Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la National Science Foundation (numéro iGERT-0903715), de l'Université de l'Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant et du Graduate Research Fellowship Award) et du Skolkovo Institute of Science et la technologie (Skoltech Fellowship).

1. Isolement des véhicules électriques d'un biofluide
<ol><li>Isoler les véhicules électriques par l'une des méthodes établies, telles que l'ultracentrifugation différentielle8, précipitations, ou chromatographie de taille-exclusion9.</li>
	<li>Confirmer la présence de biomarqueurs de surface et de lumière attendus et l'absence de biomarqueurs indiquant une contamination croisée de la préparation. Confirmer la morphologie bicouche lipidique de...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

L'immobilisation des véhicules électriques à partir d'un fluide biologique, d'un balayage de surface et d'une analyse d'image sont les étapes essentielles du protocole élaboré pour la caractérisation des véhicules électriques par aFM en liquide. Le nombre de vésicules propices aux échelles d'imagerie AFM avec la surface imageetée et la concentration de surface des vésicules immobilisées sur le substrat. Compte tenu d'un potentiel zeta négatif des véhicules électriques et des exosomes18,...

Les vésicules extracellulaires (VE) sont présentes dans tous les liquides organiques, y compris le sang, l'urine, la salive, le lait et le liquide amniotique. Les exosomes forment une classe de district d'EV différenciés des autres véhicules électriques par la biogenèse endosomale, les marqueurs de la voie endosomal, et la plus petite taille parmi tous les véhicules électriques. La taille des exosomes est souvent rapportée avec une variabilité substantielle entre les études. Les résultats de dimensionnement ont été jugés dépendants de la méthode, reflétant la différence dans les principes physiques utilisés par différentes techniques analytiques pour estimer les tailles EV1,2. Par exemple, l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA), la technique de caractérisation de la taille la plus utilisée, estime la taille des véhicules électriques comme leurs diamètres hydrodynamiques, qui caractérisent la résistance à la mobilité Brownienne des véhicules électriques dans la solution. Un diamètre hydrodynamique plus grand d'une vésicule implique sa mobilité plus faible en liquide. La couche coronale autour des vésicules, composée de protéines de surface et d'autres molécules ancrées ou adsorbées à la surface de la membrane, entrave considérablement la mobilité et augmente la taille hydrodynamique des véhicules électriques. En termes relatifs, cette augmentation est particulièrement importante pour les exosomes3, comme l'illustre la figure 1.
L'imagerie par électron de transmission cryogénique (cryo-TEM) est une technique définitive pour caractériser la taille et la morphologie des vésicules dans leurs états hydratés. Cependant, le coût élevé de l'instrumentation et l'expertise spécialisée nécessaire pour l'utiliser correctement motivent l'exploration de techniques alternatives qui peuvent image hydratée EV. Un nombre relativement faible d'EV observés ou caractérisés dans les images cryo-TEM acquises est un autre inconvénient notable de cette technique.
