Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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著者らは、国立科学財団(賞番号IGERT-0903715)、ユタ大学(化学工学種子助成学科および大学院研究フェローシップ賞)、スコルコヴォ科学研究所からの財政的支援を認めています。と技術(スコルテックフェローシップ)。

1. 生体流体からのEVの分離
<ol><li>差動超遠心分離8、降水量、またはサイズ排除クロマトグラフィー9などの確立された方法のいずれかによってEVを分離する。</li>
	<li>期待される表面および発光バイオマーカーの存在および製剤のクロスコンタミネーションを示すバイオマーカーの欠如を確認する。電子顕微鏡で単離粒子の脂質二層形態を確認?...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

生体液からのEVの固定化、表面スキャン、画像解析は、液体中のEVのAFM特性解析のために開発されたプロトコルの重要なステップです。AFMイメージングに適した小胞の数は、画像化された表面積および基板上に固定化された小胞の表面濃度と共にスケールする。EVやエキソソーム18の負のゼータ電位を考えると、液体サンプルからAFM基板へのEVの静電固定を提唱する。固定化は...

細胞外小胞(EV)は、血液、尿、唾液、牛乳、羊水を含むすべての体液に存在する。エキソソームは、エンドソーム生体形成、エンドソーム経路のマーカー、およびすべてのEVの中で最小サイズによって他のEVと区別されるEVの地区クラスを形成します。エキソソームの大きさは、多くの場合、研究間の実質的な変動で報告されます。サイジング結果は、EVサイズ1、2を推定する異なる分析技術によって採用される物理原理の違いを反映して、方法依存性であることが判明した。例えば、最も広く使用されているサイズ特性解析技術であるナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、EVのサイズを流体力学的直径として推定し、溶液中のEVのブラウンモビリティに対する耐性を特徴付けます。小胞のより大きい流体力学の直径は液体の低い移動性を意味する。小胞の周りの冠状層は、表面タンパク質および膜表面に固定または吸着された他の分子からなる、実質的に移動性を阻害し、EVの流体力学的サイズを増加させる。相対的に見て、この増加は、図1に示すように、エキソソーム3に対して特に大きい。
低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングは、小胞の大きさと形態を水和状態で特徴付ける決定的な技術です。しかし、計測器のコストが高く、それを正しく使用するために必要な専門知識は、水和されたEVを画像化できる代替技術の探求を動機づけます。取得したクライオ-TEM画像で観測または特徴付けられた比較的少数のEVは、この技術のもう一つの顕著な欠点です。
原子力顕微鏡(AFM)は、水和または乾燥したEV4、5、6の3次元地形を可視化し、基板全体のプローブをスキャンして表面上の粒子の画像をラスター化する。本研究では、AFMによってEVを特徴付けるプロトコルの本質的なステップについて概説する。小胞を液体中で撮像する前に、機能性表面へのテザリング、フィルタ内の捕捉、または静電引き付け7によって基板上に固定化されなければならない。正に帯電した基板上の静電固定は、負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの固定化のための特に便利なオプションである。しかし、表面上の細胞外小胞を固定するのと同じ静電力もその形状を歪め、ポストイメージングデータ解析が不可欠です。この点を詳しく説明するには、表面に固定化されたエキソソームの歪んだ形状に関するAFMデータに基づいて、溶液中の球状小胞の大きさを推定するアルゴリズムを説明する。
開発されたプロトコルでは、小胞の堅牢な静電固定化の手順が提示され、水和または乾燥状態で原子力イメージングを実行するために必要な手順が続きます。固定化された小胞の表面濃度に影響を与える因子が同定される。このガイダンスは、溶液中のEV濃度が異なるサンプルに対して静電固定を実行する方法について説明します。十分に多数の固定化小胞に基づく異なる生物物理特性の経験的確率分布の推定を可能にする実験条件の選択が議論される。AFMデータのポストイメージング分析の例が示される。具体的には、固定化されたEVのAFM特性に基づいて溶液中の小胞の大きさを決定するためのアルゴリズムが記載されている。代表的な結果は、凍結TEMイメージングの結果とAFMによる小胞サイジングの一貫性を示す。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

