Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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Os autores reconhecem o apoio financeiro da National Science Foundation (número de prêmio IGERT-0903715), da Universidade de Utah (departamento de engenharia química Seed Grant e do prêmio de bolsa de estudos de pós-graduação), e Skolkovo Institute of Science e tecnologia (Skoltech Fellowship).

1. isolamento de EVs de um biofluide
<ol><li>Isole EVs por um dos métodos estabelecidos, tais como a ultracentlee diferencial8, a precipitação, ou a cromatografia do tamanho-exclusão9.</li>
	<li>Confirme a presença de biomarcadores de superfície e luminal esperados e a ausência de biomarcadores que indiquem a contaminação cruzada da preparação. Confirme a morfologia do BICAMADA do lipido das partículas isoladas pela microscopia de elétron.<br...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

A imobilização de EVs de um líquido biológico, de uma exploração de superfície, e de uma análise da imagem é as etapas essenciais do protocolo desenvolvido para a caracterização de AFM dos EVs no líquido. O número de vesículas em escalas de imagem AFM com a área de superfície imaged e a concentração superficial das vesículas imobilizadas no substrato. Dado um potencial zeta negativo de EVS e de exossomos18, nós advogamos a fixação eletrostática dos EVS das amostras líquidas...

Vesículas extracelulares (EVs) estão presentes em todos os fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite e o líquido amniótico. Os exosomas formam uma classe distrital de EVs diferenciada de outros EVs por biogênese endossômica, os marcadores da via endossômica e o menor tamanho entre todos os EVs. O tamanho dos exosomas é relatado frequentemente com variabilidade substancial entre estudos. Os resultados de dimensionamento foram encontrados como dependentes do método, refletindo a diferença nos princípios físicos empregados por diferentes técnicas analíticas para estimar ostamanhos de EV1,2. Por exemplo, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ― a técnica de caracterização de tamanho mais amplamente utilizada ― estima o tamanho dos EVs como seus diâmetros hidrodinâmicos, que caracterizam a resistência à mobilidade browniana de EVs na solução. Um diâmetro hidrodinâmico maior de uma vesícula implica sua menor mobilidade em líquido. A camada coronal em torno das vesículas, consistindo de proteínas superficiais e outras moléculas ancoradas ou adsortas à superfície da membrana, impede substancialmente a mobilidade e aumenta o tamanho hidrodinâmico dos EVs. Em termos relativos, esse aumento é particularmente grande para os exosomas3, como ilustrado na Figura 1.
A imagem latente da microscopia de elétron de transmissão criogênica (Cryo-tem) é uma técnica definitiva em caracterizar tamanhos e morfologia do vesícula em seus Estados hidratados. No entanto, o alto custo da instrumentação e a expertise especializada necessária para utilizá-lo motivam corretamente a exploração de técnicas alternativas que podem ser imagens hidratadas. Um número relativamente pequeno de EVs observado ou caracterizado nas imagens adquiridas de Cryo-TEM é uma outra desvantagem notável desta técnica.
A microscopia da força atômica (AFM) visualiza a topografia tridimensional de EVS hidratados ou Desiccated4,5,6escaneando uma ponta deprova através da carcaça para rasterear a imagem das partículas na superfície. Os passos essenciais do protocolo para caracterizar os EVs por AFM estão descritos neste estudo. Antes de imagem as vesículas em líquido, eles devem ser imobilizados em um substrato, quer amarrar a uma superfície funcionalizada, aprisionamento em um filtro, ou por atração eletrostática7. A fixação eletrostática em um substrato positivamente carregado é uma opção particularmente conveniente para a imobilização de exosomas conhecidas por ter um potencial zeta negativo. No entanto, as mesmas forças eletrostáticas que imobilizam as vesículas extracelulares na superfície também distorcem sua forma, o que torna essencial a análise de dados pós-imagem. Elaboramos este ponto descrevendo o algoritmo que estima o tamanho das vesículas globulares na solução com base nos dados da AFM sobre a forma distorcida dos exosomas imobilizados na superfície.
No protocolo desenvolvido, o procedimento para a imobilização eletrostática robusta de vesículas é apresentado e seguido pelas etapas necessárias para a realização de imagens de força atômica nos Estados hidratados ou desictados. Os fatores que influenciam a concentração superficial das vesículas imobilizadas são identificados. A orientação é dada sobre como realizar a imobilização eletrostática para amostras com diferentes concentrações de EVs na solução. Discute-se a seleção de condições experimentais que permitam estimar as distribuições de probabilidades empíricas de diferentes propriedades biofísicas com base em um número suficientemente grande de vesículas imobilizadas. Exemplos de análise pós-imagem dos dados do AFM são fornecidos. Especificamente, um algoritmo é descrito para determinar o tamanho das vesículas na solução com base na caracterização AFM de EVs imobilizados. Os resultados representativos mostram a consistência do dimensionamento de vesículas por AFM com os resultados da imagem latente de Cryo-TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Os exosomas e outras vesículas extracelulares (EVs) são complexos moleculares constituídos por uma vesícula de membrana lipídica, sua decoração superficial por proteínas de membrana e outras moléculas, e conteúdo Luminal diverso herdado de uma célula-mãe, que inclui RNAs, proteínas e DNAs. A caracterização dos tamanhos hidrodinâmicos de EVs, que depende do tamanho da vesícula e da sua camada coronal formada por decorações superficiais, tornou-se rotineira. Para os exosomas, o menor dos EVs, a diferença relativa entre os tamanhos hidrodinâmico e vesículas é significativa. A caracterização de tamanhos de vesículas pela imagem de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM), uma técnica de padrão-ouro, continua sendo um desafio devido ao custo do instrumento, a expertise necessária para realizar a preparação da amostra, a imagem e análise de dados, e um pequeno número de partículas muitas vezes observadas em imagens. Uma alternativa amplamente disponível e acessível é a microscopia de força atômica (AFM), que pode produzir dados versáteis sobre geometria tridimensional, tamanho e outras propriedades biofísicas de vesículas extracelulares. O protocolo desenvolvido orienta os usuários na utilização desta ferramenta analítica e delineia o fluxo de trabalho para a análise de EVs pelo AFM, que inclui a preparação da amostra para exames de imagem em forma hidratada ou desictada, a imobilização eletrostática de vesículas em um substrato, aquisição de dados, sua análise e interpretação. Os resultados representativos demonstram que a fixação de EVs na superfície modificada da mica é previsível, customizável, e permite que o usuário obtenha resultados da cola para um grande número vesículas. O dimensionamento de vesículas com base nos dados de AFM foi encontrado para ser consistente com a imagem latente de Cryo-TEM.