La microscopie par force atomique (AFM) visualise la topographie tridimensionnelle des véhicules électriques hydratés ou desséchés4,5,6 en scannant une sonde à travers le substrat pour raster l'image des particules à la surface. Les étapes essentielles du protocole pour caractériser les véhicules électriques par l'AFM sont décrites dans cette étude. Avant d'imagerie des vésicules en liquide, ils doivent être immobilisés sur un substrat soit en s'attachant à une surface fonctionnalisée, en piégeant dans un filtre, ou par attraction électrostatique7. La fixation électrostatique sur un substrat chargé positivement est une option particulièrement pratique pour l'immobilisation des exosomes connus pour avoir un potentiel zeta négatif. Cependant, les mêmes forces électrostatiques qui immobilisent les vésicules extracellulaires à la surface déforment également leur forme, ce qui rend l'analyse des données post-imagerie essentielle. Nous élaborons ce point en décrivant l'algorithme qui estime la taille des vésicules globulaires dans la solution en fonction des données de l'AFM sur la forme déformée des exosomes immobilisés à la surface.
Dans le protocole développé, la procédure pour l'immobilisation électrostatique robuste des vésicules est présentée et suivie par les étapes nécessaires pour effectuer l'imagerie de force atomique dans les états hydratés ou desséchés. Les facteurs qui influencent la concentration de surface des vésicules immobilisées sont identifiés. Les conseils sont donnés sur la façon d'effectuer l'immobilisation électrostatique pour les échantillons avec différentes concentrations de véhicules électriques dans la solution. La sélection de conditions expérimentales permettant l'estimation des distributions empiriques de probabilité de différentes propriétés biophysiques basées sur un nombre suffisamment élevé de vésicules immobilisées est discutée. Des exemples d'analyse post-imagerie des données de l'AFM sont donnés. Plus précisément, un algorithme est décrit pour déterminer la taille des vésicules dans la solution basée sur la caractérisation AFM des véhicules électriques immobilisés. Les résultats représentatifs montrent la cohérence du dimensionnement de la vésicule par l'AFM avec les résultats de l'imagerie cryo-TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Les exosomes et autres vésicules extracellulaires (VEV) sont des complexes moléculaires constitués d'une vésicule de membrane lipidique, de sa décoration de surface par des protéines membranaires et d'autres molécules, et d'un contenu luminaire diversifié hérité d'une cellule parente, qui comprend des ARN, protéines et les ANN. La caractérisation des tailles hydrodynamiques des véhicules électriques, qui dépend de la taille de la vésicule et de sa couche coronale formée par des décorations de surface, est devenue routinière. Pour les exosomes, le plus petit des véhicules électriques, la différence relative entre les tailles hydrodynamiques et vésicules est significative. La caractérisation de la taille des vésicules par l'imagerie par électron de transmission cryogénique (cryo-TEM), une technique d'étalon-or, demeure un défi en raison du coût de l'instrument, de l'expertise requise pour effectuer la préparation de l'échantillon, l'imagerie et data, et un petit nombre de particules souvent observées dans les images. Une alternative largement disponible et accessible est la microscopie de force atomique (AFM), qui peut produire des données polyvalentes sur la géométrie tridimensionnelle, la taille, et d'autres propriétés biophysiques des vésicules extracellulaires. Le protocole développé guide les utilisateurs dans l'utilisation de cet outil d'analyse et décrit le flux de travail pour l'analyse des véhicules électriques par l'AFM, qui comprend la préparation de l'échantillon pour l'imagerie des véhicules électriques sous forme hydratée ou desséchée, l'immobilisation électrostatique de vésicules sur un substrat, l'acquisition de données, son analyse et son interprétation. Les résultats représentatifs démontrent que la fixation des véhicules électriques sur la surface modifiée du mica est prévisible, personnalisable et permet à l'utilisateur d'obtenir des résultats de dimensionnement pour un grand nombre de vésicules. Le dimensionnement de la vésicule basé sur les données de l'AFM s'est avéré compatible avec l'imagerie cryo-TEM.

