Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra National Science Foundation (pris nummer IGERT-0903715), University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant og graduate Research Fellowship Award), og Skolkovo Institute of Science og teknologi (Skoltech Fellowship).

1. isolering av EV-er fra en biofluid
<ol><li>Isoler EV-biler med en av de etablerte metodene, slik som differensial ultracentrifugation8, utfelling eller størrelses ekskludering kromatografi9.</li>
	<li>Bekreft tilstedeværelsen av forventet overflate og luminal biomarkører og fraværet av biomarkører indikerer krysskontaminering av preparatet. Bekreft lipid bilayer morfologi av de isolerte partikler av elektron mikroskopi. Merk: Når du isolerer e...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

Immobilisering av EV ' r fra en biologisk væske, overflateskanning, og bildeanalyse er de viktigste trinnene i den utviklede protokollen for AFM karakterisering av EV ' r i væske. Antall blemmer mottagelig for AFM Imaging skalaer med avbildet areal og overflate konsentrasjonen av blemmer immobilisert på underlaget. Med et negativt Zeta-potensiale for EV ' a og exosomes18, oppfordrer vi elektrostatisk fiksering av EV ' r fra væskeprøver til AFM-underlaget. Immobilisering er effektiv når overf...

Ekstracellulære blemmer (EV) er til stede i alle kroppsvæsker, inkludert blod, urin, spytt, melk og fostervann væsken. Exosomes danner en distrikts klasse av EV ' r differensiert fra andre EV ' r av endosomal kognitiv, markører for endosomal Tien, og den minste størrelsen blant alle EV ' r. Størrelsen på exosomes rapporteres ofte med betydelig variasjon mellom studiene. Størrelses resultatene ble funnet å være metode avhengig, noe som reflekterer forskjellen i fysiske prinsipper ansatt av ulike analytiske teknikker for å anslå EV størrelser1,2. Nanopartikkel sporings analyse (NTA), som er den mest brukte størrelses karakterisering teknikken, anslår for eksempel størrelsen på EV ' er som deres hydrodynamisk diameter, som karakteriserer motstanden mot Brownske mobilitet fra EV ' r i løsningen. En større hydrodynamisk diameter på en vesicle innebærer lavere mobilitet i væsken. Det koronale laget rundt blemmer, bestående av overflate proteiner og andre molekyler som er forankret eller adsorberes til membran overflaten, hemmer mobiliteten betydelig og øker hydrodynamisk størrelsen på EV ' r. I relative termer er denne økningen spesielt stor for exosomes3, som illustrert i figur 1.
Den kryogene overførings elektron mikroskopi ("karakteriserer") er en definitiv teknikk i de vesicle størrelsene og morfologi i sine hydrert tilstander. Men den høye kostnaden for instrumentering og den spesialiserte kompetansen som trengs for å bruke den på riktig måte motivere til å utforske alternative teknikker som kan bilde hydrert EV ' r. Et relativt lite antall EV ' r som er observert eller karakterisert ved de oppnådde fryse-TEM-bildene er en annen bemerkelsesverdig ulempe ved denne teknikken.
Atomic Force mikroskopi (AFM) visualiserer den tredimensjonale topografi av hydrert eller desiccated EV4,5,6 ved å skanne en sonde over underlaget til raster bildet av partiklene på overflaten. De grunnleggende trinnene i protokollen for å karakterisere EV ' er av AFM er skissert i denne studien. Før Imaging den blemmer i væske, må de være immobilisert på et substrat ved enten tethering til en funksjonalisert overflate, fangst i et filter, eller ved elektrostatisk tiltrekning7. Den elektrostatiske fiksering på et positivt ladet substrat er et spesielt praktisk alternativ for immobilisering av exosomes kjent for å ha et negativt Zeta-potensiale. Men den samme elektrostatiske krefter som nakkens ekstracellulære blemmer på overflaten også forvrenge sin form, noe som gjør post-Imaging dataanalyse avgjørende. Vi utdype dette punktet ved å beskrive algoritmen som anslår størrelsen på globular blemmer i løsningen basert på AFM data på forvrengt form av exosomes immobilisert på overflaten.
