Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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저자는 국립 과학 재단 (수상 번호 IGERT-0903715), 유타 대학 (화학 공학 종자 보조금 및 대학원 연구 펠로우십 상), 그리고 과학의 스콜코보 연구소의 재정 지원을 인정 기술 (스콜테크 펠로우십).

1. 바이오 유체로부터 전기 자동차 분리
<ol><li>차등 초원심분리8,강수량 또는 크기 배제 크로마토그래피 와 같은 확립된 방법 중 하나에 의해 EV를분리한다.</li>
	<li>예상 표면 및 발광 바이오마커의 존재와 제제의 교차 오염을 나타내는 바이오마커의 부재를 확인합니다. 전자 현미경검사법에 의해 단리된 입자의 지질 이중층 형태를 확인한다. 참...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. 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K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

생물학적 유체, 표면 스캐닝 및 이미지 분석에서 전기 EV의 고정은 액체에서 EV의 AFM 특성화를 위한 개발된 프로토콜의 필수 단계입니다. AFM 이미징 스케일에 대한 소포의 수는 기판 상에 고정된 소포의 표면적 및 표면 농도를 갖는다. 전기 자동차및 엑소좀18의부정적인 제타 전위를 감안할 때, 우리는 액체 샘플에서 AFM 기판에 이르기까지 전기 전기 적 고정을 옹호합니다. 고정은 ...

세포밖 소포 (EV)는 혈액, 소변, 타액, 우유 및 양수를 포함하여 모든 체액에서 존재합니다. 엑소좀은 내생 생물발생, 내생 통로의 마커, 모든 EV 중 가장 작은 크기로 다른 EV와 차별화된 지역 형 EV 클래스를 형성합니다. 엑소좀의 크기는 종종 연구 사이 상당한 가변성으로 보고됩니다. 상기 크기 조정 결과는 EV 크기를 추정하기 위해 상이한 분석 기법에 의해 채택된 물리적 원리의 차이를 반영하여 EV 크기1,2를반영하는 방법에 의존하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 크기 특성 화 기법인 나노 입자 추적 분석(NTA)은 용액에서 EV의 브라운 이동성에 대한 저항성을 특징짓는 유체역학적 직경으로 EV의 크기를 추정합니다. 소포의 더 큰 유체 역학 직경은 액체에서 낮은 이동성을 의미합니다. 표면 단백질 및 멤브레인 표면에 고정되거나 흡착된 다른 분자로 구성된 소포 주위의 관상 층은 이동성을 실질적으로 방해하고 전기 EV의 유체 역학적 크기를 증가시킵니다. 상대적인 측면에서, 이러한 증가는 그림 1에도시된 바와 같이 엑소좀3에대해 특히 크다.
극저온 투과 전자 현미경 검사법 (cryo-TEM) 화상 진찰은 그들의 수화한 상태에서 소포 크기 및 형태를 특성화하는 결정적인 기술입니다. 그러나 계측기의 높은 비용과 이를 사용하는 데 필요한 전문 지식은 수화된 전기 를 이미지화할 수 있는 대체 기술의 탐구에 정확하게 동기를 부여합니다. 획득된 극저온-TEM 이미지에서 관찰되거나 특징지어지는 비교적 적은 수의 EV는 이 기술의 또 다른 주목할 만한 단점이다.
원자력 현미경 검사법(AFM)은 표면에 입자의 이미지를 래스터하기 위해 기판을 가로질러 프로브를 스캐닝함으로써 수화 또는 건조된 EV4,5,6의 3차원 지형을 시각화한다. AFM에 의해 전기 를 특성화하는 프로토콜의 필수 단계는이 연구에서 설명되어 있습니다. 액체에 소포를 이미징하기 전에, 그들은 기능화 된 표면에 테더링, 필터에 트래핑, 또는 정전기 인력7에의해 기판에 고정되어야한다. 양전하 기판상정전기 고정은 음의 제타 전위를 가지는 것으로 알려진 엑소좀의 고정화를 위한 특히 편리한 옵션이다. 그러나 표면에 세포외 소포를 고정시키는 동일한 정전기력도 모양을 왜곡하여 이미징 후 데이터 분석이 필수적입니다. 우리는 표면에 고정 된 엑소좀의 왜곡 된 모양에 AFM 데이터를 기반으로 솔루션의 구형 소포의 크기를 추정하는 알고리즘을 설명하여이 점을 정교하게.
개발 된 프로토콜에서 소포의 강력한 정전기 고정을위한 절차가 제시되고 수화 또는 건조 된 상태에서 원자력 이미징을 수행하는 데 필요한 단계가 뒤따릅니다. 고정된 소포의 표면 농도에 영향을 미치는 요인이 확인됩니다. 이 지침은 용액에서 서로 다른 농도의 EV를 가진 시료에 대한 정전기 고정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 충분히 많은 수의 고정된 소포에 기초하여 상이한 생물물리학적 성질의 경험적 확률 분포의 추정을 허용하는 실험 조건의 선택이 논의된다. AFM 데이터의 사후 이미징 분석의 예가 제공됩니다. 구체적으로, 고정화 EV의 AFM 특성화에 기초하여 용액내 소포의 크기를 결정하기 위한 알고리즘이 설명된다. 대표적인 결과는 극저온-TEM 이미징의 결과와 AFM에 의한 소포 크기 조정의 일관성을 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