La fixation de surface des véhicules électriques est une étape critique dans la séquence d'imagerie. L'immobilisation de surface électrostatique des exosomes, connue pour avoir un potentiel négatif de zeta, se produira robustement après que le substrat du mica soit modifié pour avoir une charge positive de surface. Sans le traitement avec NiCl2 pour donner des changements positifs de surface, l'immobilisation des véhicules électriques sur le substrat s'est avérée inefficace. L'image de hauteur de <...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Une procédure étape par étape est décrite pour l'immobilisation sans étiquette des exosomes et des vésicules extracellulaires à partir d'échantillons liquides et leur imagerie par microscopie de force atomique (AFM). Les images de l'AFM sont utilisées pour estimer la taille des vésicules de la solution et caractériser d'autres propriétés biophysiques.

Imagerie des vésicules extracellulaires par microscopie de force atomique

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Ce protocole décrit la préparation simple pour l’imagerie afm des vésicules extracellulaires sous forme hydratée et dessiccated, leur immobilisation électrostatique, balayage de surface, identification vésicale, et analyse et interprétation de données. Le principal avantage de cette technique est la fixation électrostatique pratique des vésicules à la surface de la peau et l’analyse post-imagerie pour tenir compte de la distorsion de forme causée par l’immobilisation. Les résultats obtenus de dimensionnement de vésicules sont compatibles avec l’imagerie cryoTEM d’étalon-or qui reste technique coûteuse et provocante.Si vous êtes un nouvel utilisateur d’AFM, commencez par caractériser les échantillons secs avant de procéder à des échantillons hydratés. Parce qu’il existe de nombreux facteurs supplémentaires qui peuvent avoir un impact sur l’acquisition d’échantillons hydratés. Pour commencer, isoler les vésicules extracellulaires d’un bio-fluide tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne.Ensuite, fixez fermement un disque de mica à un disque magnétique en acier inoxydable. Fendre le disque de mica à l’aide d’un rasoir tranchant pour exposer une nouvelle couche de matériau. À température ambiante, traiter la surface supérieure du mica pendant dix secondes avec une centaine de micro-litres d’une solution de chlorure nickel II de dix millimlaires.Cela modifie la charge de la surface de négatif à positif. Éponger la solution de chlorure nickel II avec un lingette sans peluche ou du papier buvard. Ensuite, lavez la surface du mica trois fois avec de l’eau déionisée et séchez-la avec un jet d’azote sec.Placez le disque de spécimen d’AFM avec la surface attachée mica modifiée dans une boîte de Pétri. Ensuite, diluer les exosomes avec PBS pour obtenir une concentration entre quatre et quarante milliards de particules par millilitre de solution. Valider la concentration de particules diluées à l’aide d’une analyse de suivi des nanoparticules.Former une goutte sessile à la surface de la mica en vidant une centaine de microlitres de la solution exosome diluée à partir d’une pipette. Placez ensuite le couvercle sur la boîte de Pétri et scellez-le avec du film de parafène pour réduire l’évaporation de l’échantillon. Incuber au réfrigérateur pendant douze heures.Après l’incubation, aspirer 80 à 90 pour cent de l’échantillon avec soin sans déranger la surface. À ce stade, les exosomes seront immobilisés électrostatiquement sur le substrat de mica. Lors de l’imagerie des échantillons hydratés, rincer la surface trois fois avec PBS.Prenez soin de garder l’échantillon hydraté tout au long du processus de rinçage. Après avoir lavé la surface mica avec PBS, retirer 80 à 90 pour cent du liquide et pipette quarante microlitres de PBS frais pour couvrir l’échantillon. L’échantillon hydraté est prêt pour l’imagerie.Lors de l’imagerie des EV desséchés, retirer les sels de la surface en rinçant le substrat trois fois avec de l’eau déionisée. Après avoir aspiré autant de liquide que possible, sans toucher la surface, séchez le reste avec un jet d’azote sec. Pour imager les vésicules extracellulaires desséchées, sélectionnez un porte-à-faux conçu pour la numérisation en l’air en mode d’imagerie tapant et sans contact et montez-le sur le porte-sonde.Placez l’échantillon sur la scène de l’AFM. Le disque magnétique en acier inoxydable immobilise l’échantillon sur la scène. Placez le porte-sonde dans l’AFM.Laisser le temps à la préparation et au stade d’équilibrer thermiquement. Utilisez le mode taraudage pour scanner une zone de 5x5 microns rastered en 512 lignes à un taux de balayage d’un hertz. Obtenez à la fois les images de hauteur et de phase car elles fournissent des informations complémentaires sur la topographie et les propriétés de surface de l’échantillon.Le temps d’analyse augmentera avec une zone d’image et le nombre