Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della National Science Foundation (numero di premio IGERT-0903715), dell'Università dello Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant e Graduate Research Fellowship Award), e dell'Istituto di Scienza di Skolkovo e dell'Istituto di Scienza di Skolkovo e tecnologia (Skoltech Fellowship).

1. Isolamento dei veicoli elettrici da un biofluido
<ol><li>Isolare gli EV con uno dei metodi stabiliti, come l'ultracentrifugazione differenziale8, precipitazioni o cromatografia di esclusione di dimensioni9.</li>
	<li>Confermare la presenza di biomarcatori superficiali e luminali previsti e l'assenza di biomarcatori che indicano la contaminazione incrociata della preparazione. Confermare la morfologia del bistrato lipidico delle particelle isolate media...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

L'immobilizzazione dei veicoli elettrici da un fluido biologico, la scansione superficiale e l'analisi delle immagini sono i passi essenziali del protocollo sviluppato per la caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici in liquido. Il numero di vesciche suscettibili di imaging AFM scala con la superficie di immagine e la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate sul substrato. Dato un potenziale zeta negativo di espeeedanti18, sosteniamo la fissazione elettrostatica dei veicoli elett...

Le vesciche extracellulari (EV) sono presenti in tutti i fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte e liquido amniotico. Gli esosomiti formano una classe distrettuale di veicoli elettrici differenziati dagli altri VE dalla biogenesi endosomica, dai marcatori del percorso endosomico e dalla dimensione più piccola tra tutti i veicoli elettrici. La dimensione degli esosomi è spesso riportata con una sostanziale variabilità tra gli studi. I risultati del dimensionamento sono risultati dipendenti dal metodo, riflettendo la differenza nei principi fisici impiegati da diverse tecniche analitiche per stimare le dimensioni EV1,2. Ad esempio, l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la tecnica di caratterizzazione delle dimensioni più utilizzata, stima la dimensione degli EV come diametri idrodinamici, che caratterizzano la resistenza alla mobilità browniana dei veicoli elettrici nella soluzione. Un diametro idrodinamico maggiore di una vescica implica la sua minore mobilità in liquido. Lo strato coronale intorno alle vesciche, costituito da proteine superficiali e altre molecole ancorate o adsorbite alla superficie della membrana, ostacola sostanzialmente la mobilità e aumenta le dimensioni idrodinamiche degli EV. In termini relativi, questo aumento è particolarmente elevato per gli esosomi3, come illustrato nella Figura 1.
La microscopia criogenica degli elettroni a trasmissione (crio-TEM) è una tecnica definitiva nella caratterizzazione delle dimensioni delle vescicole e della morfologia nei loro stati idratati. Tuttavia, l'elevato costo della strumentazione e le competenze specialistiche necessarie per utilizzarla motivano correttamente l'esplorazione di tecniche alternative in grado di identificare i veicoli elettrici idratati. Un numero relativamente ridotto di veicoli elettrici osservati o caratterizzati nelle immagini crio-TEM acquisite è un altro notevole svantaggio di questa tecnica.
La microscopia a forza atomica (AFM) visualizza la topografia tridimensionale degli EV idratati o desiccati4,5,6 mediante la scansione di una sonda sul substrato per raster l'immagine delle particelle sulla superficie. Le fasi essenziali del protocollo per caratterizzare i veicoli elettrici da aFM sono descritte in questo studio. Prima di imaging delle vesciche in liquido, devono essere immobilizzate su un substrato legandosi a una superficie funzionalizzata, intrappolando in un filtro o per attrazione elettrostatica7. La fissazione elettrostatica su un substrato caricato positivamente è un'opzione particolarmente conveniente per l'immobilizzazione degli esosomi noti per avere un potenziale zeta negativo. Tuttavia, anche le stesse forze elettrostatiche che immobilizzano le vesciche extracellulari sulla superficie distorcono la loro forma, il che rende essenziale l'analisi dei dati post-imaging. Elaboriamo questo punto descrivendo l'algoritmo che stima la dimensione delle vescicoli globulari nella soluzione sulla base dei dati AFM sulla forma distorta degli esosomi immobilizzati sulla superficie.
Nel protocollo sviluppato, viene presentata la procedura per la robusta immobilizzazione elettrostatica delle vescicole e seguita dai passaggi necessari per eseguire l'imaging della forza atomica negli stati idratati o desiclati. Vengono identificati i fattori che influenzano la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate. La guida è fornita su come eseguire l'immobilizzazione elettrostatica per campioni con diverse concentrazioni di EV nella soluzione. Viene discussa la selezione di condizioni sperimentali che consentano la stima delle distribuzioni di probabilità empiriche di diverse proprietà biofisiche sulla base di un numero sufficientemente elevato di vesciche immobilizzate. Vengono forniti esempi di analisi post-imaging dei dati AFM. In particolare, viene descritto un algoritmo per determinare la dimensione delle vesciche nella soluzione in base alla caratterizzazione AFM degli EV immobilizzati. I risultati rappresentativi mostrano la consistenza del dimensionamento della vescica da parte dell'AFM con i risultati dell'imaging crio-TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l'imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l'imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un'alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell'utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l'analisi dei veicoli elettrici da parte dell'AFM, che include la preparazione del campione per l'imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l'immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l'acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all'utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l'imaging crio-TEM.

