Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה הפיננסית של הקרן הלאומית למדע (מספר הפרס איגרט-0903715), אוניברסיטת יוטה (המחלקה למענק הנדסת זרעים כימית ופרס המלגות למחקר בוגר), ומכון סקולקובו למדעים וטכנולוגיה (מלגת סקולטק).

1. בידוד EVs מתוך ביולואיד
<ol><li>בידוד EVs על ידי אחת השיטות הוקמה, כגון ההבדלים הדיפרנציאלי8, משקעים, או גודל כרומטוגרפיה הדרה9.</li>
	<li>לאשר נוכחות של משטח צפוי וביואריטים בסמנים והעדר סמנים ביואריטים המצביעים על זיהום של ההכנה. מאשרים את המבנה המיורפולוגיה ש?...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

השתק של EVs מתוך נוזל ביולוגי, סריקת פני שטח, וניתוח תמונה הם הצעדים החיוניים של הפרוטוקול המפותח לאפיון AFM של EVs בנוזל. מספר השלפוחיות והקלה על מאזני הדמיה AFM עם שטח התמונה המשטח ואת ריכוז פני השטח של השלפוחיות על המצע. בהינתן פוטנציאל זטה שלילי של EVs ואקסוזומים18, אנו תומכים קיבעו...

שלפוחיות (EVs) קיימות בכל נוזלי הגוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב ונוזל השפיר. אקסוזומים טופס מחלקה מחוז של EVs הבדיל מתוך EVs אחרים על ידי ביוגנזה אנדוזומבית, סמנים של השביל האנדוזומבית, ואת הגודל הקטן ביותר בין כל EVs. הגודל של האקסוזומים מדווח לעתים קרובות עם שינויים ניכרים בין הלימודים. תוצאות שינוי גודל נמצאו להיות תלויים שיטה, המשקף את ההבדל בעקרונות פיזיים המועסקים על ידי טכניקות אנליטיות שונות כדי להעריך EV גדלים1,2. לדוגמה, ניתוח המעקב הננו-חלקיק (נ. ת. ע)-טכניקת האפיון בגודל הנפוץ ביותר-מעריך את הגודל של EVs כקטרים ההידרודינמיים שלהם, המאפיינים את ההתנגדות לניידות הבראונית של EVs בפתרון. קוטר הידרודינמי גדול יותר של שלפוחית מרמזת על הניידות הנמוכה שלה בנוזל. השכבה הקורלית סביב שלפוחיות, המורכב של חלבונים פני השטח ומולקולות אחרות מעוגן או נספחת אל פני הקרום, מאוד מעכבת את הניידות ומגבירה את הגודל ההידרודינמי של EVs. במונחים יחסיים, גידול זה גדול במיוחד עבור האקסוזומים3, כפי שמודגם באיור 1.
שידור הקריוגני (המיקרוסקופיה) הוא טכניקה מוחלטת באפיון גדלים ומורפולוגיה במדינות ההתייבשות. עם זאת, את העלות הגבוהה של המכשור ואת המומחיות המקצועית הדרושים כדי להשתמש בו נכון להמריץ את החקירה של טכניקות חלופיות שיכול לEVs נוזלים. מספר קטן יחסית של EVs שנצפו או מאופיין בתמונות הקריו-TEM הנרכשים, הוא חיסרון בולט נוסף של טכניקה זו.
מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) לדמיין את הטופוגרפיה תלת מימדי של רטוב או מיובש EVs4,5,6 על ידי סריקת בדיקה על פני המצע כדי לסרוק את התמונה של החלקיקים על פני השטח. הצעדים החיוניים של הפרוטוקול לאפיון EVs על ידי AFM מתוארים במחקר זה. לפני הדמיה של שלפוחיות בנוזל, הם חייבים להיות מקיבוע על מצע על ידי הקשירה למשטח פונקציונליזציה, השמנה במסנן, או על ידי משיכה אלקטרוסטטית7. הקיבעון האלקטרוסטטי על מצע טעונה באופן חיובי הוא אופציה נוחה במיוחד עבור השתק של אקזומים הידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי. עם זאת, את אותם כוחות אלקטרוסטטית ששתק את שלפוחיות החילוץ על פני השטח גם לעוות את צורתם, מה שהופך ניתוח נתונים לאחר הדמיה חיוני. אנו להרחיב נקודה זו על ידי תיאור האלגוריתם המתאר את הגודל של כדורי שלפוחיות בפתרון מבוסס על נתוני AFM על הצורה מעוותת של האקסוזומים מקיבוע על פני השטח.
בפרוטוקול המפותח מוצג הנוהל של הטיפול הסטטי של השלפוחיות ולאחריו השלבים הדרושים לביצוע הדמיה של כוח אטומי במצבי היובש או ההתייבשות. הגורמים המשפיעים על הריכוז של פני השטח של השלפוחית הקיבוע מזוהים. ההדרכה ניתנת על איך לבצע את השתק אלקטרוסטטי עבור דגימות עם ריכוזים שונים של EVs בפתרון. הבחירה של התנאים הניסיוניים המתיר הערכה של הפצות ההסתברות האמפירית של מאפיינים ביופיזיים שונים המבוססים על מספר גדול מספיק של קיבוע ושלפוחיות הוא נדון. דוגמאות לניתוח לאחר הדמיה של נתוני AFM ניתנים. באופן ספציפי, אלגוריתם מתואר לקביעת גודל ושלפוחיות בתמיסה המבוססת על אפיון AFM של קיבוע EVs. תוצאות הנציג להראות את העקביות של שלפוחית האחיזה על ידי AFM עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