I den utviklede protokollen, er fremgangsmåten for den robuste elektrostatiske immobilisering av blemmer presentert og etterfulgt av trinnene som trengs for å utføre Atomic Force Imaging i hydrert eller desiccated tilstander. Faktorene som påvirker overflate konsentrasjonen av immobilisert blemmer er identifisert. Veiledningen er gitt om hvordan man utfører de elektrostatiske immobilisering for prøver med forskjellige konsentrasjoner av EV ' r i løsningen. Utvalget av eksperimentelle forhold som tillater estimering av empirisk sannsynlighet distribusjoner av ulike Biofysiske egenskaper basert på et tilstrekkelig stort antall immobilisert blemmer diskuteres. Eksempler på post-Imaging analyse av AFM data er gitt. Nærmere bestemt er en algoritme beskrevet for fastsettelse av størrelsen på blemmer i løsningen basert på AFM karakterisering av immobilisert EV ' r. Representanten resultatene viser konsistensen av vesicle dimensjonering av AFM med resultatene av fryse-TEM Imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomes og andre ekstracellulære blemmer (EV) er molekylære komplekser bestående av en lipid membran vesicle, overflaten dekorasjon av membran proteiner og andre molekyler, og mangfoldig luminal innhold arvet fra en overordnet celle, som inkluderer RNAs, proteiner, og DNAs. Karakterisering av de hydrodynamisk størrelsene på EV ' r, som avhenger av størrelsen på vesicle og dens koronale lag dannet av overflate dekorasjoner, har blitt rutine. For exosomes, den minste av EV ' r, er den relative forskjellen mellom hydrodynamisk og blemmer størrelser betydelig. Karakterisering av blemmer størrelser av kryogene overføring elektron mikroskopi (fryse-TEM) Imaging, en gull standard teknikk, er fortsatt en utfordring på grunn av kostnadene for instrumentet, den kompetansen som kreves for å utføre prøven forberedelse, bildebehandling og dataanalyse, og et lite antall partikler ofte observert i bilder. En allment tilgjengelig og tilgjengelig alternativ er atomkraft mikroskopi (AFM), som kan produsere allsidige data på tredimensjonale geometri, størrelse og andre Biofysiske egenskaper av ekstracellulære blemmer. Den utviklede protokollen veileder brukerne i å benytte dette analytiske verktøyet og skisserer arbeidsflyten for analyse av EV ' r av AFM, som inkluderer prøve forberedelsene for avbildning av EV ' r i hydrert eller desiccated form, den elektrostatiske immobilisering av blemmer på et substrat, datainnsamling, analyse og tolkning. Representative resultater viser at fiksering av EV ' r på den modifiserte glimmer flaten er forutsigbar, tilpassbar, og tillater brukeren å oppnå størrelses resultater for et stort antall blemmer. Den vesicle dimensjonering basert på AFM data ble funnet å være i samsvar med fryse-TEM Imaging.

Overflate fiksering av EV ' r er et kritisk trinn i bildesekvensen. Elektrostatisk overflate immobilisering av exosomes, kjent for å ha en negativ Zeta potensial, vil robust skje etter at glimmer ' s substrat er modifisert til å ha en positiv overflate ladning. Uten behandling med NiCl2 for å formidle positive overflate endringer, ble immobilisering av EV ' r på underlaget funnet å være ineffektiv. Høyde bildet i figur 10a, ervervet i luften etter MCF-7 exosome prøven inne...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

En trinnvis fremgangsmåte er beskrevet for etikett fri immobilisering av exosomes og ekstracellulære blemmer fra flytende prøver og deres tenkelig av Atomic Force mikroskopi (AFM). Den AFM bildene brukes til å anslå størrelsen på blemmer i løsningen og karakterisere andre Biofysiske egenskaper.