La fissazione superficiale dei veicoli elettrici è un passaggio fondamentale nella sequenza di imaging. L'immobilizzazione elettrostatica della superficie degli esosomi, nota per avere un potenziale zeta negativo, si verificherà in modo robusto dopo che il substrato della mica viene modificato per avere una carica superficiale positiva. Senza il trattamento con NiCl2 per impartire cambiamenti positivi di superficie, l'immobilizzazione dei veli sul substrato è risultata inefficace. L'immagine dell'altezza in...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Viene descritta una procedura passo-passo per l'immobilizzazione senza etichette di esosomi e vescicoli extracellulari da campioni liquidi e la loro imaging mediante microscopia a forza atomica (AFM). Le immagini AFM vengono utilizzate per stimare le dimensioni delle vesciche nella soluzione e caratterizzare altre proprietà biofisiche.

Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Questo protocollo delinea una semplice preparazione per l'imaging AFM di vescicole extracellulari in forme idratate e essiccate, la loro immobilizzazione elettrostatica, la scansione superficiale, l'identificazione vescicale e l'analisi e l'interpretazione dei dati. Il vantaggio principale di questa tecnica è la comoda fissazione elettrostatica delle vescicole sulla superficie della pelle e l'analisi post-imaging per tenere conto della distorsione della forma causata dall'immobilizzazione. I risultati ottenuti per il dimensionamento delle vescicole sono coerenti con il Gold Standard CryoTEM Imaging che rimane una tecnica costosa e impegnativa.Se sei un nuovo utente AFM, inizia con la caratterizzazione dei campioni secchi prima di procedere ai campioni idratati. Perché ci sono numerosi fattori aggiuntivi che possono influire sull'acquisizione idratata del campione. Per iniziare, isolare le vescicole extracellulari da un bio-fluido come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.Successivamente, collegare saldamente un disco di mica a un disco di campione magnetico in acciaio inossidabile. Scindere il disco di mica utilizzando un rasoio affilato per esporre un nuovo strato di materiale. A temperatura ambiente, trattare la superficie superiore della mica per dieci secondi con cento micro litri di una soluzione di cloruro di nichel II da dieci millimolari.Ciò modifica la carica della superficie da negativa a positiva. Cancellare la soluzione di cloruro di nichel II con una salvietta priva di pelucchi o carta assorbente. Quindi, lavare la superficie della mica tre volte con acqua deionizzata e asciugarla con un flusso di azoto secco.Posizionare il disco campione AFM con la mica modificata della superficie attaccata in una piastra di Petri. Successivamente, diluire gli esosomi con PBS per ottenere una concentrazione tra quattro e quaranta miliardi di particelle per millilitro di soluzione. Convalidare la concentrazione di particelle diluite utilizzando l'analisi di tracciamento delle nano particelle.Formare una goccia di sessile sulla superficie della mica svuotando un centinaio di microlitri della soluzione esosoma diluita da una pipetta. Quindi posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e sigillare con pellicola di parafene per ridurre l'evaporazione del campione. Incubare in frigorifero per dodici ore.Dopo l'incubazione, aspirare attentamente dall'80 al 90% del campione senza disturbare la superficie. A questo punto, gli esosomi saranno elettrostaticamente immobilizzati sul substrato di mica. Quando si imaging campioni idratati, sciacquare la superficie tre volte con PBS.Fare attenzione a mantenere il campione idratato durante tutto il processo di risciacquo. Dopo aver lavato la superficie della mica con PBS, rimuovere dall'80 al 90% del liquido e pipettare quaranta microlitri di PBS fresco per coprire il campione. Il campione idratato è pronto per l'imaging.Quando si imaging l'EV essiccato, rimuovere i sali dalla superficie risciacquando il substrato tre volte con acqua deionizzata. Dopo aver aspirato il maggior liquido possibile, senza toccare la superficie, asciugare il resto con un flusso di azoto secco. Per visualizzare le vescicole extracellulari essiccate, selezionare un cantilever progettato per la scansione nell'aria in modalità di maschiatura e imaging senza contatto e montarlo sul supporto della sonda.Posizionare il campione sullo stadio AFM. Il disco magnetico in acciaio inossidabile immobilizzerà il campione sul palco. Posizionare il supporto della sonda nell'AFM.Lasciare il tempo alla preparazione e allo stadio di equilibrare termicamente. Utilizzare la modalità di maschiatura per scansionare un'area rastered 5x5 micron in 512 linee ad una velocità di scansione di un hertz. Acquisisci sia le immagini di altezza che di fase in quanto forniscono informazioni gratuite sulla topografia e sulle proprietà superficiali del campione.Il tempo di scansione aumenterà con un'area con immagini e il numero di righe