Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Forfatterne anerkender finansiel støtte fra National Science Foundation (Award nummer IGERT-0903715), University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant og graduate Research Fellowship Award), og Skolkovo Institute of Science og teknologi (Skoltech Fellowship).

1. isolering af evt fra en biofluid
<ol><li>Isoler evt ved en af de etablerede metoder, såsom differentiale ultracentrifugering8, nedbør eller størrelses udelukkelses kromatografi9.</li>
	<li>Bekræft tilstedeværelsen af forventede overflade-og luminale biomarkører og fraværet af biomarkører, der indikerer krydskontaminering af præparatet. Bekræft lipid-tolags morfologi af de isolerede partikler ved elektronmikroskopi. Bemærk: ved isolering a...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

Immobilisering af evt fra en biologisk væske, overflade scanning, og billedanalyse er de vigtigste trin i den udviklede protokol for AFM karakterisering af EVs i flydende. Antallet af vesikler, som er modtagelige for AFM-billedbehandlings skalaer, med det afbildet overfladeareal og vesikles overflade koncentration, som er immobiliseret på substratet. I betragtning af et negativt zeta-potentiale for EVS og exosomerne18, anbefaler vi elektrostatisk fiksering af evt fra flydende prøver til AFM-sub...

Ekstracellulære vesikler (EVs) er til stede i alle kropsvæsker, herunder blod, urin, spyt, mælk og Foster væsken. Exosomer udgør en distrikts klasse af EVs, der er differentieret fra andre EVs ved endosomal Biogenesis, markører for endosomal pathway og den mindste størrelse blandt alle evt. Størrelsen af exosomer rapporteres ofte med betydelig variation mellem undersøgelserne. Størrelses resultaterne blev fundet at være metode afhængige, hvilket afspejler forskellen i fysiske principper anvendt af forskellige analytiske teknikker til at estimere EV-størrelserne1,2. For eksempel, nanopartikel tracking Analysis (NTA)-den mest udbredte størrelse karakterisering teknik-anslår størrelsen af EVs som deres hydrodynamiske diametre, som karakteriserer modstanden mod den brune mobilitet af EVs i opløsningen. En større Hydrodynamisk diameter af en vesikel indebærer sin lavere mobilitet i væske. Det koronale lag omkring vesikler, der består af overflade proteiner og andre molekyler, der er forankret eller adsorbet til membran overfladen, hæmmer mobiliteten betydeligt og øger den hydrodynamiske størrelse af EVs. I relative tal er denne stigning særlig stor for exosomerne3, som illustreret i figur 1.
Kryogen transmission Electron mikroskopi (Cryo-tem) Imaging er en definitiv teknik til karakterisering af vesikle størrelser og morfologi i deres hydrerede tilstande. Men de høje omkostninger ved instrumentering og den specialiserede ekspertise, der er nødvendige for at bruge det korrekt motivere udforskning af alternative teknikker, der kan billed hydreret EVs. Et relativt lille antal af evt observeret eller karakteriseret i de erhvervede Cryo-TEM billeder er en anden bemærkelsesværdig ulempe ved denne teknik.
Atomkraften mikroskopi (AFM) visualiserer den tredimensionale topografi af hydreret eller udtørret EVS4,5,6 ved at scanne en sonde over substratet til rasterbilledet af partiklerne på overfladen. De vigtigste skridt i protokollen til at karakterisere evt ved AFM er skitseret i denne undersøgelse. Før billeddannelse af vesikler i væske, skal de være immobiliseret på et substrat ved enten tethering til en funktionaliseret overflade, fældefangst i et filter, eller ved elektrostatisk tiltrækning7. Den elektrostatiske fiksering på et positivt ladet substrat er en særlig bekvem mulighed for immobilisering af exosomer kendt for at have en negativ zeta potentiale. Men de samme elektrostatiske kræfter, der immobiliserer de ekstracellulære vesikler på overfladen også forvrænge deres form, hvilket gør post-Imaging dataanalyse afgørende. Vi uddyber dette punkt ved at beskrive algoritmen, der anslår størrelsen af de globulære vesikler i opløsningen baseret på AFM data på den forvrængede form af exosomerne immobiliseret på overfladen.