엑소좀 및 기타 세포외 소포(EV)는 지질막 소포, 막 단백질 및 기타 분자에 의한 표면 장식, RNA를 포함하는 모세포로부터 상속된 다양한 발광 량으로 구성된 분자 복합체이며, 단백질, 및 DNA. 소포의 크기와 표면 장식에 의해 형성된 관상 층의 크기에 따라 달라지는 전기 자동차의 유체 역학적 크기의 특성화는 일상화되었습니다. 엑소좀, 전기 의 가장 작은, 유체 역학 과 소포 크기 사이의 상대적 차이는 중요하다. 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 이미징에 의한 소포 크기의 특성화는 금 본위제 기술인 금본위제 기술로 인해 기기 의 비용, 시료 준비, 이미징 및 이미지에서 관찰되는 소수의 입자를 분석합니다. 널리 이용가능하고 접근 가능한 대안은 3차원 기하학, 크기 및 세포외 소포의 그밖 생물물리학적 특성에 대한 다양한 데이터를 생성할 수 있는 원자력 현미경 검사법(AFM)입니다. 개발된 프로토콜은 사용자가 이 분석 도구를 활용하게 하는 데 지침이 되며, AFM에 의한 전기자동차 분석을 위한 워크플로우를 간략하게 설명하며, 여기에는 수화 또는 건조 형태로 이미징 EV를 위한 샘플 준비, 정전기 적 고정화 고정화 기판, 데이터 수집, 분석 및 해석에 대한 소포. 대표적인 결과는 수정된 운소 표면에 전기 를 고정하는 것이 예측 가능하고 사용자 정의 가능하며 사용자가 많은 수의 소포에 대한 크기 조정 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. AFM 데이터에 기초한 소포 크기 조정은 저온-TEM 이미징과 일치하는 것으로 나타났다.

전기 자동차의 표면 고정은 이미징 시퀀스에서 중요한 단계입니다. 음의 제타 전위를 가진 것으로 알려진 엑소좀의 정전기 표면 고정은 운모의 기질이 양극성 표면 전하를 갖도록 변형된 후에 강력하게 발생합니다. NiCl2를 사용하여 양성 표면 변화를 부여하지 않으면 기판 상에서 의 전추가 비효율적인 것으로 나타났습니다. 도 10A의높이 이미지는, PBS의 mL당 2.59 x 10<...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

단계별 절차는 액체 견본에서 엑소좀 및 세포외 소포의 표지 자유로운 고정을 위해 기술되고 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의하여 그들의 화상 진찰. AFM 이미지는 용액에서 소포의 크기를 추정하고 다른 생물 물리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

