Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

De auteurs erkennen financiële steun van de National Science Foundation (Award Number IGERT-0903715), de Universiteit van Utah (afdeling Chemical Engineering Seed Grant en de Graduate Research Fellowship Award), en Skolkovo Institute of Science en technologie (Skoltech Fellowship).

1. isolatie van EVs uit een biovloeistof
<ol><li>Isoleer EVs door een van de vastgestelde methoden, zoals de differentiële ultracentrifugatie8, precipitatie of grootte-uitsluitings chromatografie9.</li>
	<li>Bevestig de aanwezigheid van de verwachte oppervlakte-en Luminale biomarkers en de afwezigheid van biomarkers die kruisbesmetting van het preparaat aangeven. Bevestig de morfologie van de lipide-dubbelgelaagde van de geïsoleerde deeltjes met elektro...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

De immobilisatie van EVs uit een biologische vloeistof, oppervlakte scanning en beeldanalyse zijn de essentiële stappen van het ontwikkelde protocol voor de AFM-karakterisering van Ev's in vloeistof. Het aantal blaasjes vatbaar voor AFM beeld schalen met het oppervlak van de afbeelding en de oppervlakte concentratie van de blaasjes geïmmobiliseerd op het substraat. Gezien een negatief Zeta-potentieel van ev's en exosomen18, pleiten we voor elektrostatische fixatie van EVS van vloeibare monsters ...

Extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, urine, speeksel, melk en het vruchtwater. Exosomes vormen een districts klasse van EVs, onderscheiden van andere EVs door endosomale biogenese, de markers van het endosomale traject en de kleinste grootte onder alle Ev's. De grootte van exosomen wordt vaak gerapporteerd met een aanzienlijke variabiliteit tussen studies. De dimensionerings resultaten bleken methode afhankelijk te zijn, wat het verschil in fysische principes weerspiegelt dat door verschillende analytische technieken wordt gebruikt om de EV-grootten1,2teschatten. De nanodeeltjes Tracking Analysis (NTA)-de meest gebruikte maat karakterisatie techniek-schat de grootte van EVS als hun hydrodynamische diameters, die kenmerkend zijn voor de weerstand tegen de Brownische mobiliteit van EVS in de oplossing. Een grotere hydrodynamische diameter van een vesikel impliceert zijn lagere mobiliteit in vloeistof. De coronale laag rond blaasjes, bestaande uit oppervlakte eiwitten en andere moleculen die aan het membraanoppervlak zijn verankerd of geadsord, belemmert de mobiliteit aanzienlijk en vergroot de hydrodynamische grootte van Ev's. In relatieve termen is deze toename bijzonder groot voor de exosomen3, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
De cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming is een definitieve techniek in het karakteriseren van blaasje maten en morfologie in hun gehydrateerde toestanden. Echter, de hoge kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde expertise die nodig zijn om het correct te gebruiken motiveren de verkenning van alternatieve technieken die kunnen beeld gehydrateerd EVs. Een relatief klein aantal EVs waargenomen of gekarakteriseerd in de verworven cryo-TEM beelden is een ander opmerkelijk nadeel van deze techniek.
Atomaire kracht microscopie (AFM) visualiseert de driedimensionale topografie van gehydrateerde of gedroogde ev's4,5,6 door een sonde over het substraat te scannen om het beeld van de deeltjes op het oppervlak te rasterlen. De essentiële stappen van het protocol om EVs door de AFM te karakteriseren, worden in deze studie uiteengezet. Voordat de blaasjes in vloeistof worden gevisualiseerd, moeten ze worden geïmmobiliseerd op een substraat door ofwel Tethering aan een Gefunctionaliseerde oppervlak, overvulling in een filter, of door elektrostatische aantrekkingskracht7. De elektrostatische fixatie op een positief geladen substraat is een bijzonder handige optie voor immobilisatie van exosomen waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben. Echter, dezelfde elektrostatische krachten die de extracellulaire blaasjes op het oppervlak immobiliseren, verstoren ook hun vorm, wat post-Imaging data-analyse essentieel maakt. We hebben dit punt uitgewerkt door het algoritme te beschrijven dat de grootte van de bolvormige blaasjes in de oplossing schat op basis van de gegevens van de AFM over de vervormde vorm van de exosomen geïmmobiliseerd op het oppervlak.