A fixação de superfície de EVs é uma etapa crítica na seqüência da imagem latente. A imobilização de superfície eletrostática de exosomas, conhecida por ter um potencial zeta negativo, ocorrerá de forma robusta após a modificação do substrato da mica para ter uma carga superficial positiva. Sem o tratamento com NiCl2 para transmitir mudanças de superfície positivas, a imobilização de EVS no substrato foi encontrada para ser ineficaz. A imagem de altura na Figura 10A</str...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.

Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Este protocolo descreve a preparação simples para imagens AFM de vesículas extracelulares em formas hidratadas e dessecadas, sua imobilização eletrostática, varredura superficial, identificação vesical e análise e interpretação de dados. A principal vantagem desta técnica é a conveniente fixação eletrostática de vesículas na superfície da pele e a análise pós-imagem para explicar a distorção de forma causada pela imobilização. Os resultados de dimensionamento de vesículas obtidos são consistentes com a Imagem CrioTEM Padrão Ouro que permanece cara e técnica desafiadora.Se você é um novo usuário de AFM, comece com a caracterização de amostras secas antes de proceder a amostras hidratadas. Porque existem inúmeros fatores adicionais que podem impactar a aquisição de amostras hidratadas. Para começar, isole vesículas extracelulares de um bioe fluido, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.Em seguida, conecte firmemente um disco mica a um disco de espécime de aço inoxidável magnético. Aperte o disco mica usando uma navalha afiada para expor uma nova camada de material. À temperatura ambiente, trate a superfície superior de mica por dez segundos com cem micro litros de uma solução de cloreto de níquel II de dez milimolar.Isso modifica a carga da superfície de negativa para positiva. Borrihe a solução de cloreto de níquel II com um lenço livre de fiapos ou papel de mancha. Em seguida, lave a superfície mica três vezes com água deionizada e seque-a com um fluxo de nitrogênio seco.Coloque o disco da amostra AFM com a mica modificada da superfície anexa em uma placa de petri. Em seguida, diluir os exossomos com PBS para obter uma concentração entre quatro e quarenta bilhões de partículas por mililitro de solução. Validar a concentração de partículas diluídas usando análise de rastreamento de partículas nano.Forme uma gota de sessile na superfície do mica esvaziando cem microlitadores da solução exososome diluída de uma pipeta. Em seguida, coloque a tampa sobre a placa de petri e sele-a com filme parafen para reduzir a evaporação da amostra. Incubar na geladeira por doze horas.Após a incubação, aspire de 80 a 90% da amostra cuidadosamente sem perturbar a superfície. Neste ponto, os exossomos serão eletroestáticamente imobilizados no substrato mica. Ao fotografar amostras hidratadas, enxágue a superfície três vezes com PBS.Tome cuidado para manter a amostra hidratada durante todo o processo de lavagem. Depois de lavar a superfície mica com PBS, remova 80 a 90% do líquido e pipeta quarenta microliters de PBS fresco para cobrir a amostra. A amostra hidratada está pronta para a imagem.Ao fotografar os EV dessecados, remova os sais da superfície enxaguando o substrato três vezes com água desionizada. Depois de aspirar o máximo de líquido possível, sem tocar na superfície, seque o resto com um fluxo de nitrogênio seco. Para fotografar as vesículas extracelulares dessecadas, selecione uma cantilever projetada para digitalização no ar em modos de gravação e imagem sem contato e monte-a no suporte da sonda.Coloque a amostra no estágio AFM. O disco de amostra de aço inoxidável magnético imobilizará a amostra no palco. Coloque o suporte da sonda no AFM.Dê tempo para a preparação e o estágio equilibrarem-se termicamente. Use o modo de toque para digitalizar uma área que é 5x5 mícrons rastered em 512 linhas a uma taxa de varredura de um hertz. Adquira as imagens de altura e fase, pois fornecem informações complementares sobre a topografia e as propriedades superficiais da amostra.O tempo de varredura aumentará com uma área de imagem e o número de linhas selecionadas para formar a imagem, mas diminuirá com a taxa de digitalização. Uma vez que as taxas de varredura rápida podem afetar a qualidade da imagem, a velocidade de rastering deve ser um equilíbrio entre o tempo de aquisição e a