Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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लेखकराष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार संख्या IGERT-0903715), यूटा विश्वविद्यालय (रासायनिक इंजीनियरिंग बीज अनुदान और स्नातक अनुसंधान फैलोशिप पुरस्कार के विभाग) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं, और विज्ञान के Skolkovo संस्थान और प्रौद्योगिकी (स्कोलटेक फैलोशिप).

1. एक biofluid से EVs के अलगाव
<ol><li>एक स्थापित विधियों में से एक द्वारा ईवीएस को अलग करें, जैसे कि अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन8, वर्षा, या आकार-निष्कर्ष वर्णलेख9.</li>
	<li>अपेक्षित सतह और luminal biomarker...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

एक जैविक तरल पदार्थ से EVs के स्थिरीकरण, सतह स्कैनिंग, और छवि विश्लेषण तरल में EVs के AFM विशेषता के लिए विकसित प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम हैं. vesicles की संख्या छविसतह सतह क्षेत्र और vesicles की सतह एकाग्रता सब्सट्रेट पर ?...

बाह्य कोशिकीय vesicles (EVs) रक्त, मूत्र, लार, दूध, और amniotic तरल पदार्थ सहित शरीर के सभी तरल पदार्थ में मौजूद हैं. Exosomes endosomal biogenesis द्वारा अन्य EVs से विभेदित EVs के एक जिला वर्ग के रूप में, endosomal मार्ग के मार्करों, और सभी EVs के बीच सबसे छोटा आकार. एक्सोसोम का आकार अक्सर अध्ययनों के बीच पर्याप्त परिवर्तनशीलता के साथ सूचित किया जाता है। आकार देने के परिणाम विधि पर निर्भर पाए गए, जो ईवी आकार1,2का अनुमान लगाने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों द्वारा नियोजित भौतिक सिद्धांतों में अंतर को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) - सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आकार लक्षण ीकरण तकनीक - उनके द्रवगतिक व्यास है, जो समाधान में EVs के ब्राउनियन गतिशीलता के लिए प्रतिरोध की विशेषता के रूप में EVs के आकार का अनुमान है. एक vesicle का एक बड़ा द्रवगतिक व्यास तरल में अपनी कम गतिशीलता का तात्पर्य है. vesicles के चारों ओर कोरोनल परत, सतह प्रोटीन और अन्य अणुओं से मिलकर लंगर या झिल्ली की सतह के लिए adsorbed, काफी गतिशीलता में बाधा और EVs के hydrodynamic आकार बढ़ जाती है. सापेक्ष संदर्भ में, यह वृद्धि विशेष रूप से एक्सोसोम3के लिए बहुत अधिक है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है।
क्रायोजेनिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) इमेजिंग उनके हाइड्रेटेड राज्यों में vesicle आकार और आकृति विज्ञान की विशेषता में एक निश्चित तकनीक है। हालांकि, इंस्ट्रूमेंटेशन की उच्च लागत और विशेष विशेषज्ञता का उपयोग करने के लिए इसे सही ढंग से वैकल्पिक तकनीक है कि छवि हाइड्रेटेड EVs कर सकते हैं की खोज को प्रेरित करने की जरूरत है. प्राप्त क्रायो-टीईएम छवियों में देखी गई या विशेषता वाली ईवीएस की अपेक्षाकृत छोटी संख्या इस तकनीक का एक और उल्लेखनीय नुकसान है।
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) सतह पर कणों की छवि को रद करने के लिए सब्सट्रेट भर में एक जांच स्कैन करके हाइड्रेटेड या desicated EVs4,5,6 के तीन आयामी स्थलाकृति कल्पना करता है। AFM द्वारा EVs की विशेषता के लिए प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम इस अध्ययन में उल्लिखित हैं. तरल में vesicles इमेजिंग से पहले, वे या तो एक कार्यात्मक सतह के लिए tethering द्वारा एक सब्सट्रेट पर स्थिर किया जाना चाहिए, एक फिल्टर में फँसाने, या इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षणद्वारा 7. धनावेशित सब्सट्रेट पर स्थिर वैद्युत निर्धारण एक विशेष रूप से सुविधाजनक विकल्प है जो एक ऋणात्मक जीटा संभाव्यता के ज्ञात एक्सोसोमों को स्थिर करने का एक विशेष रूप से सुविधाजनक विकल्प है। तथापि, वही स्थिर वैद्युत बल जो सतह पर बाह्यकोशिकीय vesicles को स्थिर करते हैं, उनके आकार को भी विकृत कर देते हैं, जो पोस्ट-इमेजिंग डेटा विश्लेषण को आवश्यक बनाता है। हम सतह पर स्थिर एक्सोसोम के विकृत आकार पर AFM डेटा के आधार पर समाधान में गोलाकार vesicles के आकार का अनुमान है कि एल्गोरिथ्म का वर्णन करके इस बिंदु विस्तृत.