In het ontwikkelde protocol wordt de procedure voor de robuuste elektrostatische immobilisatie van blaasjes gepresenteerd en gevolgd door de stappen die nodig zijn om atoom kracht imaging in de gehydrateerde of drooghoudende toestanden uit te voeren. De factoren die invloed hebben op de oppervlakte concentratie van de geïmmobiliseerde blaasjes worden geïdentificeerd. De leiding wordt gegeven over het uitvoeren van de elektrostatische immobilisatie voor monsters met verschillende concentraties van EVs in de oplossing. De selectie van experimentele omstandigheden die de raming van empirische kansverdelingen van verschillende biofysische eigenschappen, gebaseerd op een voldoende groot aantal geïmmobiliseerde blaasjes, wordt besproken. Voorbeelden van post-Imaging analyse van de AFM-gegevens worden gegeven. Specifiek, een algoritme wordt beschreven voor het bepalen van de grootte van blaasjes in de oplossing op basis van de AFM karakterisatie van geïmmobiliseerde EVs. De representatieve resultaten tonen de consistentie van de blaasje dimensionering door de AFM met de resultaten van cryo-TEM Imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomen en andere extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn moleculaire complexen bestaande uit een vesikel van het lipide membraan, de oppervlakte-inrichting door membraan eiwitten en andere moleculen, en diverse Luminale inhoud geërfd van een bovenliggende cel, waaronder Rna's, eiwitten en Dna's. De karakterisering van de hydrodynamische maten van EVs, die afhangt van de grootte van het vesikel en de coronale laag gevormd door oppervlakte decoraties, is routine geworden. Voor exosomen, de kleinste van EVS, is het relatieve verschil tussen de hydrodynamische en blaasjes maten significant. De karakterisering van blaasjes-maten door de cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming, een gouden standaardtechniek, blijft een uitdaging als gevolg van de kosten van het instrument, de expertise die nodig is om de monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse en een klein aantal deeltjes die vaak in beelden worden waargenomen. Een algemeen beschikbaar en toegankelijk alternatief is de atomaire kracht microscopie (AFM), die veelzijdige gegevens kan produceren over driedimensionale geometrie, grootte en andere biofysische eigenschappen van extracellulaire blaasjes. Het ontwikkelde protocol begeleidt de gebruikers bij het gebruik van deze analytische tool en schetst de workflow voor de analyse van EVs door de AFM, die de monstervoorbereiding voor beeldvormings EVs in gehydrateerde of gedroogde vorm omvat, de elektrostatische immobilisatie van blaasjes op een substraat, data-acquisitie, analyse en interpretatie. De representatieve resultaten tonen aan dat de fixatie van EVs op het gemodificeerde mica-oppervlak voorspelbaar, aanpasbaar is en de gebruiker in staat stelt om dimensionerings resultaten te verkrijgen voor een groot aantal blaasjes. De blaasje dimensionering op basis van de AFM gegevens bleek consistent te zijn met de cryo-TEM Imaging.

De oppervlakte fixatie van EVs is een kritieke stap in de beeldvormings sequentie. Elektrostatische oppervlakte immobilisatie van exosomen, waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben, zal robuust optreden nadat het substraat van mica is aangepast om een positieve oppervlakte lading te hebben. Zonder de behandeling met NiCl2 om positieve oppervlakte veranderingen uit te voeren, bleek de immobilisatie van EVS op het substraat ineffectief te zijn. Het hoogte plaatje in afbee...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Een stapsgewijze procedure wordt beschreven voor het label vrij immobilisatie van exosomen en extracellulaire blaasjes uit vloeibare monsters en hun beeldvorming door Atoom kracht microscopie (AFM). De AFM-beelden worden gebruikt om de grootte van de blaasjes in de oplossing te schatten en andere biofysische eigenschappen te karakteriseren.