de lignes sélectionnées pour former l’image, mais diminuera avec le taux d’analyse. Étant donné que des taux d’analyse rapides peuvent avoir un impact sur la qualité de l’image, la vitesse de rastering devrait être un équilibre entre le temps d’acquisition et la qualité de l’image. Pour imager les vésicules hydratées, choisissez un porte-à-faux qui convient à la numérisation d’échantillons mous et hydratés et montez le porte-à-faux sur un porte-sonde conçu pour la numérisation des liquides.Mouiller la pointe du porte-à-faux avec PBS pour réduire la probabilité d’introduire des bulles d’air dans le liquide pendant la numérisation. Ensuite, immobiliser l’échantillon sur la scène de l’AFM. Une fois que l’échantillon équilibre thermiquement, imagez la surface hydratée de mica en mode taraudage.Acquérir à la fois les images de hauteur et de phase. Pour analyser les images prises, passez d’abord aux modes SPM sélectionnés de Data Process, suivis de Tip’and choose Model Tip’Select, la géométrie et les dimensions de la pointe utilisée pour numériser l’échantillon et cliquez sur OK’Corriger les artefacts d’érosion de pointe en effectuant la reconstruction de surface. Ouvrez l’image.Dans le menu, sélectionnez Data Process’then sélectionnez SPM Modes’followed by Tip’then choose Surface Reconstruction’and click OK’Next, sélectionnez Data Process, suivi de Level’and choose Plane Level’to aligne le plan d’imagerie et correspond au plan XY de laboratoire en supprimant l’inclinaison du substrat des données de balayage. Alignez les lignes dans l’image en sélectionnant Data Process’followed by Correct Data', puis choisissez Align Rows’Plusieurs options d’alignement sont disponibles, y compris la médiane qui est un algorithme qui trouve une hauteur moyenne de chaque ligne d’analyse et la soustrait des données. Ensuite, allez à Data Process’followed by Correct Data’and choose Remove Scars’This supprimera les erreurs de numérisation courantes connues sous le nom de Scars’To aligner la surface mica à la hauteur zéro, aller au menu du processus de données et sélectionnez Flatten Base’in the Level’drop down menu.Identifiez les vésicules extracellulaires sur la surface numérisée en vous rendre au menu grains et en utilisant l’algorithme Mark by Threshold’This identifie les exosomes immobilisés de surface comme des particules qui dépassent du substrat de surface zéro par la hauteur au-dessus du seuil choisi par l’utilisateur. Sélectionnez un seuil de l’espace entre un et trois nanomètres. Cela éliminera la plupart des interférences au sol arrière.Enfin, effectuez la caractérisation géométrique et dimensionnelle des vésicules identifiées à l’aide des algorithmes de distribution disponibles accessibles à partir du menu grains. Exportez les données AFM de Gwyddion pour analyse spécialisée par d’autres outils informatiques et programmes informatiques personnalisés. La modification de la surface du chlorure de nickel entraîne une immobilisation des vésicules extracellulaires qui dépendent du temps.La concentration en surface des vésicules immobilisées est excessivement dense après 24 heures d’incubation, tandis que l’incubation de 12 heures entraîne moins d’exosomes et de données de balayage plus faciles à analyser avec précision. Cette image AFM montre des exosomes MCF7 hydratés électrostatiquement immobilisés sur la surface modifiée du mica. L’image correspondante de la phase AFM confirme que les grains de l’image de hauteur sont des nanoparticules molles comme il faut s’y attendre pour les vésicules membranaires.Les données de hauteur pour trois vésicules le long de la même ligne sont affichées ici. Ces profils illustrent une forme aplatie causée par l’attraction électrostatique des exosomes à la surface de charge positive du mica modifié. La distorsion de forme est apparente dans une vue agrandie de la vésicule immobilisée et de sa section transversale.Pour estimer la taille globulaire des exosomes de la solution, on peut correspondre aux volumes enfermés par des enveloppes membranaires immobilisées et sphériques de surface. La distribution de taille des vésicules globulaires dans la solution a été déterminée à partir des données d’AFM de 561 vésicules immobilisées. Les tailles vésicules des images CryoTEM sont compatibles avec les résultats de l’AFM.Avant d’imaginer les exosomes hyrdrated, il est important de se rappeler de bien rincer la surface avec PBS. Cela supprimera les exosomes entrants et empêchera leur attachement à la pointe AFM. Lors de l’imagerie des exosomes desséchés, assurez-vous d’utiliser de l’eau DI pour élever le substrat.Le lavage di empêchera la formation de cristaux de sel à la surface pendant que le substrat sèche. S’ils sont présents, les cristaux de sel feront du traitement d’image une tâche difficile.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Recherche

Biochimie

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...