Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда (номер премии IGERT-0903715), Университета штата и технологии (стипендий Сколтеха).

1. Изоляция ЭВ от биожидкости
<ol><li>Изолировать EVs одним из установленных методов, таких как дифференциальная ультрацентрифугация8, осадки, или размер исключения хроматографии9.</li>
	<li>Подтвердите наличие ожидаемых поверхностных и светящихся биомаркер...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

Иммобилизация ЭВ из биологической жидкости, сканирование поверхности и анализ изображений являются основными шагами разработанного протокола для характеристики AFM ВВ в жидкости. Количество пузырьков поддается весы изображения AFM с изображением области поверхности и концентрации по?...

Внеклеточные пузырьки (Эпикулы) присутствуют во всех жидкостях организма, включая кровь, мочу, слюну, молоко и амниотическую жидкость. Экзосомы образуют районный класс EVs, отличаемый от других ЭВ эндосомальным биогенезом, маркерами эндосомного пути и наименьшим размером среди всех ЭВ. Размер экзосом часто сообщается с существенной изменчивостью между исследованиями. Результаты размеров были признаны зависимыми от метода, что отражает разницу в физических принципах, используемых различными аналитическими методами для оценки размеров EV1,2. Например, анализ отслеживания наночастиц (NTA) - наиболее широко используемый метод характеристики размеров - оценивает размер Овв как их гидродинамические диаметры, которые характеризуют устойчивость к броуновской мобильности ЭВ в растворе. Больший гидродинамический диаметр везикулы подразумевает его низкую подвижность в жидкости. Корональный слой вокруг пузырьков, состоящий из поверхностных белков и других молекул, прикрепленных или адсорбированных на поверхность мембраны, существенно препятствует подвижности и увеличивает гидродинамический размер ЭВ. В относительном выражении это увеличение особенно велико для экзосом3,как показано на рисунке 1.
Криогенная электронная микроскопия передачи (крио-TEM) изображение является окончательным методом в характеристике везикул размеров и морфологии в их гидратированных состояний. Тем не менее, высокая стоимость приборов и специализированные знания, необходимые для его правильного использования мотивировать изучение альтернативных методов, которые могут изображения гидратированных EVs. Еще одним заметным недостатком этой техники является относительно небольшое количество ЭВ, наблюдаемых или охарактеризованных в приобретенных крио-TEM-изображениях.
Атомная микроскопия силы (AFM) визуализирует трехмерную топографию гидратированных или высохших ЭВ4,5,6 путем сканирования зонда по субстрату, чтобы провести изображение частиц на поверхности. Основные шаги протокола для характеристики EVs aFM изложены в этом исследовании. Перед визуализацией пузырьков в жидкости, они должны быть обездвижены на субстрате либо привязывая к функционализированной поверхности, захватвая в фильтр, или электростатического притяжения7. Электростатическая фиксация на положительно заряженном субстрате является особенно удобным вариантом для иммобилизации экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты. Однако те же электростатические силы, которые обездвиживают внеклеточные пузырьки на поверхности, также искажают их форму, что делает анализ данных после визуализации необходимым. Мы разрабатываем этот момент, описывая алгоритм, который оценивает размер шаровых пузырьков в решении на основе данных AFM о искаженной форме экзосомы, обездвиженных на поверхности.
В разработанном протоколе представлена процедура надежной электростатической иммобилизации пузырьков, за которой следуют шаги, необходимые для выполнения изображений атомной силы в гидратированных или высохлых состояниях. Выявлены факторы, влияющие на концентрацию обездвиженные пузырьки. Дано руководство о том, как выполнить электростатическую иммобилизацию образцов с различной концентрацией ЭВ в растворе. Обсуждается выбор экспериментальных условий, позволяющих оценить эмпирические вероятности распределения различных биофизических свойств на основе достаточно большого количества обездвиженных пузырьков. Приведены примеры пост-изображения данных AFM. В частности, описан алгоритм определения размера пузырьков в решении на основе характеристики AFM обездвиженых ЭВ. Репрезентативные результаты показывают последовательность размеров везикула aFM с результатами крио-TEM-изображения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Экзосомы и другие внеклеточные пузырьки (EVs) представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из липидной мембраны везикулы, ее поверхностного украшения мембранными белками и другими молекулами, а также разнообразное содержание светила, унаследованного от родительской клетки, которая включает РНК, белков и ДНЯ. Характеристика гидродинамических размеров ЭВ, которая зависит от размера везикулы и его коронарного слоя, образованного поверхностными украшениями, стала рутинной. Для экзосомы, самой маленькой из ЭВ, относительная разница между размерами гидродинамических и пузырьков значительна. Характеристика размеров пузырьков криогенной передачей электронной микроскопии (крио-TEM) изображения, золотой стандарт техники, остается проблемой из-за стоимости инструмента, опыт, необходимый для выполнения подготовки образца, изображений и анализа данных, и небольшое количество частиц часто наблюдается в изображениях. Широко доступной и доступной альтернативой является атомная микроскопия силы (AFM), которая может производить универсальные данные о трехмерной геометрии, размерах и других биофизических свойствах внеклеточных пузырьков. Разработанный протокол направляет пользователей в использовании этого аналитического инструмента и излагает рабочий процесс для анализа EVs AFM, который включает в себя подготовку образца для визуализации EVs в гидратированной или высохлой форме, электростатическая иммобилизация пузырьки на субстрате, сбор данных, его анализ и интерпретация. Репрезентативные результаты показывают, что фиксация ЭВ на модифицированной поверхности слюды предсказуема, настраивается и позволяет пользователю получить результаты размеров для большого количества пузырьков. Было установлено, что размер везикула, основанный на данных AFM, согласуется с крио-TEM-изображением.

