Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung der National Science Foundation (Preisnummer IGERT-0903715), der University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant und Graduate Research Fellowship Award) und des Skolkovo Institute of Science. technologie (Skoltech Fellowship).

1. Isolierung von Elektrofahrzeugen aus einem Biofluid
<ol><li>Isolieren Sie Elektrofahrzeuge nach einer der etablierten Methoden, z. B. der Differenz-Ultrazentrifugation8, Derfällung oder Größenausschlusschromatographie9.</li>
	<li>Bestätigen Sie das Vorhandensein von erwarteten Oberflächen- und Luminal-Biomarkern und das Fehlen von Biomarkern, die auf eine Kreuzkontamination der Zubereitung hinweisen. Bestätigen Sie die Lipid-Bilayer-Morphologie d...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer biologischen Flüssigkeit, Oberflächenscans und Bildanalysen sind die wesentlichen Schritte des entwickelten Protokolls zur AFM-Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Flüssigkeiten. Die Anzahl der Vesikel, die AFM-Bildwaagen mit der abgebildeten Oberfläche und der auf dem Substrat immobilisierten Oberflächenkonzentration der Vesikel zugänglich sind. Angesichts eines negativen Zeta-Potenzials von Elektrofahrzeugen und Exosomen18befürwort...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen3, wie in Abbildung 1dargestellt.
Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.
Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung7. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.
Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomen und andere extrazelluläre Vesikel (EVs) sind molekulare Komplexe, die aus einem Lipidmembranvesikel, seiner Oberflächendekoration durch Membranproteine und anderen Molekülen und einem vielfältigen Luminalgehalt bestehen, der von einer übergeordneten Zelle geerbt wird, zu der RNAs, Proteine und DNAs. Die Charakterisierung der hydrodynamischen Größen von Elektrofahrzeugen, die von der Größe des Vesikels und seiner durch Oberflächendekorationen gebildeten koronalen Schicht abhängt, ist zur Routine geworden. Bei Exosomen, dem kleinsten EVs, ist der relative Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße signifikant. Die Charakterisierung von Vesikelgrößen durch die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM), eine Goldstandard-Technik, bleibt aufgrund der Kosten des Instruments, des für die Probenvorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse und eine kleine Anzahl von Partikeln, die häufig in Bildern beobachtet werden. Eine weit verbreitete und zugängliche Alternative ist die Atomkraftmikroskopie (AFM), die vielseitige Daten über dreidimensionale Geometrie, Größe und andere biophysikalische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel erzeugen kann. Das entwickelte Protokoll führt die Anwender bei der Nutzung dieses Analysetools und skizziert den Workflow für die Analyse von Elektrofahrzeugen durch den AFM, der die Probenvorbereitung für bildgebende Elektrofahrzeuge in hydratisierter oder ausgetrockneter Form, die elektrostatische Immobilisierung von Vesikel auf einem Substrat, Datenerfassung, deren Analyse und Interpretation. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Fixierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vorhersagbar und anpassbar ist und es dem Benutzer ermöglicht, Größenergebnisse für eine große Anzahl von Vesikeln zu erhalten. Die Vesikelgröße auf Basis der AFM-Daten stellte sich heraus, dass sie mit der Kryo-TEM-Bildgebung übereinstimmt.