qualidade da imagem. Para imaginar vesículas hidratadas, selecione um cantilever apropriado para digitalizar amostras macias e hidratadas e monte o cantilever em um suporte de sonda projetado para digitalização em líquidos.Molhe a ponta do cantilever com PBS para reduzir a probabilidade de introduzir bolhas de ar no líquido durante a varredura. Em seguida, imobilize a amostra no estágio AFM. Uma vez que a amostra equilibre termicamente, imagem a superfície mica hidratada no modo de toque.Adquira as imagens de altura e fase. Para analisar as imagens tiradas, primeiro vá para os modos SPM selecionados do Processo de Dados, seguido de Tip'e escolha Model Tip'Selecione a geometria e as dimensões da ponta usada para digitalizar a amostra e clique em OK'Corrija os artefatos de erosão da ponta realizando a reconstrução da superfície. Abra a imagem.No menu, selecione O Processo de Dados', então selecione os modos SPM'seguidos por Tip', então escolha a Reconstrução de Superfície'e clique em OK'Next, selecione Processo de Dados, seguido por Level'e escolha O Nível de Plano', para alinhar o plano de imagem e combinar com o plano XY do laboratório, removendo a inclinação no substrato dos dados da varredura. Alinhar linhas na imagem selecionando o Processo de Dados'seguido por Dados Corretos'' e, em seguida, escolha Alinhar linhas'Várias opções de alinhamento estão disponíveis, incluindo mediana, que é um algoritmo que encontra uma altura média de cada linha de varredura e subtrai-as dos dados. Em seguida, vá para o Processo de Dados'seguido por Dados Corretos' e escolha Remover cicatrizes'Isso removerá erros de varredura comuns conhecidos como Cicatrizes'Para alinhar a superfície mica na altura zero, vá para o menu do Processo de Dados e selecione Base achatada no menu de queda do nível'.Identifique as vesículas celulares extras na superfície digitalizada indo ao menu do Grains e usando Mark by Threshold'Este algoritmo identifica exossomos imobilizados da superfície como partículas salientes do substrato de superfície zero pela altura acima do limiar selecionado pelo usuário. Selecione um limiar na faixa entre um e três nanômetros. Isso eliminará a maior parte da interferência do solo traseiro.Por fim, realize a caracterização geométrica e dimensional das vesículas identificadas utilizando os algoritmos de distribuição disponíveis acessíveis a partir do cardápio dos Grãos. Exporte os dados AFM da Gwyddion para análise especializada por outras ferramentas computacionais e programas de computador personalizados. A modificação da superfície do cloreto de níquel resulta em uma imobilização de vesículas celulares extras que dependem do tempo.A concentração superficial das vesículas imobilizadas é excessivamente densa após 24 horas de incubação, enquanto a incubação de 12 horas leva a menos exosóis e dados de varredura que são mais fáceis de analisar com precisão. Esta imagem AFM mostra exosóis MCF7 hidratados eletroessticamente imobilizados na superfície mica modificada. A imagem de fase AFM correspondente confirma que os grãos na imagem de altura são nanopartículas macias, como deveria ser esperado para vesículas de membrana.Os dados de altura de três vesículas ao longo da mesma linha são mostrados aqui. Esses perfis ilustram uma forma achatada causada pela atração eletrostática dos exosóis à superfície de carga positiva do mica modificado. A distorção da forma é aparente em uma visão ampliada da vesícula imobilizada e sua seção transversal.Para estimar o tamanho globular dos exossomos na solução, pode coincidir com os volumes incluídos por envelopes de membrana imobilizada e esférica. A distribuição de tamanho das vesículas globulares na solução foi determinada a partir dos dados AFM de 561 vesículas imobilizadas. Os tamanhos de vesículas nas imagens CryoTEM são consistentes com os resultados da AFM.Antes de imaginar os exossomos hierárquios, é importante lembrar de enxaguar completamente a superfície com PBS. Isso removerá os exossomos de entrada e impedirá o apego à ponta AFM. Ao fotografar os exossomos dessecados, certifique-se de usar água DI para subir o substrato.A lavagem DI impedirá a formação de cristais de sal na superfície à medida que o substrato seca. Se presente, os cristais de sal tornarão o processamento da imagem uma tarefa difícil.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Bioquímica

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...