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Denne protokollen skisserer enkel forberedelse for AFM-avbildning av ekstracellulære vesikler i hydrerte og uttørkede former, deres elektrostatiske immobilisering, overflateskanning, vesisk identifikasjon og dataanalyse og tolkning. Den største fordelen med denne teknikken er praktisk elektrostatisk fiksering av vesikler på hudens overflate og postbildeanalysen for å ta hensyn til formforvrengning forårsaket av immobilisering. De oppnådde vesikler størrelsesresultatene er i samsvar med Gold Standard CryoTEM Imaging som fortsatt er kostbar og utfordrende teknikk.Hvis du er en ny AFM-bruker, begynner du med karakterisering av tørre prøver før du går videre til hydrerte prøver. Fordi det er mange andre faktorer som kan påvirke hydrert prøveoppkjøp. For å begynne, isolere ekstracellulære vesikler fra en bio-væske som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen.Deretter fester du en glimmerskive fast til en magnetisk prøveplate i rustfritt stål. Cleave glimmerskiven ved hjelp av en skarp barberhøvel for å avsløre et nytt lag med materiale. Ved romtemperatur, behandle den øverste overflaten av glimmer i ti sekunder med hundre mikro-liter av en ti millimolar nikkel II klorid løsning.Dette endrer overflatens ladning fra negativ til positiv. Blot nikkel II kloridoppløsningen med en lofri tørke eller blotting papir. Vask deretter glimmeroverflaten tre ganger med deionisert vann og tørk den med en strøm av tørt nitrogen.Plasser AFM-prøveskiven med den vedlagte overflaten modifisert glimmer i en petriskål. Deretter fortynner eksosomer med PBS for å oppnå en konsentrasjon mellom fire og førti milliarder partikler per milliliter oppløsning. Valider den fortynnede partikkelkonsentrasjonen ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse.Form en sessile dråpe på overflaten av glimmeren ved å tømme hundre mikroliter av den fortynnede eksosomet løsningen fra en pipette. Legg deretter lokket på petriskålen og forsegle det med parafenfilm for å redusere prøvefordampningen. Inkuber i kjøleskapet i tolv timer.Etter inkubasjon aspirerer du 80 til 90 prosent av prøven forsiktig uten å forstyrre overflaten. På dette punktet vil eksosomer bli elektrostatisk immobilisert på glimmerunderlaget. Når du avbilder hydrerte prøver, skyll overflaten tre ganger med PBS.Vær forsiktig med å holde prøven hydrert gjennom skylleprosessen. Etter å ha vasket glimmeroverflaten med PBS, fjern 80 til 90 prosent av væsken og pipette førti mikroliter av friske PBS for å dekke prøven. Den hydrerte prøven er klar for bildebehandling.Når du avbilder de uttørkede EV-ene, fjerner du saltene fra overflaten ved å skylle underlaget tre ganger med deionisert vann. Etter aspirering av så mye væske som mulig, uten å berøre overflaten, tørk resten med en strøm av tørt nitrogen. Hvis du vil se av de uttørkede ekstracellulære vesikler, velger du en cantilever som er utformet for skanning i luften i tappe- og ikke-kontaktavbildningsmoduser og monterer den på probeholderen.Plasser prøven på AFM-fasen. Den magnetiske prøveskiven i rustfritt stål immobiliserer prøven på scenen. Plasser probeholderen i AFM.Gi tid til preparatet og scenen for å likevekte termisk. Bruk tappemodus til å skanne et område som er 5x5 mikron rast i 512 linjer med en skannehastighet på én hertz. Få både høyde- og fasebilder som de gir gratis informasjon om topografien og overflateegenskapene til prøven.Skannetiden vil øke med et bildet område og antall linjer som er valgt for å danne bildet, men reduseres med skannehastigheten. Siden raske skannehastigheter kan påvirke bildekvaliteten, bør hastigheten på rastering være en balanse mellom oppkjøpstid og bildekvalitet. Hvis du vil bilde hydrert vesikler, velger du en cantilever som passer for skanning av myke, hydrerte prøver og monterer kantileveren på en probeholder som er utformet for skanning i væsker.Våt spissen av cantilever med PBS for å redusere sannsynligheten for å introdusere luftbobler til væsken under skanning. Deretter