Die Oberflächenfixierung von Elektrofahrzeugen ist ein wichtiger Schritt in der Bildsequenz. Die elektrostatische Oberflächenimmobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat, wird robust auftreten, nachdem das Substrat des Glimmers modifiziert wurde, um eine positive Oberflächenladung zu haben. Ohne die Behandlung mit NiCl2, um positive Oberflächenveränderungen zu vermitteln, erwies sich die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf dem Substrat als unwirksam. D...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Dieses Protokoll skizziert die einfache Vorbereitung für die AFM-Bildgebung von extrazellulären Vesikeln in hydratisierten und ausgetrockneten Formen, deren elektrostatische Immobilisierung, Oberflächenscanning, vesical Identifikation sowie Datenanalyse und -interpretation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die bequeme elektrostatische Fixierung von Vesikeln auf der Hautoberfläche und die post-imaging-Analyse, um Formverzerrungen zu berücksichtigen, die durch Immobilisierung verursacht werden. Die erhaltenen Ergebnisse der Vesikelgrößen sind konsistent mit der Gold Standard CryoTEM Imaging, die kostspielige und herausfordernde Technik bleibt.Wenn Sie ein neuer AFM-Benutzer sind, beginnen Sie mit der Charakterisierung von trockenen Proben, bevor Sie mit hydratisierten Proben fortfahren. Denn es gibt zahlreiche zusätzliche Faktoren, die sich auf die Anschaffung von hydratisierten Proben auswirken können. Um zu beginnen, isolieren Sie extrazelluläre Vesikel von einer Bioflüssigkeit, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Als nächstes befestigen Sie eine Glimmerscheibe fest an einer magnetischen Edelstahl-Probenscheibe. Cleave die Glimmerscheibe mit einem scharfen Rasiermesser, um eine neue Schicht von Material zu belichten. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Glimmers zehn Sekunden lang mit hundert Mikrolitern einer zehnMillimolaren Nickel-II-Chloridlösung behandeln.Dadurch wird die Ladung der Oberfläche von negativ in positiv geändert. Die Nickel-II-Chloridlösung mit einem fusselfreien Wisch- oder Blottingpapier ablöschen. Dann waschen Sie die Glimmeroberfläche dreimal mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie mit einem Strom trockenen Stickstoffs.Legen Sie die AFM-Probenscheibe mit der befestigten Oberfläche modifizierten Glimmer in eine Petrischale. Als nächstes verdünnen Sie die Exosomen mit PBS, um eine Konzentration zwischen vier und vierzig Milliarden Partikel pro Milliliter Lösung zu erhalten. Validieren Sie die verdünnte Partikelkonzentration mithilfe einer Nanopartikel-Tracking-Analyse.Bilden Sie einen sessilen Tropfen auf der Oberfläche des Glimmers, indem Sie hundert Mikroliter der verdünnten Exosomenlösung aus einer Pipette entleeren. Dann den Deckel auf die Petrischale legen und mit Parafenfolie versiegeln, um die Probenverdunstung zu reduzieren. Zwölf Stunden im Kühlschrank bebrüten.Nach der Inkubation 80 bis 90 Prozent der Probe sorgfältig aspirieren, ohne die Oberfläche zu stören. An dieser Stelle werden die Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf dem Glimmersubstrat. Bei der Abbildung hydratisierter Proben die Oberfläche dreimal mit PBS abspülen.Achten Sie darauf, die Probe während des Spülvorgangs hydratisiert zu halten. Nach dem Waschen der Glimmeroberfläche mit PBS, entfernen Sie 80 bis 90 Prozent der Flüssigkeit und Pipette vierzig Mikroliter frische PBS, um die Probe zu bedecken. Die hydratisierte Probe ist zur Bildgebung bereit.Bei der Abbildung der ausgetrockneten Eves entfernen Sie die Salze von der Oberfläche, indem Sie das Substrat dreimal mit entionisiertem Wasser abspülen. Nach dem Ansaugen so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne die Oberfläche zu berühren, trocknen Sie den Rest mit einem Strom von trockenem Stickstoff. Um die ausgetrockneten extrazellulären Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Freischwinger aus, der für das Scannen in der Luft in abstichenden und berührungslosen Bildgebungsmodi entwickelt wurde, und montieren Sie ihn auf den Sondenhalter.Platzieren Sie das Sample auf der AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die Probe auf der Bühne immobilisieren. Legen Sie den Sondenhalter in den AFM.Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die Bühne, um thermisch auszueinemt. Verwenden Sie den Tippmodus, um einen Bereich zu scannen, der 5x5 Mikrometer in 512 Zeilen mit einer Scanrate von einem Hertz gerastert ist. