصور. وثمة بديل متاح على نطاق واسع ويمكن الوصول إليه هو الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)، الذي يمكن أن ينتج بيانات متعددة الاستخدامات عن الهندسة ثلاثية الأبعاد، والحجم، وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية للحويصلات خارج الخلية. ويرشد البروتوكول المطور المستخدمين في استخدام هذه الأداة التحليلية ويحدد سير العمل لتحليل المركبات الكهربائية من قبل AFM، والذي يتضمن إعداد عينة لتصوير المركبات الكهربائية في شكل رطب أو المجففة، والجمود الكهروستاتيكي لل الحويصلات على الركيزة، والحصول على البيانات، وتحليلها، والتفسير. وتبين النتائج التمثيلية أن تثبيت المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل يمكن التنبؤ به، ويمكن تخصيصه، ويسمح للمستخدم بالحصول على نتائج تغيير الحجم لعدد كبير من الحويصلات. وقد تبين أن تغيير حجم الحويصلة استنادا إلى بيانات AFM يتسق مع التصوير بالتبريد- TEM.

تثبيت سطح المركبات الكهربائية هو خطوة حاسمة في تسلسل التصوير. سوف يحدث تجميد السطح الكهروستاتيكي من exosomes، المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية، بقوة بعد تعديل الركيزة الميكا أن يكون لها شحنة سطح إيجابية. دون العلاج مع NiCl2 لنقل التغيرات السطحية الإيجابية، تم العثور على تجميد المركبات...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لشل الحركة الخالية من الملصقات من الحويصلات الخارجية والحويصلات خارج الخلية من العينات السائلة وتصويرها عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). وتستخدم الصور AFM لتقدير حجم الحويصلات في الحل وتميز الخصائص البيوفيزيائية الأخرى.