Поверхностная фиксация ЭВ является критическим шагом в последовательности изображений. Электростатическая иммобилизация экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты, будет надежно происходить после того, как субстрат слюды будет модифицирован, чтобы имет?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Пошаговая процедура описывается для безэтикетки иммобилизации экзосом и внеклеточных пузырьков из жидких образцов и их визуализации с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Изображения AFM используются для оценки размера пузырьков в растворе и характеризуют другие биофизические свойства.

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

В этом протоколе излагается простая подготовка к изображению AFM внеклеточных пузырьков в гидратированных и высушенных формах, их электростатическая иммобилизация, сканирование поверхности, везическая идентификация, анализ и интерпретация данных. Основным преимуществом этой техники является удобная электростатическая фиксация пузырьков на поверхности кожи и анализ поствизионных изображений с учетом искажения формы, вызванного иммобилизацией. Полученные результаты размеров пузырьков соответствуют Gold Standard CryoTEM Imaging, которая остается дорогостоящей и сложной техникой.Если вы новый пользователь AFM, начните с характеристики сухих образцов, прежде чем переступить к гидратированных образцов. Потому что существует множество дополнительных факторов, которые могут повлиять на приобретение гидратированных образцов. Для начала изолируйте внеклеточные пузырьки из биожидких, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.Затем прочно прикрепите диск слюды к магнитному диску образца из нержавеющей стали. Расщепляйте диск слюды с помощью острой бритвы, чтобы разоблачить новый слой материала. При комнатной температуре обработать верхнюю поверхность слюды в течение десяти секунд сотней микролитров десятимилояленного раствора хлорида никеля II.Это изменяет заряд поверхности от отрицательного к положительному. Пятно никеля II хлорид раствор с ворсиной свободной салфетки или blotting бумаги. Затем трижды промыть поверхность слюды деионизированной водой и высушить ее потоком сухого азота.Поместите диск образца AFM с прикрепленной поверхностью измененной слюды в чашку Петри. Затем разбавляют экзосомы PBS, чтобы получить концентрацию от четырех до сорока миллиардов частиц на миллилитр раствора. Проверить концентрацию разбавленных частиц с помощью анализа отслеживания наночастиц.Сформирует sessile падение на поверхности слюды путем опорожнения сто микролитров разбавленного раствора экзосомы из пипетки. Затем поместите крышку на чашку Петри и запечатать его парафеновой пленкой, чтобы уменьшить испарение образца. Инкубировать в холодильнике в течение двенадцати часов.После инкубации, аспирировать от 80 до 90 процентов образца тщательно, не нарушая поверхности. В этот момент экзосомы будут электростатически обездвижены на субстрате слюды. При визуализации гидратированных образцов, промыть поверхность три раза с PBS.Позаботьтесь, чтобы сохранить образец гидратированных на протяжении всего процесса полоскания. После мытья поверхности слюды с PBS, удалить от 80 до 90 процентов жидкости и пипетки сорок микролитров свежего PBS для покрытия образца. Гидратированный образец готов к визуализации.При визуализации высушенных EV's, удалить соли с поверхности путем полоскания субстрата в три раза с деионизированной водой. После аспирации как можно больше жидкости, не касаясь поверхности, высушите остальное потоком сухого азота. Для изображения высушенных внеклеточных пузырьков выберите кантилевер, предназначенный для сканирования в воздухе в режимах касания и бесконтактной визуализации, и смонтировать его на держатель зонда.Поместите образец на сцену AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит образец на сцене. Поместите держатель зонда в AFM.Дайте время для подготовки и стадии, чтобы уравночные термически. Используйте режим касания для сканирования области, которая составляет 5x5 микрон rastered в 512 линий со скоростью сканирования одного герца. Приобретайте изображения высоты и фазы, поскольку они предоставляют бесплатную информацию о топографии и свойствах поверхности образца.Время сканирования будет увеличиваться с изображением области и количество линий, выбранных для формирования изображения, но уменьшается с скоростью сканирования. Поскольку скорость быстрого сканирования может повлиять на качество изображения, скорость rastering должна быть баланс между временем приобретения и качеством изображения. Для изображения гидратированных пузырьков выберите кантилевер, подходящий для сканирования мягких, увлажненых образцов, и смонтировать кантилевер на держатель зонда, предназначенный для сканирования жидкостей.