אקסוזומים ושלפוחיות אחרות (EVs) הם מתחמי מולקולריים המורכב של קרום שומנים ושלפוחית, עיטור פני השטח שלה על ידי חלבונים ממברנות ומולקולות אחרות, ותוכן מגוון לומיאל בירושה מתא הורה, הכולל RNAs, חלבונים ו-DNAs. האפיון של גדלים הידרודינמיים של EVs, אשר תלוי בגודל של שלפוחית ואת השכבה הקורולית שלה נוצר על ידי קישוטי פני השטח, הפך שגרתי. עבור האקסוזומים, הקטן ביותר של EVs, ההבדל היחסי בין ההידרודינמיקה והשלפוחיות הוא משמעותי. אפיון של גדלים ושלפוחיות על-ידי מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הקריוגני (הקפאה-TEM), טכניקת הזהב בתקן, נשאר אתגר בשל עלות המכשיר, המומחיות הנדרשת לבצע את ההכנה לדוגמה, הדמיה ו ניתוח נתונים, ומספר קטן של חלקיקים שנצפו לעתים קרובות בתמונות. חלופה רחבה ונגישה לשימוש היא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), אשר יכול לייצר נתונים מגוונים על גאומטריה תלת ממדית, גודל, ומאפיינים אחרים ביופיזיים של שלפוחיות. הפרוטוקול המפותח מדריך את המשתמשים באמצעות כלי אנליטי זה ומתווה את זרימת העבודה לניתוח של EVs על ידי AFM, הכולל את ההכנה לדוגמא לדימות EVs בצורה מהתייבשות או מיובש, השתק אלקטרוסטטי של שלפוחיות על מצע, רכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. תוצאות הנציג להפגין כי קיבעון של EVs על משטח נציץ שונה צפוי, להתאמה אישית, ומאפשר למשתמש להשיג תוצאות לשינוי גודל עבור מספר רב של שלפוחיות. שינוי הגודל המבוסס על נתוני AFM נמצא להיות עקבי עם הדמיה הקפאה-TEM.

קיבוע פני השטח של EVs הוא צעד קריטי ברצף ההדמיה. משטח אלקטרוסטטי של אקסוזומים, ידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי, יהיה מכבש להתרחש לאחר המצע של נציץ הוא שונה כדי לקבל טעינה חיובית משטח. ללא הטיפול עם NiCl2 להקנות שינויים משטח חיובי, השתק של EVs על המצע נמצאה לא יעילה. התמונה גובה באיו?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הליך צעד-אחר-צעד מתואר עבור השתק ללא תווית של אקסוזומים ושלפוחיות מעיים מדגימות נוזל והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). התמונות AFM משמשות כדי להעריך את הגודל של השלפוחיות בפתרון ולאפיין מאפיינים ביופיזיים אחרים.