エキソソームおよび他の細胞外小胞(EV)は、脂質膜小胞、膜タンパク質および他の分子による表面装飾、およびRNAを含む親細胞から受け継がれた多様な発光含有量からなる分子複合体であり、タンパク質、および DN。小胞の大きさや表面装飾によって形成される冠状層に依存するEVの流体力学的サイズの特性化は、日常化している。EVの最小であるエキソソームの場合、流体力学と小胞のサイズの相対的な差は重要です。低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングによる小胞サイズの特性解析は、金の標準的な技術であり、機器のコスト、サンプル調製、イメージングおよびおよびデータ分析、および画像で観察される粒子の数が少ない。広く利用可能でアクセス可能な代替手段は、原子力顕微鏡(AFM)であり、3次元幾何学、サイズ、および細胞外小胞の他の生物物理学的特性に関する多目的なデータを生成することができる。開発されたプロトコルは、この分析ツールを利用するユーザーを導き、水和または乾燥した形でEVをイメージングするためのサンプル準備を含むAFMによるEVの分析のためのワークフローを概説し、静電固定基板上の小胞、データ取得、分析、および解釈。代表的な結果は、変更されたマイカ表面上のEVの固定が予測可能でカスタマイズ可能であり、ユーザーが多数の小胞のサイジング結果を得ることを可能にすることを示しています。AFMデータに基づく小胞サイジングは、クライオ-TEMイメージングと一致することがわかった。

EVの表面固定は、イメージングシーケンスの重要なステップです。負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの静電表面固定化は、マイカの基板が正の表面電荷を有するように修飾された後に強く起こるであろう。NiCl2による処理を行わずに表面変化を良好に付与すると、基板上のEVの固定化は効果がないことが判明した。図10Aの高さ画像は、PBS?...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

液体試料からのエキソソームおよび細胞外小胞の標識フリー固定化および原子間力顕微鏡(AFM)によるイメージングに関するステップバイステップの手順について説明する。AFM画像は、溶液中の小胞のサイズを推定し、他の生物物理学的特性を特徴付けるために使用されます。