विकसित प्रोटोकॉल में, vesicles के मजबूत स्थिर वैद्युत स्थिरीकरण के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत की है और हाइड्रेटेड या desicated राज्यों में परमाणु बल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदम के बाद. स्थिर vesicles की सतह एकाग्रता को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान की जाती है। मार्गदर्शन कैसे समाधान में EVs के विभिन्न सांद्रता के साथ नमूने के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक immobilization प्रदर्शन करने के लिए पर दिया जाता है. अकर्मण्यता वाले vesicles की पर्याप्त बड़ी संख्या के आधार पर विभिन्न जैवभौतिक गुणों के अनुभवजन्य प्रायिकता वितरण के आकलन की अनुमति देने वाली प्रयोगात्मक स्थितियों के चयन पर चर्चा की जाती है। AFM डेटा के बाद-इमेजिंग विश्लेषण के उदाहरण दिए गए हैं. विशेष रूप से, एक एल्गोरिथ्म immobilized EVs के AFM विशेषता के आधार पर समाधान में vesicles के आकार का निर्धारण करने के लिए वर्णित है. प्रतिनिधि परिणाम क्रायो-टीईएम इमेजिंग के परिणामों के साथ AFM द्वारा vesicle आकार की स्थिरता दिखाते हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomes और अन्य extracellular vesicles (EVs) आणविक एक लिपिड झिल्ली vesicle से मिलकर परिसरों रहे हैं, झिल्ली प्रोटीन और अन्य अणुओं द्वारा इसकी सतह सजावट, और विविध luminal सामग्री एक माता पिता की कोशिका से विरासत में मिला है, जो आरएनए शामिल हैं, प्रोटीन, और डी.एन.ए. ईवीएस के हाइड्रोडायनामिक आकार की विशेषता, जो आशय के आकार और सतह सजावट द्वारा बनाई गई कोरोनल परत पर निर्भर करती है, दिनचर्या बन गई है। एक्सोसोम के लिए, ईवीएस का सबसे छोटा, हाइड्रोडायनामिक और vesicles आकार के बीच सापेक्ष अंतर महत्वपूर्ण है। क्रायोजेनिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) इमेजिंग, एक सोने के मानक तकनीक द्वारा vesicles आकार की विशेषता, साधन की लागत के कारण एक चुनौती बनी हुई है, नमूना तैयारी करने के लिए आवश्यक विशेषज्ञता, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण, और कणों की एक छोटी संख्या अक्सर छवियों में मनाया. एक व्यापक रूप से उपलब्ध है और सुलभ विकल्प परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM), जो तीन आयामी ज्यामिति, आकार, और extracellular vesicles के अन्य biophysical गुणों पर बहुमुखी डेटा का उत्पादन कर सकते हैं. विकसित प्रोटोकॉल इस विश्लेषणात्मक उपकरण का उपयोग करने में उपयोगकर्ताओं गाइड और AFM द्वारा EVs के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह की रूपरेखा, जो हाइड्रेटेड या desicated रूप में इमेजिंग EVs के लिए नमूना तैयारी भी शामिल है, इलेक्ट्रोस्टैटिक स्थिरीकरण के एक सब्सट्रेट पर vesicles, डेटा अधिग्रहण, इसके विश्लेषण, और व्याख्या. प्रतिनिधि परिणाम संशोधित अभ्रक सतह पर EVs के निर्धारण उम्मीद के मुताबिक, अनुकूलन है कि प्रदर्शन, और vesicles की एक बड़ी संख्या के लिए आकार परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. एएफएम डेटा के आधार पर आशय आकार कया-टीईएम इमेजिंग के अनुरूप पाया गया।

EVs की सतह निर्धारण इमेजिंग अनुक्रम में एक महत्वपूर्ण कदम है. एक्सोसोम की इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह स्थिरीकरण, एक नकारात्मक जीटा क्षमता के लिए जाना जाता है, सूक्ष्मता के सब्सट्रेट एक सकारात्मक सतह प्रभारी ?...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

एक कदम दर कदम प्रक्रिया तरल नमूनों और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा उनके इमेजिंग से एक्सोसोम और extracellular vesicles के लेबल मुक्त अचलीकरण के लिए वर्णित है. AFM छवियों समाधान में vesicles के आकार का अनुमान है और अन्य biophysical गुणों की विशेषता के लिए उपयोग किया जाता है.