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

פרוטוקול זה מתאר הכנה פשוטה להדמיית AFM של וקסיקים חוץ-תאיים בצורות מיובשות מיובשות, קיבוע אלקטרוסטטי, סריקת משטחים, זיהוי וריזי וניתוח נתונים ופרשנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא קיבעון אלקטרוסטטי נוח של גירויים על פני העור וניתוח הדמיה פוסט להסביר עיוות צורה הנגרמת על ידי קיבוע. תוצאות גודל וריקבלה עולים בקנה אחד עם הדמיה CryoTEM תקן זהב אשר נשאר טכניקה יקרה ומאתגרת.אם אתה משתמש AFM חדש, להתחיל עם אפיון של דגימות יבשות לפני שתמשיך דגימות hydrated. כי ישנם גורמים רבים נוספים שיכולים להשפיע על רכישת מדגם hydrated. כדי להתחיל, לבודד דם חוץ תאי מנוזל ביולוגי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, חבר בחוזקה דיסק נציץ לדיסק דגימת נירוסטה מגנטי. Cleave דיסק נציץ באמצעות סכין גילוח חדה כדי לחשוף שכבה חדשה של חומר. בטמפרטורת החדר, לטפל על פני השטח העליונים של נציץ במשך עשר שניות עם מאה מיקרו ליטר של פתרון כלוריד ניקל 10 מילימולאר II.זה משנה את המטען של פני השטח מלהיות שלילי לחיובי. תמחק את תספורת הכלוריד של ניקל II עם נייר לנגב או סופג ללא מוך. לאחר מכן, לשטוף את משטח נציץ שלוש פעמים עם מים deionized ולייבש אותו עם זרם של חנקן יבש.מניחים את דיסק הדגימה AFM עם המשטח המצורף שונה נציץ לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, לדלל את האקסוזומים עם PBS כדי להשיג ריכוז בין ארבעה לארבעים מיליארד חלקיקים למיליליטר של פתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים ננו.טופס טיפת sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון מאה microliters של פתרון exosome מדולל מ pipette. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת פטרי ולאטום אותו עם סרט פרפן כדי להפחית את אידוי מדגם. דגירה במקרר במשך שתים עשרה שעות.לאחר הדגירה, שאפו 80 עד 90 אחוזים מהדגימה בזהירות מבלי להפריע לפני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיו משותקים אלקטרוסטטית על מצע הנציץ. כאשר הדמיה דגימות hydrated, לשטוף את פני השטח שלוש פעמים עם PBS.יש לדאוג לשמור על המדגם hydrated לאורך כל תהליך שטיפה. לאחר שטיפת משטח נציץ עם PBS, להסיר 80 עד 90 אחוזים של נוזל פיפטה ארבעים microliters של PBS טרי כדי לכסות את המדגם. הדגימה hydrated מוכן להדמיה.בעת הדמיה של EV מיובש, להסיר את המלחים מפני השטח על ידי שטיפה של המצע שלוש פעמים עם מים deionized. לאחר שאף נוזלים רבים ככל האפשר, מבלי לגעת על פני השטח, לייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש. כדי לדמיין את הווסקולים החוץ-תאיים מיובשים, בחר cantilever המיועד לסריקה באוויר במצבי הקשה והדמיה ללא מגע והתקן אותו על מחזיק הבדיקה.מקם את הדגימה על הבמה AFM. דיסק הדגימה של נירוסטה מגנטית ישתק את הדגימה על הבמה. מקם את מחזיק הגשוש לתוך AFM.אפשר זמן ההכנה ואת הבמה כדי לצייד תרמית. השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור שהוא 5x5 מיקרון רסטר ב 512 שורות בקצב סריקה של הרץ אחד. רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה מכיוון שהן מספקות מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם.זמן הסריקה יגדל עם אזור בתמונה ומספר השורות שנבחרו כדי ליצור את התמונה, אך יקטן עם קצב הסריקה. מכיוון שתעריפי סריקה מהירים עשויים להשפיע על איכות התמונה, מהירות הרסטר צריכה להיות איזון בין זמן הרכישה לאיכות התמונה. כדי לדמיין זרעים hydrated, בחר cantilever המתאים לסריקת דגימות רכות, hydrated ולהוות את cantilever על מחזיק בדיקה המיועד לסריקה בנוזלים.