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

يحدد هذا البروتوكول الإعداد البسيط لتصوير AFM للحويصلات خارج الخلية في أشكال رطبة ومهيئة ، وجمودها الكهروستاتيكي ، ومسح السطح ، وتحديد الهوية ، وتحليل البيانات وتفسيرها. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التثبيت الكهربائي الملائم للحويصلات على سطح الجلد وتحليل التصوير بعد ذلك لحساب تشوه الشكل الناجم عن الجمود. نتائج الحويصلات التي تم الحصول عليها تحجيم تتفق مع التصوير المبرد القياسي الذهبي الذي لا يزال تقنية مكلفة وصعبة.إذا كنت مستخدمًا جديدًا لـ AFM ، فبدأ بتوصيف العينات الجافة قبل الانتقال إلى عينات رطبة. لأن هناك العديد من العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على حيازة عينة رطبة. للبدء، عزل العوائل خارج الخلية من السائل الحيوي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.المقبل، ربط بحزم قرص الميكا إلى قرص عينة الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسي. اضم القرص الميكا باستخدام شفرة حادة لفضح طبقة جديدة من المواد. في درجة حرارة الغرفة، علاج السطح العلوي من الميكا لمدة عشر ثوان مع مائة لتر صغير من عشرة مللي ميل النيكل الثاني محلول كلوريد.هذا بتعديل شحنة السطح من السلبية إلى الإيجابية. لطخة حل كلوريد النيكل الثاني مع مسح الوبر الحرة أو ورقة النشاف. ثم، وغسل سطح الميكا ثلاث مرات مع المياه الأيونية وتجفيفه مع تيار من النيتروجين الجاف.ضع قرص العينة AFM مع الميكا السطحي المرفق المعدل في طبق بتري. بعد ذلك ، تمييع الاكسوسومات مع PBS للحصول على تركيز بين أربعة وأربعين مليار جسيمات لكل ملليلتر من الحل. التحقق من صحة تركيز الجسيمات المخففة باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية.شكل قطرة sessile على سطح الميكا عن طريق إفراغ 100 ميكرولترات من محلول الكوسوم المخفف من ماصة. ثم ضع الغطاء على طبق بتري وختمه مع فيلم parafen للحد من تبخر العينة. احتضان في الثلاجة لمدة اثنتي عشرة ساعة.بعد الحضانة ، تتبخر 80 إلى 90 في المئة من العينة بعناية دون إزعاج السطح. عند هذه النقطة، سوف تكون الاحتياطات الكهربائية شلت كهربائيا على الركيزة الميكا. عند تصوير العينات المائية، شطف السطح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.الحرص على الحفاظ على رطوبة العينة طوال عملية الشطف. بعد غسل سطح الميكا مع برنامج تلفزيوني، وإزالة 80 إلى 90 في المئة من السائل والماصات أربعين microlits من برنامج تلفزيوني الطازجة لتغطية العينة. العينة المرطبة جاهزة للتصوير.عند تصوير EV المجفف، قم بإزالة الأملاح من السطح عن طريق شطف الركيزة ثلاث مرات بالماء غير المتأين. بعد التعرق أكبر قدر ممكن من السائل، دون لمس السطح، وتجفيف بقية مع تيار من النيتروجين الجاف. لتصوير حويصلات خارج الخلية المجففة، حدد cantilever مصممة لمسح في الهواء في وضعيات التصوير التلامسية وغير اللاصقة وقم بتركيبها على حامل المسبار.ضع العينة على مرحلة AFM. سوف القرص عينة الفولاذ المقاوم للصدأ المغناطيسي شل العينة على خشبة المسرح. ضع حامل المسبار في AFM.السماح بالوقت للتحضير والمرحلة لتكسير حراريا. استخدم وضع التنصت لمسح منطقة 5x5 ميكرون منقوطة في 512 خطوط بمعدل مسح واحد هيرتز. الحصول على كل من الطول ومرحلة الصور لأنها توفر معلومات مجانية عن التضاريس وخصائص سطح العينة.سوف يزيد وقت المسح الضوئي مع مساحة صور وعدد الخطوط المحددة لتشكيل الصورة، ولكن مع انخفاض معدل المسح الضوئي. بما أن معدلات المسح السريع قد تؤثر على جودة الصورة، يجب أن تكون سرعة المسح الضوئي توازنًا بين وقت الاكتساب وجودة الصورة. لصورة حويصلات رطبة، حدد cantilever المناسبة لمسح عينات ناعمة ورطبة وقم بتركيب الـ cantilever على حامل مسبار مصمم للمسح الضوئي في السوائل.الرطب غيض من cantilever مع برنامج تلفزيوني للحد من احتمال إدخال فقاعات الهواء إلى السائل أثناء المسح الضوئي. ثم، قم بشل العينة على مرحلة AFM. مرة واحدة في العينة توازن حراريا، صورة سطح الميكا رطب في وضع التنصت.الحصول على كل من الطول ومرحلة الصور. لتحليل الصور المُتَخَذة، انتقل أولاً إلى أوضاع معالجة البيانات'select SPM، متبوعة بـ تلميح'، واختر تلميح النموذج'حدد الشكل الهندسي وأبعاد التلميح المستخدم لمسح العينة وانقر OK'تصحيح التحف الخاصة بتآكل التلميح عن طريق تنفيذ إعادة بناء السطح. افتح الصورة.من القائمة، حدد معالجة البيانات'اخص أوضاع SPM متبوعة بـ تلميح'ث اختر إعادة بناء السطح'، ثم انقر فوق OK'Next، حدد معالجة البيانات، متبوعاً بالمستوى'، ثم اختر مستوى المستوى لمحاذاة مستوى التصوير ولمطابقة مستوى XY الخاص بالمختبر عن طريق إزالة الميل في الركيزة من بيانات المسح الضوئي. محاذاة الصفوف في الصورة عن طريق تحديد عملية البيانات'تليها البيانات الصحيحة'، ثم اختر محاذاة الصفوف'خيارات المحاذاة المتعددة متوفرة بما في ذلك الوسيط الذي هو خوارزمية التي تبحث عن متوسط ارتفاع كل خط مسح ويطرحه من البيانات. بعد ذلك، انتقل إلى عملية البيانات'تليها البيانات الصحيحة'، ثم اختر إزالة الندوب'سيؤدي هذا إلى إزالة أخطاء المسح الشائعة المعروفة باسم Scars'to محاذاة سطح الميكا عند ارتفاع الصفر، انتقل إلى قائمة معالجة البيانات وحدد محاذاة القاعدة'في القائمة مستوى'إسقاط لأسفل.تحديد الحويصلات الخلوية الإضافية على السطح الممسوح ضوئياً من خلال الذهاب إلى قائمة Grains'وباستخدام علامة بواسطة Threshold'تحدد هذه الخوارزمية السطح الذي تم تعطيله كجسيمات تبرز من الركيزة السطحية الصفرية بارتفاع أعلى من العتبة المحددة من قبل المستخدم. حدد عتبة في النطاق بين نانومتر واحد وثلاثة نانومتر. هذا سيقضي على معظم التدخل الأرضي الخلفي.وأخيرا، تنفيذ توصيف هندسي والأبعاد من حويصلات محددة باستخدام خوارزميات التوزيعات المتاحة التي يمكن الوصول إليها من قائمة Grains'. تصدير البيانات AFM من Gwyddion لتحليل متخصص من قبل أدوات حسابية أخرى وبرامج الكمبيوتر المخصصة. يؤدي تعديل سطح كلوريد النيكل إلى شلّ الخلايا الزائدة التي تعتمد على الوقت.تركيز السطح من الحويصلات غير مُشلّس مفرط الكثافة بعد 24 ساعة من الحضانة في حين أن الحضانة 12 ساعة تؤدي إلى عدد أقل من الظفسات وبيانات المسح الضوئي التي يسهل تحليلها بدقة. تُظهر هذه الصورة AFM هيدرات MCF7 إكسوزومات كهربائية غير ثابتة على سطح الميكا المعدل. إن الصورة المقابلة لمرحلة AFM تؤكد أن الحبوب في صورة الارتفاع هي جزيئات نانوية ناعمة كما يجب أن يتوقعها غشاء الغشاء.تظهر بيانات الارتفاع لثلاث شعونات على طول نفس الخط هنا. توضح هذه الملامح شكلًا مسطّحًا بسبب جاذبية الإكسوسومات الكهروستاتيكية إلى سطح الشحن الإيجابي للميكا المعدلة. تشويه الشكل واضح في عرض تكبير من vesicle شل الحركة والقسم العرضي لها.لتقدير حجم كروي من الاحجام في الحل، على يمكن أن تتطابق مع وحدات التخزين المغلقة من قبل سطح مشلة ومغلفات الغشاء كروية. تم تحديد حجم توزيع العويصلات في الحل من بيانات AFM من 561 من العويصلات غير المُعاقة. أحجام الحويّات في صور CryoTEM تتفق مع نتائج AFM.قبل تصوير الـ هضّامات الهدّام، من المهم أن تتذكر أن تشطف السطح بدقة مع برنامج تلفزيوني. هذا سوف إزالة exosomes الواردة ومنع تعلقها إلى طرف AFM. عند تصوير الاحضاجات المجففة، تأكد من استخدام المياه DI ليرتفع الركيزة.غسل DI منع تشكيل بلورات الملح على السطح كما يجف الركيزة. إذا كان موجودا، بلورات الملح سيجعل معالجة الصور مهمة صعبة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...