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

このプロトコルは、水和および乾燥した形態における細胞外小胞のAFMイメージング、静電固定化、表面スキャン、ベシカル同定、およびデータ分析および解釈のための簡単な準備を概説する。この技術の主な利点は、皮膚表面上の小胞の便利な静電気固定と、固定化によって生じる形状の歪みを考慮したポストイメージング解析です。得られた小胞のサイジング結果は、コストがかかり、挑戦的な技術のままゴールドスタンダードCryoTEMイメージングと一致しています。AFM の新規ユーザーの場合は、まず乾燥サンプルの特性評価から始めてから、水和サンプルに進みます。水和サンプルの取得に影響を与える可能性のある追加の要因が数多く存在するため。まず、付随するテキストプロトコルに記載されているように、生体液から細胞外小胞を分離する。次に、磁気ステンレス製の試料ディスクにマイカディスクをしっかりと取り付けます。材料の新しい層を公開するために鋭いカミソリを使用してマイカディスクを切断します。室温では、10ミリモルニッケルII塩化溶液の100マイクロリットルで10秒間、マイカの上面を処理します。これにより、サーフェスの電荷が負から正に変化します。リントフリーワイプまたはブロッティングペーパーでニッケルII塩化液をブロットします。その後、水を脱イオン水でマイカ表面を3回洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。アタッチされた表面修正マイカとAFM標本ディスクをシャーレに入れます。次に、エキソソームをPBSで希釈し、溶液1ミリリットル当たり40億粒子から400億粒子の濃度を得る。ナノ粒子追跡解析を用いて、希釈粒子濃度を検証します。ピペットから希釈したエキソソーム溶液の100マイクロリットルを空にすることによって、マイカの表面にセスシルドロップを形成します。その後、シャーレに蓋を置き、パラフェンフィルムで密封してサンプルの蒸発を減らします。冷蔵庫で12時間インキュベートします。インキュベーション後、試料の80〜90%を表面を乱すことなく慎重に吸引する。この時点で、エキソソームは、マイカ基板上に静電固定化される。水和サンプルをイメージングする場合は、PBSで表面を3回リンスします。リンスプロセス全体を通してサンプルを水分補給してください。PBSでマイカ表面を洗浄した後、液体の80〜90パーセントを取り除き、サンプルをカバーするために新鮮なPBSのピペット40マイクロリットルを除去する。水和サンプルは、イメージングの準備ができています。脱熱したEVを撮像する際、脱イオン水で基板を3回リンスして表面から塩を取り除きます。できるだけ多くの液体を吸引した後、表面に触れることなく、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させる。乾燥した細胞外小胞を画像化するには、タップおよび非接触イメージングモードで空気中をスキャンするように設計された片持ち体を選択し、プローブホルダーに取り付けます。サンプルを AFM ステージに配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクはステージ上のサンプルを固定する。プローブホルダーをAFMに入れる。準備とステージが熱的に平衡化する時間を待ちます。タップモードを使用して、512 本のラインでラスター化された 5x5 ミクロンのエリアを、1 つのヘルツのスキャンレートでスキャンします。高さと位相の両方の画像を取得し、サンプルの地形と表面特性に関する無料の情報を提供します。スキャン時間は、画像領域と画像を形成するために選択されたラインの数によって増加しますが、スキャン速度に応じて減少します。高速スキャン速度はイメージ品質に影響を与える可能性があるため、ラスタリングの速度は取得時間と画質のバランスをとる必要があります。水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルをスキャンするのに適した片持ち面を選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち体を取り付けます。PBSで片持ちレバーの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。次に、サンプルをAFMステージに固定化します。サンプルが熱的に平衡したら、水和したマイカ表面をタッピングモードで画像化します。高さと位相の両方の画像を取得します。撮影した画像を分析するには、まずデータプロセスの選択 SPM モードに移動し、次に「ヒント」を選択し、サンプルのスキャンに使用するジオメトリとチップの寸法を選択し、OK をクリックして、サーフェスの再構築を実行してチップの腐食アーティファクトを修正します。画像を開きます。メニューから[データ処理]を選択し、[SPMモード]を選択してから[チップ]を選択し、[OK]を選択して[次へ]をクリックし、[データプロセス]を選択して[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択して、イメージング平面を整列させ、スキャンデータから基板の傾きを取り除いて実験室のXY平面に一致させます。[データプロセス]の[次に正しいデータ]を選択して画像内の行を整列し、[行を整列]を選択し、各スキャンラインの平均高さを検出してデータから減算するアルゴリズムである中央値を含む複数の整列オプションを使用できます。次に、データプロセスの後に[修正データ]に移動し、[傷跡を取り除く]を選択し、これは「スカーズ」と呼ばれる一般的なスキャンエラーを削除し、マイカサーフェスをゼロの高さに揃えるには、[データプロセス]メニューに移動し、[レベル]ドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択します。「グレインズ」メニューに移動し、「閾値によるマーク」を使用して、スキャンした表面上の余分な細胞小胞を特定する'このアルゴリズムは、ユーザーが選択した閾値を超える高さによってゼロ表面基板から突き出た粒子として表面固定化エキソソームを識別します。1 ナノメートルから 3 ナノメートルまでの範囲でしきい値を選択します。これにより、バック グラウンド干渉の大部分が排除されます。最後に、Grainsメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、同定された小胞の幾何学的および次元的特性を実行します。他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。塩化ニッケル表面改質は時間依存性の細胞外小胞の固定化をもたらす。固定化された小胞の表面濃度は、24時間のインキュベーション後に過度に密度が高く、12時間のインキュベーションは正確に分析しやすいエキソソームおよびスキャンデータを少なくする。このAFM画像は、改変マイカ表面に静電に固定化された水分補給MCF7エキソソームを示す。対応するAFM位相画像は、高さ画像の粒子が膜小胞に期待されるように軟ナノ粒子であることを確認します。同じ線に沿った 3 つの小胞の高さデータを次に示します。これらのプロファイルは、変性マイカの正電荷面へのエキソソームの静電引力によって引き起こされる平坦化形状を示す。形状の歪みは、固定化された小胞とその断面の拡大図で明らかである。溶液中のエキソソームの球状サイズを推定するために、上で固定化された表面および球状膜エンベロープによって囲まれた体積を一致させることができる。溶液中の球状小胞のサイズ分布は、561固定化小胞のAFMデータから決定した。クライオテム画像の小胞サイズは、AFMの結果と一致しています。ヒュルド化されたエキソソームをイメージングする前に、PBSで表面を十分に洗いすがることが重要です。これにより、インバウンドエキソソームが削除され、AFM チップへの添付ができなくなります。乾燥エキソソームを撮像する際には、必ず基板を上昇させるためにDI水を使用してください。DI洗浄は、基材が乾燥するにつれて表面に塩結晶が形成されるのを防ぎます。もし存在すれば、塩結晶は画像処理を困難な作業にする。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

赤外線ナノ分光法と原子間力顕微鏡による個々のタンパク質凝集物の特徴付け

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...