이 프로토콜은 수화 및 건조 된 형태로 세포 외 소포의 AFM 이미징, 정전기 고정, 표면 스캐닝, vesical 식별 및 데이터 분석 및 해석에 대한 간단한 준비를 간략하게 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 피부 표면에 소포의 편리한 정전기 고정및 고정으로 인한 모양 왜곡을 설명하기 위한 포스트 이미징 분석입니다. 획득한 소포 크기 조정 결과는 비용이 많이 들고 도전적인 기술로 남아있는 골드 스탠다드 CryoTEM 이미징과 일치합니다.새로운 AFM 사용자인 경우 수화 샘플을 진행하기 전에 건조 시료의 특성화로 시작합니다. 수화 샘플 획득에 영향을 미칠 수 있는 수많은 추가 요인이 있기 때문입니다. 시작하려면, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 생체 유체로부터 세포외 소포를 분리한다.다음으로, 마그네틱 스테인리스 시편 디스크에 마우스 디스크를 단단히 부착합니다. 날카로운 면도기를 사용하여 새로운 재료 층을 노출하여 운모 디스크를 크리브하십시오. 실온에서 10밀리알라 니켈 II 염화물 용액의 100 마이크로 리터로 10초 동안 운하의 상단 표면을 처리합니다.이렇게 하면 표면의 전하가 음수에서 양수로 수정됩니다. 니켈 II 염화물 용액을 보풀 프리 와이프 또는 블로팅 페이퍼로 블롯합니다. 그런 다음, 산화 된 물로 운하 표면을 세 번 씻고 건조 질소의 스트림으로 건조.부착된 표면 수정 된 운하와 AFM 표본 디스크를 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, PBS로 엑소좀을 희석하여 용액의 밀리리터당 4~40억 입자의 농도를 얻습니다. 나노 입자 추적 분석을 사용하여 희석된 입자 농도를 검증합니다.파이펫에서 희석된 외민용의 100 마이크로리터를 비우어, 운하의 표면에 세실 낙하를 형성한다. 그런 다음 뚜껑을 페트리 접시에 놓고 파라펜 필름으로 밀봉하여 시료 증발을 줄입니다. 12 시간 동안 냉장고에 인큐베이션.인큐베이션 후, 표면을 방해하지 않고 주의 깊게 샘플의 80 ~ 90 %를 흡인. 이 시점에서, 엑소솜은 정전기로 운모기판에 고정됩니다. 수화 된 샘플을 이미징 할 때 PBS로 표면을 세 번 헹구습니다.헹구기 과정 전반에 걸쳐 샘플을 수화상태로 유지하십시오. PBS로 운하 표면을 세척한 후, 시료를 커버하기 위해 신선한 PBS의 액체 및 파이펫 40 마이크로리터의 80~90%를 제거합니다. 수화 된 샘플은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.건조 된 EV의 를 이미징 할 때, 탈이온 된 물로 기판을 세 번 헹구어 표면에서 소금을 제거합니다. 가능한 한 많은 액체를 흡입 한 후, 표면에 닿지 않고, 건조 질소의 스트림으로 나머지를 건조. 건조된 세포외 소포를 이미지화하려면 도청 및 비접촉 이미징 모드에서 공중에서 스캔하도록 설계된 캔틸레버를 선택하고 프로브 홀더에 장착합니다.샘플을 AFM 단계에 배치합니다. 자기 스테인레스 스틸 시편 디스크는 무대의 샘플을 고정합니다. 프로브 홀더를 AFM에 넣습니다.준비 와 스테이지가 열을 평형화할 시간을 허용합니다. 도청 모드를 사용하여 512 줄로 래스터된 5x5 미크론 영역을 하나의 hertz의 스캔 속도로 스캔합니다. 지형과 샘플의 표면 특성에 대한 무료 정보를 제공하면서 높이 및 위상 이미지를 모두 획득합니다.검색 시간은 이미지 영역과 이미지를 형성하기 위해 선택한 줄의 수로 증가하지만 스캔 속도에 따라 감소합니다. 빠른 스캔 속도가 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 래스터링 속도는 획득 시간과 이미지 품질 간의 균형을 유지해야 합니다. 수화 소포를 이미지화하려면 부드럽고 수화된 샘플을 스캔하는 데 적합한 캔틸레버를 선택하고 액체 스캔을 위해 설계된 프로브 홀더에 캔틸레버를 장착합니다.