I den udviklede protokol, er proceduren for den robuste elektrostatiske immobilisering af vesikler præsenteret og efterfulgt af de skridt, der er nødvendige for at udføre atomkraften billeddannelse i de hydrerede eller udtørrede stater. De faktorer, der påvirker overfladekoncentrationen af de immobiliserede vesikler, identificeres. Vejledningen er givet om, hvordan man udfører den elektrostatiske immobilisering for prøver med forskellige koncentrationer af EVs i opløsningen. Udvælgelsen af eksperimentelle betingelser, der gør det muligt at anslå empiriske sandsynlighedsfordelinger af forskellige Biofysisk egenskaber, der er baseret på et tilstrækkeligt stort antal immobiliserede vesikler, drøftes. Der gives eksempler på analyse af AFM-data efter billeddannelse. Specifikt beskrives en algoritme til bestemmelse af størrelsen af vesikler i opløsningen baseret på AFM-karakteriseringen af immobiliseret evt. De repræsentative resultater viser konsistensen af vesikel dimensionering med AFM med resultaterne af Cryo-TEM Imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomer og andre ekstracellulære vesikler (EVs) er molekylære komplekser bestående af en lipidmembran vesikel, dens overflade dekoration af membran proteiner og andre molekyler, og forskelligt luminale indhold nedarvet fra en forælder celle, som omfatter RNAs, proteiner og DNAs. Karakteriseringen af de hydrodynamiske størrelser af EVs, som afhænger af størrelsen af vesikel og dens koronal lag dannet af overflade dekorationer, er blevet rutine. For exosomer, den mindste af EVs, den relative forskel mellem de hydrodynamiske og vesikler størrelser er signifikant. Karakteriseringen af vesikler størrelser ved den kryogene transmission elektronmikroskopi (Cryo-TEM) Imaging, en guld standard teknik, er fortsat en udfordring på grund af omkostningerne ved instrumentet, den ekspertise, der kræves for at udføre prøven forberedelse, billeddannelse og dataanalyse og et lille antal partikler, der ofte observeres i billeder. Et alment tilgængeligt og tilgængeligt alternativ er atomkraften mikroskopi (AFM), som kan producere alsidige data om tredimensionel geometri, størrelse og andre biofysiske egenskaber af ekstracellulære vesikler. Den udviklede protokol vejleder brugerne i at udnytte dette analytiske værktøj og skitserer arbejdsprocessen til analyse af evt af AFM, som omfatter prøveforberedelse til billeddannelse EVs i hydreret eller udtørret form, den elektrostatiske immobilisering af vesikler på et substrat, dataopsamling, analyse og tolkning. De repræsentative resultater viser, at optagelsen af evt på den modificerede glimmer flade er forudsigelig, kan tilpasses, og giver brugeren mulighed for at opnå størrelses resultater for et stort antal vesikler. Vesikel dimensionering baseret på AFM data blev fundet at være i overensstemmelse med Cryo-TEM Imaging.

Overflade fiksering af EVs er et kritisk skridt i billedsekvensen. Elektrostatisk overflade immobilisering af exosomer, kendt for at have en negativ zeta potentiale, vil robust forekomme efter at micas substrat er modificeret til at have en positiv overflade opladning. Uden behandling med NiCl2 for at give positive overflade ændringer, blev immobilisering af evt på substratet fundet ineffektiv. Højde billedet i figur 10a, erhvervet i luften efter MCF-7 exosomvesikler prøve ind...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

En trin-for-trin procedure er beskrevet for label-fri immobilisering af exosomer og ekstracellulære vesikler fra flydende prøver og deres billeddannelse ved atomkraften mikroskopi (AFM). AFM-billederne anvendes til at estimere størrelsen af vesikler i opløsningen og karakterisere andre biofysiske egenskaber.