הרטב את קצה cantilever עם PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לנוזל במהלך הסריקה. לאחר מכן, לשתק את המדגם על הבמה AFM. לאחר הדגימה שיווי משקל תרמי, תמונה משטח נציץ hydrated במצב הקשה.רכוש הן את תמונות הגובה והן את תמונות הפאזה. כדי לנתח את התמונות שצולמו, עבור תחילה למצבי SPM נבחרים של תהליך הנתונים, ולאחר מכן בחר עצה'בחר את תיאור הדגם'בחר את הגיאומטריה ואת מידות הקצה המשמשות לסריקת הדגימה ולחץ על אישור'תקן את ממצאי שחיקת הקצה על-ידי ביצוע שחזור פני השטח. פתח את התמונה.מהתפריט, בחר תהליך נתונים'לאחר מכן בחר מצבי SPM ואחריו עצה'לאחר מכן בחר שחזור משטח'ולחץ על אישור'הבא, בחר תהליך נתונים ואחריו Level'ובחר Level'כדי ליישר את מישור ההדמיה ולתאים למישור המעבדה XY על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. ישר שורות בתמונה על-ידי בחירה באפשרות תהליך נתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ולאחר מכן בחר 'ישר שורות'מספר אפשרויות יישור זמינות כולל חציון שהוא אלגוריתם שמוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומחסיר אותו מהנתונים. לאחר מכן, עבור אל תהליך הנתונים'ואחריו 'תקן נתונים' ובחר הסר צלקות'פעולה זו תסיר שגיאות סריקה נפוצות הידועות בשם צלקות'כדי ליישר את משטח הנציה בגובה אפס, עבור לתפריט תהליך נתונים ובחר שיטוח בסיס'בתפריט הנפתח Level'.זהה את הווסקים התאיים הנוספים על פני השטח הסרוקים על ידי מעבר לתפריט הגרגרים ושימוש ב-Mark by Threshold'This אלגוריתם מזהה אקסוזומים משותקים על פני השטח כחלקיקים הבולטים ממצע פני האפס בגובה שמעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר. זה יחסל את רוב ההפרעה לקרקע האחורית.לבסוף, בצעו אפיון גיאומטרי ומימדי של הווסיקים המזוהים באמצעות אלגוריתמי ההפצה הזמינים הנגישים מתפריט הגרגרים. יצא את נתוני AFM מ- Gwyddion לניתוח מיוחד על-ידי כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית. שינוי פני השטח של ניקל כלוריד גורם לשתק של ורידים תאיים נוספים התלויים בזמן.ריכוז פני השטח של הווסיקים משותקים הוא צפוף מדי לאחר 24 שעות של דגירה ואילו הדגירה 12 שעות מוביל פחות exosomes ונתונים סריקה כי קל יותר לנתח במדויק. תמונת AFM זו מציגה אקסוזומים MCF7 hydrated משותקים אלקטרוסטטית על משטח נציץ שונה. תמונת שלב AFM המתאימה מאשרת כי הגרגרים בתדמית הגובה הם חלקיקי ננו רכים כפי שניתן לצפות עבור וריגרם קרום.נתוני הגובה של שלושה ורייקים לאורך אותו קו מוצגים כאן. פרופילים אלה ממחישים צורה שטוחה הנגרמת על ידי המשיכה האלקטרוסטטית של אקסוזומים למשטח המטען החיובי של הנציה ששונתה. עיוות הצורה ניכר בתצוגה מוגדלת של הווסיל משותק וחתך רוחב שלו.כדי להעריך את הגודל הכדורי של האקסוזומים בתסרון, על יכול להתאים את אמצעי האחסון מוקף משטח משותק מעטפות קרום כדורי. התפלגות הגודל של וריקולים כדוריים בפתרון נקבעה מנתוני AFM של 561 וריקולים משותקים. גדלי הווסיל בתמונות CryoTEM תואמים לתוצאות AFM.לפני הדמיה exosomes מזמורים, חשוב לזכור לשטוף ביסודיות את פני השטח עם PBS. פעולה זו תסיר אקסוזומים נכנסים ותמנע את ההחזקה שלהם לקצה AFM. כאשר מדמיינים את האקסוזומים היבשים, הקפד להשתמש במים DI לעלות המצע.לשטוף DI ימנע היווצרות של גבישי מלח על פני השטח כמו המצע מתייבש. אם קיים, גבישי מלח יהפוך את עיבוד התמונה למשימה קשה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...