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

यह प्रोटोकॉल हाइड्रेटेड और डिसिकेटेड रूपों में एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स के एएफएम इमेजिंग के लिए सरल तैयारी, उनके इलेक्ट्रोस्टैटिक इम्मोबिलाइजेशन, सरफेस स्कैनिंग, वेसिकल आइडेंटिफिकेशन और डेटा एनालिसिस और इंटरप्रिटेशन को रेखांकित करता है । इस तकनीक का मुख्य लाभ त्वचा की सतह पर वेसिकल्स का सुविधाजनक इलेक्ट्रोस्टैटिक निर्धारण और स्थिरीकरण के कारण आकार विरूपण के लिए खाते में पोस्ट इमेजिंग विश्लेषण है। प्राप्त वेसिकल्स आकार देने वाले परिणाम गोल्ड स्टैंडर्ड क्रायोटेम इमेजिंग के अनुरूप हैं जो महंगी और चुनौतीपूर्ण तकनीक बनी हुई है।यदि आप एक नए AFM उपयोगकर्ता हैं, तो हाइड्रेटेड नमूनों पर आगे बढ़ने से पहले सूखे नमूनों के लक्षण वर्णन के साथ शुरू करें। क्योंकि कई अतिरिक्त कारक हैं जो हाइड्रेटेड नमूना अधिग्रहण को प्रभावित कर सकते हैं। शुरू करने के लिए, एक जैव-तरल पदार्थ से एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स को अलग करें जैसा कि साथ वाले टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित है।इसके बाद, मजबूती से एक चुंबकीय स्टेनलेस स्टील नमूना डिस्क के लिए एक अभ्रक डिस्क देते हैं। सामग्री की एक नई परत का पर्दाफाश करने के लिए एक तेज उस्तरा का उपयोग करके अभ्रक डिस्क क्लीव। कमरे के तापमान पर, दस मिलीमोलर निकल द्वितीय क्लोराइड समाधान के एक सौ सूक्ष्म लीटर के साथ दस सेकंड के लिए अभ्रक की शीर्ष सतह का इलाज करें।यह सतह के आवेश को नकारात्मक से सकारात्मक तक संशोधित करता है। एक लिंट मुक्त पोंछ या ब्लॉटिंग पेपर के साथ निकल द्वितीय क्लोराइड समाधान दाग। फिर, अभ्रक सतह को तीन बार डियोनाइज्ड पानी से धोएं और इसे सूखी नाइट्रोजन की धारा से सुखा लें।संलग्न सतह संशोधित अभ्रक के साथ एएफएम नमूना डिस्क को पेट्री डिश में रखें। इसके बाद, समाधान के मिलीलीटर प्रति चार और चालीस अरब कणों के बीच एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस के साथ एक्सोसोम्स को पतला करें। नैनो कण ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग कर पतला कण एकाग्रता को मान्य करें।एक पिपेट से पतला एक्सोसोम समाधान के एक सौ माइक्रोलीटर को खाली करके अभ्रक की सतह पर एक सेसाइल ड्रॉप बनाएं। इसके बाद पेट्री डिश पर ढक्कन रखें और सैंपल वाष्पीकरण को कम करने के लिए पैराफेन फिल्म के साथ इसे सील करें। बारह घंटे तक फ्रिज में इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, सतह को परेशान किए बिना 80 से 90 प्रतिशत नमूने को ध्यान से बढ़ाएं। इस बिंदु पर, एक्सोसोम्स को अभ्रक सब्सट्रेट पर इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से स्थिर किया जाएगा। जब हाइड्रेटेड नमूने इमेजिंग, पीबीएस के साथ तीन बार सतह कुल्ला ।कुल्ला प्रक्रिया के दौरान नमूना हाइड्रेटेड रखने के लिए ध्यान रखें। पीबीएस के साथ अभ्रक सतह धोने के बाद, नमूना कवर करने के लिए ताजा पीबीएस के तरल और पिपेट ४० माइक्रोलीटर के ८० से ९० प्रतिशत को हटा दें । हाइड्रेटेड सैंपल इमेजिंग के लिए तैयार है।