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Dit protocol schetst een eenvoudige voorbereiding voor afm-beeldvorming van extracellulaire vikjes in gehydrateerde en uitgedroogde vormen, hun elektrostatische immobilisatie, oppervlaktescanning, vesicale identificatie en gegevensanalyse en -interpretatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de handige elektrostatische fixatie van vesicles op het huidoppervlak en de post-imaging analyse om rekening te houden met vormvervorming veroorzaakt door immobilisatie. De verkregen vesicles dimensionering resultaten komen overeen met de Gold Standard CryoTEM Imaging die blijft dure en uitdagende techniek.Als u een nieuwe AFM-gebruiker bent, begint u met de karakterisering van droge monsters voordat u overgaat tot gehydrateerde monsters. Omdat er tal van extra factoren die van invloed kunnen zijn gehydrateerde monster verwerving. Om te beginnen isoleer extracellulaire vikjes van een biovloeistof zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Bevestig vervolgens stevig een micaschijf aan een magnetische roestvrijstalen monsterschijf. Maak de micaschijf met behulp van een scherp scheermes om een nieuwe laag materiaal bloot te leggen. Behandel het bovenste oppervlak van mica tien seconden met honderd microliter van een tien millimolar nikkel II chlorideoplossing.Dit wijzigt de lading van het oppervlak van negatief naar positief. Dep de nikkel II chlorideoplossing met een pluisvrij doekje of blottingpapier. Was vervolgens het micaoppervlak drie keer met gedeïsized water en droog het met een stroom droge stikstof.Plaats de AFM-monsterschijf met het bijgevoegde oppervlak gemodificeerde mica in een petrischaal. Verdun vervolgens de exosomen met PBS om een concentratie te verkrijgen tussen de vier en veertig miljard deeltjes per milliliter oplossing. Valideer de verdunde deeltjesconcentratie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse.Vorm een sessile druppel op het oppervlak van de mica door het legen van honderd microliter van de verdunde exosoom oplossing van een pipet. Plaats vervolgens het deksel op de petrischaal en verzegel het met parafenfilm om monsterverdamping te verminderen. Broed je twaalf uur in de koelkast.Na incubatie, 80 tot 90 procent van het monster zorgvuldig aanzuigen zonder het oppervlak te verstoren. Op dit punt worden de exosomen elektrotisch geïmmobiliseerd op het mica-substraat. Bij beeldvorming gehydrateerde monsters, spoel het oppervlak drie keer met PBS.Zorg ervoor dat het monster gehydrateerd te houden tijdens het spoelproces. Na het wassen van het micaoppervlak met PBS, verwijder 80 tot 90 procent van de vloeistof en pipette veertig microliters van verse PBS om het monster te dekken. Het gehydrateerde monster is klaar voor beeldvorming.Bij het beeldvorming van de uitgedroogde EV's, verwijder de zouten van het oppervlak door het spoelen van het substraat drie keer met gedeïsized water. Na het aspirating zoveel mogelijk vloeistof, zonder het oppervlak aan te raken, droog de rest met een stroom van droge stikstof. Als u de uitgedroogde extracellulaire vieltjes wiltafbeeldingen, selecteert u een cantilever die is ontworpen voor het scannen in de lucht in tikkende en contactloze beeldvormende modi en monteer deze op de sondehouder.Plaats het monster op het AFM-podium. De magnetische roestvrijstalen monsterschijf zal het monster op het podium immobiliseren. Plaats de sondehouder in de AFM.Laat de tijd voor de voorbereiding en het podium thermisch teeven. Gebruik de tikmodus om een gebied te scannen dat 5x5 micron is gerasterd in 512-lijnen met een scansnelheid van één hertz. Verwerf zowel de hoogte- als faseafbeeldingen, omdat ze gratis informatie geven over de topografie en de oppervlakte-eigenschappen van het monster.De scantijd neemt toe met een afgebeeld gebied en het aantal lijnen dat is geselecteerd om de afbeelding te vormen, maar neemt af met de scansnelheid. Aangezien snelle scansnelheden van invloed kunnen zijn op de beeldkwaliteit, moet de snelheid van rasteren een evenwicht zijn tussen de aanschaftijd en de beeldkwaliteit. Als u gehydrateerde akeltjes wiltafbeeldingen, selecteert u een cantilever die geschikt is voor het scannen van zachte, gehydrateerde monsters en monteer u de cantilever op een sondehouder die is ontworpen voor het scannen in vloeistoffen.Maak de punt van de cantilever nat met