immobilisere prøven på AFM-scenen. Når prøven er termisk likevekter, kan du se den hydrerte glimmeroverflaten i tappemodus.Få både høyde- og fasebilder. For å analysere bildene som er tatt, gå først til Data Processs utvalgte SPM-moduser, etterfulgt av Tips", og velg Modelltips'Velg geometrien og dimensjonene på spissen som brukes til å skanne prøven, og klikk OK'Korriger tupperosjonsartefaktene ved å utføre overflaterekonstruksjonen. Åpne bildet.Fra menyen velger du Dataprosess, og deretter velger du SPM Modes'etterfulgt av Tip', velg Surface Reconstruction'og klikker OK'Neste, velger Dataprosess, etterfulgt av Nivå'og velger Plannivå'for å justere bildeplanet og for å matche laboratoriet XY-planet ved å fjerne vippet i underlaget fra skannedataene. Juster rader i bildet ved å velge Dataprosess'etterfulgt av Korrekte data', og velg deretter Juster rader'Flere justeringsalternativer er tilgjengelige, inkludert median som er en algoritme som finner en gjennomsnittlig høyde på hver skannelinje og trekker den fra dataene. Deretter går du til Data Process'etterfulgt av Correct Data'og velger Fjern arr'Dette vil fjerne vanlige skannefeil kjent som Arr'For å justere glimmeroverflaten i nullhøyden, gå til Dataprosess-menyen og velg Flat base'i nivå'-rullegardinmenyen.Identifiser de ekstra cellulære vesikler på den skannede overflaten ved å gå til Korn'-menyen og bruke by Threshold'Denne algoritmen identifiserer overflateimmobiliserte eksosomer som partikler som stikker ut fra nulloverflateunderlaget med høyden over den valgte brukerens terskel. Velg en terskel i området mellom ett og tre nanometer. Dette vil eliminere det meste av bakbakken interferens.Til slutt utfører du geometrisk og dimensjonal karakterisering av de identifiserte vesikler ved hjelp av de tilgjengelige distribusjonsalgoritmene som er tilgjengelige fra Korn-menyen. Eksporter AFM-dataene fra Gwyddion for spesialisert analyse av andre beregningsverktøy og tilpassede dataprogrammer. Nikkelkloridoverflaten modifikasjon resulterer i en immobilisering av ekstra cellulære vesikler som er tidsavhengige.Overflatekonsentrasjonen av immobiliserte vesikler er for tett etter 24 timers inkubasjon, mens 12 timers inkubasjon fører til færre eksosomer og skannedata som er lettere å analysere nøyaktig. Dette AFM-bildet viser hydrerte MCF7-eksosomer elektrostatisk immobilisert på den modifiserte glimmeroverflaten. Det tilsvarende AFM-fasebildet bekrefter at kornene i høydebildet er myke nanopartikler som det forventes for membran vesikler.Høydedataene for tre vesikler langs samme linje vises her. Disse profilene illustrerer en flat form forårsaket av eksosomers elektrostatiske tiltrekning til den positivt ladede overflaten av den modifiserte glimmeren. Formen forvrengning er tydelig i en forstørret visning av immobilisert vesikkel og dens tverrsnitt.For å estimere den kuleformede størrelsen på eksosomer i løsningen, kan på matche volumene omsluttet av overflateimmobiliserte og sfæriske membrankonvoluutter. Størrelsesfordelingen av kuleformede vesikler i løsningen ble bestemt fra AFM-dataene til 561 immobiliserte vesikler. Vesikkelstørrelsene i CryoTEM-bildene er i samsvar med AFM-resultatene.Før du avbilder de hyrderte eksosomer, er det viktig å huske å skylle overflaten grundig med PBS. Dette vil fjerne innkommende eksosomer og forhindre at de festes til AFM-spissen. Når du avbilder de uttørkede eksosomer, sørg for å bruke DI vann for å stige underlaget.DI-vasken vil forhindre dannelse av saltkrystaller på overflaten når substratet tørker. Hvis det finnes, vil saltkrystaller gjøre bildebehandling til en vanskelig oppgave.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering av tissue ekstracellulære blemmer fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum Imaging av correlative Light og Volume Electron mikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisering av flowcytometriske sorteringsparametere for høykapasitetsisolering og rensing av små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...