जब डिजिकेटेड ईवी की इमेजिंग करते हैं, तो सब्सट्रेट को डिओनाइज्ड पानी के साथ तीन बार कुल्ला करके सतह से लवण निकालें। सतह को छूने के बिना, जितना संभव हो उतना तरल होने के बाद, सूखे नाइट्रोजन की धारा के साथ बाकी को सुखाएं। डेसिकेटेड एक्सेरसेलर वेसिकल्स को इमेज करने के लिए, टैपिंग और नॉन-कॉन्टैक्ट इमेजिंग मोड में हवा में स्कैनिंग के लिए डिजाइन किए गए कैंटिलीवर का चयन करें और इसे जांच धारक पर माउंट करें।नमूना एएफएम चरण पर रखें। चुंबकीय स्टेनलेस स्टील नमूना डिस्क मंच पर नमूना स्थिर होगा। जांच धारक को एएफएम में रखें।तैयारी और मंच के लिए समय की अनुमति थर्मल संतुलन के लिए । एक हर्ट्ज की स्कैन दर पर 512 लाइनों में 5x5 माइक्रोन वाले क्षेत्र को स्कैन करने के लिए टैपिंग मोड का उपयोग करें। ऊंचाई और चरण छवियों दोनों प्राप्त करें क्योंकि वे स्थलाकृति और नमूने के सतह गुणों पर मानार्थ जानकारी प्रदान करते हैं।स्कैन समय एक इमेज्ड क्षेत्र और छवि बनाने के लिए चयनित लाइनों की संख्या के साथ वृद्धि होगी, लेकिन स्कैन दर के साथ कमी । चूंकि तेजी से स्कैन दरें छवि की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती हैं, इसलिए रैस्टरिंग की गति अधिग्रहण समय और छवि की गुणवत्ता के बीच संतुलन होना चाहिए। हाइड्रेटेड वेसिकल्स की छवि के लिए, एक कैंटिलीवर का चयन करें जो नरम, हाइड्रेटेड नमूनों को स्कैन करने के लिए उपयुक्त है और तरल पदार्थों में स्कैनिंग के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोब होल्डर पर कैंटिलीवर माउंट करें।स्कैनिंग के दौरान तरल में हवा के बुलबुले शुरू करने की संभावना को कम करने के लिए पीबीएस के साथ कैंटिलीवर की नोक को गीला करें। फिर, एएफएम चरण पर नमूने को स्थिर करें। एक बार नमूना थर्मल रूप से संतुलन, दोहन मोड में हाइड्रेटेड अभ्रक सतह छवि ।ऊंचाई और चरण दोनों छवियों को प्राप्त करें। ली गई छवियों का विश्लेषण करने के लिए, सबसे पहले डेटा प्रोसेस के चयन एसपीएम मोड पर जाएं, इसके बाद टिप' और मॉडल टिप का चयन करें और नमूने को स्कैन करने के लिए उपयोग की जाने वाली टिप के आयामों को चुनें और सतह पुनर्निर्माण का प्रदर्शन करके टिप कटाव कलाकृतियों को ओके 'सही करें। छवि खोलें।मेनू से, डेटा प्रोसेस का चयन करें'फिर Tip'then द्वारा देखें गया हैल्ट रिकंस्ट्रक्शन'और क्लिक करें ओके'नेक्स्ट, लेवल के बाद डेटा प्रक्रिया का चयन करें और इमेजिंग प्लेन को संरेखित करने और स्कैन डेटा से सब्सट्रेट में झुकाव को हटाकर प्रयोगशाला एक्सवाई विमान से मेल खाने के लिए प्लेन लेवल का चयन करें। सही डेटा द्वारा अपनाई गई डेटा प्रोसेस का चयन करके छवि में पंक्तियों को संरेखित करें और फिर संरेखित पंक्तियों का चयन करें' औसत सहित कई संरेखण विकल्प उपलब्ध हैं जो एक एल्गोरिदम है जो प्रत्येक स्कैन लाइन की औसत ऊंचाई पाता है और इसे डेटा से घटाता है। इसके बाद, सही डेटा के बाद डेटा प्रोसेस पर जाएं और निशान को हटाएं ' चुनें यह शून्य ऊंचाई पर अभ्रक सतह को संरेखित करने के लिए निशान के रूप में जानी जाने वाली सामान्य स्कैनिंग त्रुटियों को हटा देगा, डेटा प्रोसेस मेनू पर जाएं और लेवल 'ड्रॉप डाउन मेनू में समतल बेस' का चयन करें।