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Denne protokol skitserer enkel forberedelse til AFM-billeddannelse af ekstracellulære vesikler i hydrerede og udtørrede former, deres elektrostatiske immobilisering, overfladescanning, vesical identifikation og dataanalyse og fortolkning. Den største fordel ved denne teknik er den bekvemme elektrostatiske fiksering af vesikler på hudens overflade og post billeddannelse analyse for at tage højde for form forvrængning forårsaget af immobilisering. De opnåede vesikler dimensioneringsresultater er i overensstemmelse med Gold Standard CryoTEM Imaging, som forbliver dyre og udfordrende teknik.Hvis du er en ny AFM bruger, begynde med karakterisering af tørre prøver, før du fortsætter til hydreret prøver. Fordi der er mange yderligere faktorer, der kan påvirke hydreret prøve erhvervelse. Til at begynde, isolere ekstracellulære vesikler fra en bio-væske som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol.Dernæst fastgør en glimmerskive fast på en magnetisk prøveskive i rustfrit stål. Kløve glimmer disken ved hjælp af en skarp barbermaskine til at udsætte et nyt lag af materiale. Ved stuetemperatur behandles glimmers overflade i ti sekunder med hundrede mikro-liter af en ti millimolar nikkel II kloridopløsning.Dette ændrer overfladens ladning fra negativ til positiv. Blot nikkel II klorid opløsning med en fnug fri tør eller blotting papir. Vask derefter glimmeroverfladen tre gange med deioniseret vand og tør den med en strøm af tørt nitrogen.Afm-prøveskiven anbringes med den vedlagte overflade, der er modificeret glimmer, i en petriskål. Dernæst fortyndes exosomerne med PBS for at opnå en koncentration mellem fire og 40 milliarder partikler pr. milliliter opløsning. Valider den fortyndede partikelkoncentration ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse.Form en sessile dråbe på overfladen af glimmer ved at tømme hundrede mikroliter af den fortyndede exosole opløsning fra en pipette. Derefter placere låget på petriskålen og forsegle det med parafen film for at reducere prøve fordampning. Inkuberes i køleskabet i 12 timer.Efter inkubation, aspirere 80 til 90 procent af prøven omhyggeligt uden at forstyrre overfladen. På dette tidspunkt vil exosomer være elektrostatisk immobiliseret på glimmer substrat. Når der skal afsendes hydrerede prøver, skylles overfladen tre gange med PBS.Pas på at holde prøven hydreret under hele skylningsprocessen. Efter vask af glimmeroverfladen med PBS fjernes 80 til 90 % af væsken og pipettens 40 mikroliter af frisk PBS for at dække prøven. Den hydrerede prøve er klar til billedbehandling.Når du billedker de udtørrede EV'er, fjernes saltene fra overfladen ved at skylle underlaget tre gange med deioniseret vand. Efter at have aspireret så meget væske som muligt, uden at røre overfladen, tør resten med en strøm af tørt nitrogen. For at afbilde de udtørrede ekstracellulære vesikler skal du vælge en cantilever, der er beregnet til scanning i luften ved at trykke på og være ikke-kontakt-billeddannelsestilstande, og montere den på sondeholderen.Anskaf prøven på AFM-stadiet. Den magnetiske skive af rustfrit stål vil immobilisere prøven på scenen. Sæt sondeholderen i AFM.Giv tid til præparatet og scenen til at ligevægte termisk. Brug tappetilstanden til at scanne et område, der er 5x5 mikron rastered i 512 linjer med en scanning sats på en hertz. Anskære både højde- og fasebillederne, da de giver gratis oplysninger om prøvens topografi og overfladeegenskaber.Scanningstiden øges med et afbildet område og antallet af linjer, der er valgt til at danne billedet, men reduceres med scanningshastigheden. Da hurtige scanningshastigheder kan påvirke billedkvaliteten, bør hastigheden af rastering være en balance mellem anskaffelsestid og billedkvalitet. For at afbilde hydrerede vesikler skal du vælge en cantilever, der er egnet til scanning af bløde, hydrerede prøver, og monter cantilever på en sondeholder, der er designet til scanning i væsker.Våd spidsen af cantilever med PBS at reducere sandsynligheden for at indføre luftbobler til væsken under scanning. Derefter immobilisere prøven på AFM fase. Når prøven termisk ækvilibrer, billede den hydrerede glimmer overflade i trykke tilstand.Ansk