PBS om de kans op het introduceren van luchtbellen in de vloeistof tijdens het scannen te verminderen. Immobiliseer het monster vervolgens op het AFM-podium. Zodra het monster thermisch in evenwicht is, beeldt u het gehydrateerde micaoppervlak in de tikmodus.Verkrijg zowel de hoogte- als faseafbeeldingen. Als u de genomen afbeeldingen wilt analyseren, gaat u eerst naar de geselecteerde SPM-modi van het gegevensproces, gevolgd door Tip'en kies Modeltip'Selecteer de geometrie en de afmetingen van de tip die wordt gebruikt om het monster te scannen en klik op OK'Corrigeer de artefacten van de tiperosie door de oppervlaktereconstructie uit te voeren. Open de afbeelding.Selecteer in het menu Gegevensproces en selecteer vervolgens SPM-modi', gevolgd door Tip' en kies vervolgens Surface Reconstruction'en klik op OK'Next, selecteer Gegevensproces, gevolgd door Niveau'en kies Vlakniveau'om het beeldvlak uit te lijnen en het XY-vlak van het laboratorium af te stemmen door de kanteling in het substraat uit de scangegevens te verwijderen. Lijn rijen in de afbeelding uit door Gegevensproces'gevolgd door Correcte gegevens' te selecteren en kies vervolgens Rijen uitlijnen'Er zijn verschillende uitlijningsopties beschikbaar, waaronder mediaan, een algoritme dat een gemiddelde hoogte van elke scanregel vindt en aftrek van de gegevens. Ga vervolgens naar Gegevensproces'gevolgd door Correcte gegevens'en kies Littekens verwijderen'Dit verwijdert veelvoorkomende scanfouten die bekend staan als Scars'Als u het mica-oppervlak op nulhoogte wilt uitlijnen, gaat u naar het menu Gegevensproces en selecteert u Base afvlakken in het vervolgkeuzemenu Niveau.Identificeer de extra cellulaire azingjes op het gescande oppervlak door naar het menu van de korrels te gaan en Mark by Threshold'Dit algoritme identificeert oppervlaktegeïmmobiliseerde exosomen als deeltjes die uit het nuloppervlakteubstraat uitsteken door de hoogte boven de door de gebruiker geselecteerde drempelwaarde. Selecteer een drempelwaarde in het bereik tussen één en drie nanometer. Dit elimineert het grootste deel van de achtergrond interferentie.Ten slotte voert u geometrische en dimensionale karakterisering van de geïdentificeerde vikjes uit met behulp van de beschikbare distributiealgoritmen die toegankelijk zijn via het menu Korrels. Exporteer de AFM-gegevens van Gwyddion voor gespecialiseerde analyse door andere rekentools en aangepaste computerprogramma's. De wijziging van het nikkelchlorideoppervlak resulteert in een immobilisatie van extra cellulaire akelige akelige die tijdsafhankelijk is.De oppervlakteconcentratie van de geïmmobiliseerde adereilanden is te dicht na 24 uur incubatie, terwijl de 12-uurs incubatie leidt tot minder exosomen en scangegevens die gemakkelijker nauwkeurig te analyseren zijn. Dit AFM-beeld toont gehydrateerde MCF7 exosomen elektrostatisch geïmmobiliseerd op het gemodificeerde mica-oppervlak. Het bijbehorende AFM-fasebeeld bevestigt dat de korrels in het hoogtebeeld zachte nanodeeltjes zijn, zoals verwacht voor membraanveikels.De hoogtegegevens voor drie vesicles langs dezelfde lijn worden hier weergegeven. Deze profielen illustreren een afgeplatte vorm veroorzaakt door de elektrostatische aantrekkingskracht van exosomen op het positief laadoppervlak van de gemodificeerde mica. De vormvervorming is zichtbaar in een vergroot beeld van de geïmmobiliseerde blaas en de dwarsdoorsnede.Om de bolvormige grootte van de exosomen in de oplossing te schatten, kan het overeenkomen met de volumes die zijn ingesloten door oppervlaktegeïmmobiliseerde en bolvormige membraanenveloppen. De grootteverdeling van bolvormige vikjes in de oplossing werd bepaald aan de hand van de AFM-gegevens van 561 geïmmobiliseerde vesikels. De vesicle maten in CryoTEM beelden komen overeen met de AFM resultaten.Voordat de hyrdrated exosomen worden gebeeldhed, is het belangrijk om te onthouden om het oppervlak grondig af te spoelen met PBS. Hierdoor worden inkomende exosomen verwijderd en wordt voorkomen dat ze gehecht zijn aan de AFM-tip. Bij het beeldvorming van de uitgedroogde exosomen, moet u DI-water gebruiken om het substraat te laten stijgen.De DI-was voorkomt de vorming van zoutkristallen op het oppervlak als het substraat droogt. Indien aanwezig, zal zoutkristallen beeldverwerking een moeilijke taak maken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...