스캔 하는 동안 액체에 기포를 도입의 가능성을 줄이기 위해 PBS와 캔틸레버의 끝을 적시. 그런 다음 샘플을 AFM 단계로 고정합니다. 샘플이 열적으로 평형되면 도청 모드에서 수화 된 운하 표면을 이미지합니다.높이 와 위상 이미지를 모두 획득합니다. 촬영한 이미지를 분석하려면 먼저 데이터 프로세스의 SPM 모드 선택후 Tip'을 선택하고 모델 Tip'을 선택하여 샘플을 스캔하고 표면 재구성을 수행하여 팁 침식 아티팩트를 확인'을 클릭합니다. 이미지를 엽니다.메뉴에서 데이터 프로세스를 선택한 다음 Tip'다음에 SPM 모드를 선택한 다음 Surface 재구성을 선택하고 확인'Next를 클릭하고, 데이터 프로세스를 선택하고, 레벨'을 선택하고, 평면 레벨을 선택하여 이미징 평면을 정렬하고 스캔 데이터에서 기판의 기울기를 제거하여 실험실 XY 평면과 일치합니다. 데이터 프로세스를 선택한 다음 올바른 데이터'를 선택한 다음 각 검색 선의 평균 높이를 찾아 데이터에서 빼는 알고리즘인 중앙값을 포함하여 행 정렬 옵션을 정렬하는 것을 선택하여 이미지의 행을 정렬합니다. 다음으로 데이터 프로세스로 이동하여 흉터 제거를 선택합니다'이 Scars'로 알려진 일반적인 스캔 오류를 제거'제로 높이에서 운하 표면을 정렬하려면 데이터 프로세스 메뉴로 이동하여 레벨 드롭 다운 메뉴에서 플랫텐 베이스를 선택합니다.Grains'menu로 이동하여 임계값에 의해 표시를 사용하여 스캔 된 표면의 추가 셀룰러 소포를 식별'이 알고리즘은 사용자가 선택한 임계값 위의 높이에 의해 제로 표면 기판에서 튀어 나온 입자로 표면 고정 된 엑소좀을 식별합니다. 1~3나노미터 범위의 임계값을 선택합니다. 이렇게 하면 대부분의 백 그라운드 간섭이 제거됩니다.마지막으로 Grains 메뉴에서 액세스할 수 있는 사용 가능한 배포 알고리즘을 사용하여 식별된 소포의 기하학적 특성과 치수 특성을 수행합니다. 다른 계산 도구 및 사용자 지정 컴퓨터 프로그램에 의해 전문 분석을 위해 Gwyddion에서 AFM 데이터를 내보냅니다. 니켈 염화물 표면 수정은 시간에 따라 달라 지는 여분의 세포 소포의 고정을 초래합니다.고정 된 소포의 표면 농도는 24 시간 인큐베이션 후 지나치게 조밀한 반면 12 시간 잠복은 더 적은 엑소좀으로 이어지고 정확하게 분석하기 쉬운 데이터를 스캔합니다. 이 AFM 이미지는 수정된 운모 표면에 정전기적으로 고정된 수화 MCF7 엑소좀을 보여줍니다. 해당 AFM 상 이미지는 높이 영상의 입자가 멤브레인 소포에 대해 예상대로 부드러운 나노 입자임을 확인합니다.동일한 선을 따라 세 가지 소포에 대한 높이 데이터가 여기에 표시됩니다. 이러한 프로파일은 변형된 운하의 양전하 표면에 엑소좀의 정전기 매력으로 인한 평평한 형상을 보여 준다. 형상 왜곡은 고정된 소포와 그 단면의 확대보기에서 명백합니다.용액에서 엑소좀의 구형 크기를 추정하기 위해 표면 고정 및 구형 멤브레인 봉투에 의해 동봉된 볼륨과 일치할 수 있습니다. 용액에서 구형 소포의 크기 분포는 561개의 고정된 소포의 AFM 데이터로부터 결정되었다. CryoTEM 이미지의 소포 크기는 AFM 결과와 일치합니다.hyrdrated 엑소좀을 이미징하기 전에 PBS로 표면을 철저히 헹구는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 인바운드 엑소좀이 제거되고 AFM 팁에 대한 첨부 파일이 방지됩니다. 건조된 외민을 이미징할 때는 DI 물을 사용하여 기판을 상승시십시오.DI 세척은 기판이 건조함에 따라 표면에 소금 결정의 형성을 방지할 것입니다. 존재하는 경우, 소금 결정은 이미지 처리어려운 작업을 만들 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

연구

생화학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...