अनाज के मेनू में जाकर स्कैन की गई सतह पर अतिरिक्त सेलुलर वेसिकल्स की पहचान करें और थ्रेसहोल्ड द्वारा मार्क का उपयोग करके' यह एल्गोरिदम सतह स्थिर एक्सोसोम्स को उपयोगकर्ता चयनित सीमा के ऊपर ऊंचाई से शून्य सतह सब्सट्रेट से फैला हुआ कणों के रूप में पहचानता है। एक और तीन नैनोमीटर के बीच की सीमा में एक सीमा का चयन करें। इससे सबसे पीछे जमीनी हस्तक्षेप खत्म हो जाएगा।अंत में, अनाज के मेनू से सुलभ उपलब्ध वितरण एल्गोरिदम का उपयोग करके पहचाने गए वेसिकल्स का ज्यामितीय और आयामी लक्षण वर्णन करें। अन्य कंप्यूटेशनल टूल और कस्टम कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा विशेष विश्लेषण के लिए Gwyddion से एएफएम डेटा निर्यात करें। निकेल क्लोराइड सतह संशोधन के परिणामस्वरूप अतिरिक्त सेलुलर वेसिकल्स का स्थिरीकरण होता है जो समय निर्भर करता है।स्थिर वेसिकल्स की सतह एकाग्रता इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद अत्यधिक घनी होती है जबकि 12 घंटे इनक्यूबेशन कम एक्सोसोम और स्कैन डेटा की ओर जाता है जो सही विश्लेषण करना आसान होता है। यह एएफएम छवि संशोधित अभ्रक सतह पर हाइड्रेटेड एमसीएफ7 एक्सोसोम्स को विद्युत रूप से स्थिर दिखाती है। इसी AFM चरण छवि की पुष्टि करता है कि ऊंचाई छवि में अनाज नरम नैनो कण हैं जैसा कि झिल्ली वेसिकल्स के लिए अपेक्षित होना चाहिए।एक ही लाइन के साथ तीन वेसिकल्स के लिए ऊंचाई डेटा यहां दिखाया गया है । ये प्रोफाइल संशोधित अभ्रक की सकारात्मक आवेश सतह पर एक्सोसोम्स के इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण के कारण एक चपटा आकार दर्शाते हैं। आकार विरूपण स्थिर वेसिकल और इसके क्रॉस सेक्शन के विस्तार दृश्य में स्पष्ट है।समाधान में एक्सोसोम्स के गोलाकार आकार का अनुमान लगाने के लिए, सतह स्थिर और गोलाकार झिल्ली लिफाफे से घिरे वॉल्यूम से मेल खा सकते हैं। समाधान में गोलाकार वेसिकल्स का आकार वितरण 561 स्थिर वेसिकल्स के एएफएम डेटा से निर्धारित किया गया था। क्रायोटेम छवियों में वेसिकल आकार एएफएम परिणामों के अनुरूप हैं।हाइरेटेड एक्सोसोम्स इमेजिंग से पहले, पीबीएस के साथ सतह को अच्छी तरह से कुल्ला करना याद रखना महत्वपूर्ण है। यह इनबाउंड एक्सोसोम्स को दूर करेगा और एएफएम टिप के प्रति उनके लगाव को रोकेगा। जब डिजिकेटेड एक्सोसोम्स इमेजिंग करते हैं, तो सब्सट्रेट को बढ़ने के लिए डीआई पानी का उपयोग करना सुनिश्चित करें।डीआई वॉश सतह पर नमक क्रिस्टल के गठन को रोक देगा क्योंकि सब्सट्रेट सूख जाता है। यदि वर्तमान, नमक क्रिस्टल छवि प्रसंस्करण एक मुश्किल काम कर देगा ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

परमाणु पैमाने पर Macromolecular विधानसभाओं के संरचनात्मक अध्ययन ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

जिगर से ऊतक extracellular Vesicles के अलगाव

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Nanoparticle-ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ मानव रक्त में एकल Extracellular बुलबुले के तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित लक्षण वर्णन

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

संरचना और Nucleosomes की गतिशीलता परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग कर की जांच

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...