af både højde- og fasebilleder. Hvis du vil analysere de billeder, der er taget, skal du først gå til Dataprocessens udvalgte SPM-tilstande efterfulgt af Tip', og vælg Modeltip'Vælg geometrien og dimensionerne på den spids, der bruges til at scanne prøven, og klik på OK'Ret tiperosionsartefakterne ved at udføre overfladerekonstruktionen. Åbn billedet.I menuen skal du vælge Dataproces', og vælg derefter SPM-tilstande'efterfulgt af Tip', og vælg derefter Surface Reconstruction', og klik på OK'Næste, vælg Dataproces efterfulgt af Niveau', og vælg Planniveau'for at justere billedplanet og tilpasse laboratoriets XY-plan ved at fjerne hældningen i substratet fra scanningsdataene. Juster rækker i billedet ved at vælge Dataproces'efterfulgt af Correct Data', og vælg derefter Juster rækker'Flere justeringsindstillinger er tilgængelige, herunder median, som er en algoritme, der finder en gennemsnitlig højde for hver scanningslinje og trækker den fra dataene. Gå derefter til Dataproces'efterfulgt af Correct Data', og vælg Fjern ar'Dette fjerner almindelige scanningsfejl kaldet Scars'To align the glimmeroverfladen i nulhøjden, gå til menuen Dataproces og vælg Samkopier base'i menuen Level'drop down.Identificer de ekstra cellulære vesikler på den scannede overflade ved at gå til Grains'menu og bruge Mark by Threshold'Denne algoritme identificerer overflade immobiliserede exosomer som partikler stikker ud fra nul overflade substrat ved højden over brugerens valgte tærskel. Vælg en tærskel i intervallet mellem et og tre nanometer. Dette vil fjerne det meste af ryggen jorden interferens.Endelig udføre geometriske og dimensionelle karakterisering af de identificerede vesikler ved hjælp af de tilgængelige distributioner algoritmer tilgængelige fra Grains'menu. Eksporter AFM-data fra Gwyddion til specialiseret analyse af andre beregningsværktøjer og brugerdefinerede computerprogrammer. Den nikkelchlorid overflade modifikation resulterer i en immobilisering af ekstra cellulære vesikler, der er tid afhængig.Overfladekoncentrationen af de immobiliserede vesikler er alt for tæt efter 24 timers inkubation, mens 12 timers inkubation fører til færre exosomer og scanne data, der er lettere at analysere præcist. Dette AFM billede viser hydreret MCF7 exosomer elektrostatisk immobiliseret på den modificerede glimmer overflade. Det tilsvarende AFM fasebillede bekræfter, at kornene i højdebilledet er bløde nanopartikler, som det bør forventes for membranblæsere.Højdedataene for tre vesikler langs samme linje vises her. Disse profiler illustrerer en flad form forårsaget af den elektrostatiske tiltrækning af exosomer til den positivt lade overflade af den modificerede glimmer. Formen forvrængning er tydelig i et forstørret billede af den immobiliserede vesicle og dens tværsnit.For at vurdere den kugleformede størrelse af exosomer i opløsningen, på kan matche de mængder, der er omgivet af overfladen immobiliseret og sfærisk membran kuverter. Størrelsesfordelingen af kugleformede vesikler i opløsningen blev bestemt ud fra AFM-data fra 561 immobiliserede vesikler. De vesicle størrelser i CryoTEM billeder er i overensstemmelse med AFM resultater.Før du billedker hyrdrated exosomer, er det vigtigt at huske at grundigt skylle overfladen med PBS. Dette vil fjerne indgående exosomer og forhindre deres tilknytning til AFM tip. Når billeddannelse de udtørrede exosomer, skal du sørge for at bruge DI vand til at stige substratet.DI vask vil forhindre dannelsen af salt krystaller på overfladen som substratet tørrer. Hvis til stede, vil salt krystaller gøre billedbehandling en vanskelig opgave.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid væv farves med selvlysende konjugeret Oligothiophenes af Hyperspectral Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Hurtig fluorescens-baserede karakterisering af enkelt ekstracellulære vesikler i humant blod med nanopartikler-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondrier og Endoplasmic reticulum Imaging af Korrelativ lys og volumen elektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimering af flowcytometriske sorteringsparametre til high-throughput isolering og oprensning af små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...