selezionate per formare l'immagine, ma diminuirà con la velocità di scansione. Poiché i tassi di scansione rapidi possono influire sulla qualità dell'immagine, la velocità di rastering dovrebbe essere un equilibrio tra il tempo di acquisizione e la qualità dell'immagine. Per visualizzare vescicole idratate, selezionare un sbalzino appropriato per la scansione di campioni morbidi e idratati e montare il sbalzino su un supporto per sonda progettato per la scansione in liquidi.Bagnare la punta della sbalziera con PBS per ridurre la probabilità di introdurre bolle d'aria nel liquido durante la scansione. Quindi, immobilizzare il campione sullo stadio AFM. Una volta che il campione si equilibra termicamente, immagini la superficie della mica idratata in modalità di maschiatura.Acquisisci sia le immagini di altezza che di fase. Per analizzare le immagini scattate, passare prima alle modalità SPM selezionate del processo dati, seguite da Suggerimento', quindi scegliere Suggerimento modello'Selezionare la geometria e le dimensioni della punta utilizzata per scansionare il campione e fare clic su OK'Correggere gli artefatti di erosione della punta eseguendo la ricostruzione della superficie. Aprire l'immagine.Scegliere Processo dati dal menu,quindi Selezionare Modalità SPM'seguito da Suggerimento', quindi Scegliere Ricostruzione superficie', quindi fare clic su OK'Avanti, selezionare Processo dati, seguito da Livello' e scegliere Livello piano'per allineare il piano di imaging e abbinare il piano XY di laboratorio rimuovendo l'inclinazione nel substrato dai dati di scansione. Allineare le righe dell'immagine selezionando Processo dati'seguito da Dati corretti', quindi scegliere Allinea righe'Sono disponibili diverse opzioni di allineamento, inclusa la mediana, o che è un algoritmo che trova un'altezza media di ogni riga di scansione e la sottrae dai dati. Passare quindi a Processo dati'seguito da Dati corretti' e scegliere Rimuovi cicatrici'Rimuoverà gli errori di scansione comuni noti come Cicatrici'Per allineare la superficie mica all'altezza zero, passare al menu Processo dati' e selezionare Appiattisci base'nel menu a discesa Livello'.Identificare le vescicole cellulari aggiuntive sulla superficie scansionata andando al menu Grani e utilizzando Mark by Threshold'Questo algoritmo identifica gli esosomi immobilizzati in superficie come particelle che sporgono dal substrato di superficie zero per l'altezza al di sopra della soglia selezionata dall'utente. Selezionare una soglia compresa tra uno e tre nanometri. Ciò eliminerà la maggior parte delle interferenze sul retro.Infine, eseguire la caratterizzazione geometrica e dimensionale delle vescicole identificate utilizzando gli algoritmi di distribuzione disponibili accessibili dal menu Dei grani. Esportare i dati AFM da Gwyddion per l'analisi specializzata da parte di altri strumenti computazionali e programmi per computer personalizzati. La modifica della superficie del cloruro di nichel si traduce in un'immobilizzazione di vescicole cellulari extra che dipendono dal tempo.La concentrazione superficiale delle vescicole immobilizzate è eccessivamente densa dopo 24 ore di incubazione, mentre l'incubazione di 12 ore porta a meno esosomi e dati di scansione più facili da analizzare con precisione. Questa immagine AFM mostra esosomi MCF7 idratati immobilizzati elettrostaticamente sulla superficie della mica modificata. La corrispondente immagine di fase AFM conferma che i grani nell'immagine di altezza sono nanoparticelle morbide come ci si dovrebbe aspettare per le vescicole di membrana.I dati di altezza per tre vescicole lungo la stessa linea sono mostrati qui. Questi profili illustrano una forma appiattita causata dall'attrazione elettrostatica degli esosomi sulla superficie di carica positiva della mica modificata. La distorsione della forma è evidente in una vista ingrandita della vescicola immobilizzata e della sua sezione trasversale.Per stimare la dimensione globulare degli esosomi nella soluzione, on può corrispondere ai volumi racchiusi da involucri di membrana immobilizzati superficiali e sferici. La distribuzione delle dimensioni delle vescicole globulari nella soluzione è stata determinata dai dati AFM di 561 vescicole immobilizzate. Le dimensioni delle vesciche nelle immagini CryoTEM sono coerenti con i risultati AFM.Prima di imaging degli esosomi irdrati, è importante ricordare di risciacquare accuratamente la superficie con PBS. Ciò rimuoverà gli esosomi in entrata e ne impedirà l'attaccamento alla punta AFM. Quando si imagingno gli esosomi essiccati, assicurarsi di utilizzare l'acqua DI per aumentare il substrato.Il lavaggio DI impedirà la formazione di cristalli di sale sulla superficie mentre il substrato si asciuga. Se presenti, i cristalli di sale renderanno difficile l'elaborazione delle immagini.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Ricerca

Biochimica

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...