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder, da sie kostenlose Informationen über die Topographie und die Oberflächeneigenschaften der Probe bereitstellen.Die Scanzeit wird mit einem abgebildeten Bereich und der Anzahl der Linien, die für die Bildbildung ausgewählt wurden, erhöht, nimmt jedoch mit der Scanrate ab. Da sich schnelle Scanraten auf die Bildqualität auswirken können, sollte die Geschwindigkeit des Rasterns ein Gleichgewicht zwischen Erfassungszeit und Bildqualität sein. Um hydratisierte Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Ausleger aus, der zum Scannen weicher, hydratisierter Proben geeignet ist, und montieren Sie den Ausleger auf einen Sondenhalter, der für das Scannen in Flüssigkeiten entwickelt wurde.Befeuchten Sie die Spitze des Auslegers mit PBS, um die Wahrscheinlichkeit des Einbringens von Luftblasen in die Flüssigkeit während des Scannens zu reduzieren. Anschließend wird die Probe auf die AFM-Bühne immobilisiert. Sobald die Probe thermisch ausgeglichen ist, stellen Sie die hydratisierte Glimmeroberfläche im Gewindebohrmodus ab.Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, gehen Sie zuerst zu Data Process'select SPM-Modi, gefolgt von Tip'and wählen Sie Modellspitze'Wählen Sie die Geometrie und die Abmessungen der Spitze verwendet, um die Probe zu scannen und klicken Sie auf OK'Korrigieren Sie die Spitze Erosion Artefakte durch die Durchführung der Oberflächenrekonstruktion. Öffnen Sie das Bild.Wählen Sie im Menü Datenprozess aus, wählen Sie dann SPM-Modi'followed by Tip'then wählen Sie Surface Reconstruction'and click OK'Next, select Data Process, gefolgt von Level'and choose Plane Level'to align the imaging plane and to match the laboratory XY plane by removing the tilt in the subxanders from the scan data. Richten Sie Zeilen im Bild aus, indem Sie Data Process'followed by Correct Data' auswählen und dann Rows ausrichten'Mehrere Ausrichtungsoptionen sind verfügbar, einschließlich Median, der ein Algorithmus ist, der eine durchschnittliche Höhe jeder Scanlinie findet und sie von den Daten subtrahiert. Als nächstes gehen Sie zu Datenprozess'followed by Correct Data'and choose Remove Scars'This remove common scanning errors known as Scars'To align the mica surface at the zero height, go to the Data Process'menu and choose Flatten Base'in the Level'drop down menu.Identifizieren Sie die zusätzlichen zellulären Vesikel auf der gescannten Oberfläche, indem Sie zum Menü "Korn" gehen und Mark by Threshold verwenden: Dieser Algorithmus identifiziert oberflächenimmobilisierte Exosomen als Partikel, die aus dem Null-Oberflächensubstrat um die Höhe über dem vom Benutzer ausgewählten Schwellenwert herausragen. Wählen Sie einen Schwellenwert im Bereich zwischen einem und drei Nanometern aus. Dadurch wird der größte Teil der Bodeninterferenzen beseitigt.Führen Sie schließlich die geometrische und dimensionale Charakterisierung der identifizierten Vesikel mithilfe der verfügbaren Verteilungsalgorithmen durch, auf die über das Menü "Grains" zugegriffen werden kann. Exportieren Sie die AFM-Daten aus Gwyddion für eine spezielle Analyse durch andere Rechenwerkzeuge und benutzerdefinierte Computerprogramme. Die Nickelchlorid-Oberflächenmodifikation führt zu einer zeitabhängigen Immobilisierung von extrazellulären Vesikeln.Die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel ist nach 24 Stunden Inkubation zu dicht, während die 12-stündige Inkubation zu weniger Exosomen und Scandaten führt, die leichter genau zu analysieren sind. Dieses AFM-Bild zeigt hydratisierte MCF7-Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf der modifizierten Glimmeroberfläche. Das entsprechende AFM-Phasenbild bestätigt, dass es sich bei den Körnern im Höhenbild um weiche Nanopartikel handelt, wie es bei Membranbläschen zu erwarten ist.Die Höhendaten für drei Vesikel entlang der gleichen Linie werden hier angezeigt. Diese Profile veranschaulichen eine abgeflachte Form, die durch die elektrostatische Anziehung von Exosomen auf die positiv aufladende Oberfläche des modifizierten Glimmers verursacht wird. Die Formverzerrung zeigt sich in einer vergrößerten Ansicht des immobilisierten Vesikels und seines Querschnitts.Um die Kugelgröße der Exosomen in der Lösung zu schätzen, kann auf die Volumina entsprechen, die von oberflächenimmobilisierten und kugelförmigen Membranhüllen eingeschlossen sind. Die Größenverteilung der Kugelbläschen in der Lösung wurde aus den AFM-Daten von 561 immobilisierten Vesikeln bestimmt. Die Vesikelgrößen in CryoTEM-Bildern stimmen mit den AFM-Ergebnissen überein.Vor der Abbildung der hyrdierten Exosomen ist es wichtig, daran zu denken, die Oberfläche gründlich mit PBS zu spülen. Dadurch werden eingehende Exosomen entfernt und deren Befestigung an der AFM-Spitze verhindert. Achten Sie bei der Abbildung der ausgetrockneten Exosomen darauf, DI-Wasser zu verwenden, um das Substrat zu erheben.Die DI-Wäsche verhindert die Bildung von Salzkristallen auf der Oberfläche, wenn das Substrat trocknet. Wenn vorhanden, werden Salzkristalle die Bildverarbeitung zu einer schwierigen Aufgabe machen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Forschung

Biochemie

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...