Влажный кончик кантилевера с PBS, чтобы уменьшить вероятность введения пузырьков воздуха в жидкость во время сканирования. Затем обездвижить образец на сцене AFM. После того, как образец термически equilibrates, изображение гидратированных поверхности слюды в режиме постукивания.Приобретайте изображения высоты и фазы. Чтобы проанализировать полученные изображения, сначала перейдите в выбранные режимы SPM процесса данных, затем Tip'and выберите Модель Tip'Select геометрии и размеры наконечника, используемого для сканирования образца и нажмите OK'Correct наконечник эрозии артефактов, выполняя реконструкцию поверхности. Откройте изображение.Из меню выберите Data Process'then select SPM Modes'followed by Tip'then выберите Surface Reconstruction'and нажмите OK'Next, выберите процесс передачи данных, а затем Level'and выберите Plane Level'to выровнять плоскость изображения и соответствовать плоскости лаборатории XY, удалив наклон в субстрате из данных сканирования. Выровнять строки в изображении, выбрав Data Process'followed by Correct Data', а затем выбрать варианты выравнивания рядов, включая медиану, которая является алгоритмом, который находит среднюю высоту каждой линии сканирования и вычитает ее из данных. Далее перейдите на Data Process'followed by Correct Data'and выберите Удалить Scars'This устранит распространенные ошибки сканирования, известные как Scars'To выровнять поверхность слюды на нулевой высоте, перейдите в меню процесса данных и выберите Flatten Base'in The Level'drop down menu.Определите дополнительные клеточные пузырьки на отсканированной поверхности, заехав в Grains'menu и используя Mark by Threshold'This алгоритм определяет поверхностные обездвиженное экзосомы как частицы, выступающие из нулевого поверхностного субстрата по высоте выше выбранного пользователем порога. Выберите порог в диапазоне от одного до трех нанометров. Это позволит устранить большую часть задней земли помех.Наконец, выполните геометрическую и мерную характеристику идентифицированных пузырьков с помощью доступных алгоритмов распределения, доступных из меню Зерна. Экспорт данных AFM из Gwyddion для специализированного анализа другими вычислительными инструментами и пользовательскими компьютерными программами. Модификация поверхности хлорида никеля приводит к иммобилизации дополнительных клеточных пузырьков, зависящих от времени.Поверхностная концентрация обездвиженых пузырьков чрезмерно плотна после 24 часов инкубации, в то время как 12-часовая инкубация приводит к уменьшению количества экзосом и сканированию данных, которые легче анализировать точно. На этом изображении AFM показаны гидратированные экзосомы MCF7, электростатически обездвижено на поверхности модифицированной слюды. Соответствующее фазовое изображение AFM подтверждает, что зерна на изображении высоты являются мягкими наночастицами, как и следовало ожидать для мембранных пузырьков.Данные о высоте трех пузырьков вдоль одной линии показаны здесь. Эти профили иллюстрируют сплющенную форму, вызванную электростатическим притяжением экзосом к положительной поверхности заряда модифицированной слюды. Искажение формы проявляется в увеличенном представлении обездвиженой везикулы и ее поперечного сечения.Для оценки шаровых размеров экзосом в растворе, на может соответствовать объемам, заключенным поверхностной обездвиженой и сферической мембраны конвертов. Распределение размеров шаровых пузырьков в растворе было определено на основе данных AFM 561 иммобилизованных пузырьков. Размеры пузырьков на изображениях CryoTEM соответствуют результатам AFM.Перед визуализацией hyrdrated экзосомы, важно помнить, чтобы тщательно промыть поверхность с PBS. Это позволит удалить входящие экзосомы и предотвратить их присоединение к наконечнику AFM. При визуализации высушенных экзосом, не забудьте использовать воду DI для подъема субстрата.Мытье DI предотвратит образование кристаллов соли на поверхности по мере того как substrate высыхает. Если таковые имеются, кристаллы соли сделают обработку изображений трудной задачей.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Изоляция тканей внеклеточных пузырьков от печени

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Митохондрии и эндоплазмические ретикулами imaging коррелятийным светом и объемной электронной микроскопией

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...