Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
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Los autores reconocen el apoyo financiero de la National Science Foundation (número de premio IGERT-0903715), la Universidad de Utah (Departamento de Ingeniería Química Y el Premio de Becas de Investigación de Posgrado), y el Instituto de Ciencias de Skolkovo tecnología (Beca Skoltech).

1. Aislamiento de los vehículos eléctricos de un biofluido
<ol><li>Aísle los vehículos eléctricos mediante uno de los métodos establecidos, como la ultracentrifugación diferencial8, la precipitación o la cromatografía de exclusión de tamaño9.</li>
	<li>Confirmar la presencia de biomarcadores superficiales y luminales esperados y la ausencia de biomarcadores que indiquen la contaminación cruzada del preparado. Confirmar la morfología bicapa li...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

La inmovilización de los vehículos eléctricos de un fluido biológico, el escaneo de superficies y el análisis de imágenes son los pasos esenciales del protocolo desarrollado para la caracterización AFM de los vehículos eléctricos en líquido. El número de vesículas susceptibles a las escalas de imágenes AFM con el área de superficie de la imagen y la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas en el sustrato. Dado un potencial zeta negativo de vehículos eléctricos y exosomas<sup class="xref"...

Las vesículas extracelulares (EV) están presentes en todos los fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche y el líquido amniótico. Los exosomas forman una clase de distrito de vehículos eléctricos diferenciados de otros vehículos eléctricos por biogénesis endosomal, los marcadores de la vía endosomal y el tamaño más pequeño entre todos los vehículos eléctricos. El tamaño de los exosomas a menudo se notifica con una variabilidad sustancial entre los estudios. Se encontró que los resultados del tamaño dependían del método, lo que refleja la diferencia en los principios físicos empleados por diferentes técnicas analíticas para estimar los tamaños de EV1,2. Por ejemplo, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, por sus que la técnica de caracterización de tamaño más utilizada- estima el tamaño de los vehículos eléctricos como sus diámetros hidrodinámicos, que caracterizan la resistencia a la movilidad Browniana de los vehículos eléctricos en la solución. Un mayor diámetro hidrodinámico de una vesícula implica su menor movilidad en líquido. La capa coronal alrededor de las vesículas, que consiste en proteínas superficiales y otras moléculas ancladas o adsorbidas a la superficie de la membrana, impide sustancialmente la movilidad y aumenta el tamaño hidrodinámico de los vehículos eléctricos. En términos relativos, este aumento es particularmente grande para los exosomas3, como se ilustra en la Figura 1.
La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una técnica definitiva para caracterizar tamaños de vesículas y morfología en sus estados hidratados. Sin embargo, el alto costo de la instrumentación y la experiencia especializada necesaria para utilizarla motivan correctamente la exploración de técnicas alternativas que pueden crear imágenes de vehículos eléctricos hidratados. Un número relativamente pequeño de vehículos eléctricos observados o caracterizados en las imágenes crio-TEM adquiridas es otra desventaja notable de esta técnica.
La microscopía de fuerza atómica (AFM) visualiza la topografía tridimensional de los vehículos eléctricos hidratados o desecados4,5,6 mediante el escaneo de una sonda a través del sustrato para rasterar la imagen de las partículas en la superficie. En este estudio se describen los pasos esenciales del protocolo para caracterizar los vehículos eléctricos de AFM. Antes de tomar imágenes de las vesículas en líquido, deben ser inmovilizadas sobre un sustrato, ya sea amarre a una superficie funcionalizada, atrapando en un filtro, o por atracción electrostática7. La fijación electrostática en un sustrato cargado positivamente es una opción particularmente conveniente para la inmovilización de exosomas conocidos por tener un potencial zeta negativo. Sin embargo, las mismas fuerzas electrostáticas que inmovilizan las vesículas extracelulares en la superficie también distorsionan su forma, lo que hace que el análisis de datos post-imágenes sea esencial. Elaboramos este punto describiendo el algoritmo que estima el tamaño de las vesículas globulares en la solución basada en los datos de AFM sobre la forma distorsionada de los exosomas inmovilizados en la superficie.
En el protocolo desarrollado, se presenta el procedimiento para la robusta inmovilización electrostática de vesículas y seguido de los pasos necesarios para realizar imágenes de fuerza atómica en los estados hidratados o desecados. Se identifican los factores que influyen en la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas. La guía se da sobre cómo realizar la inmovilización electrostática para muestras con diferentes concentraciones de vehículos eléctricos en la solución. Se discute la selección de condiciones experimentales que permiten la estimación de distribuciones de probabilidad empírica de diferentes propiedades biofísicas basadas en un número suficientemente grande de vesículas inmovilizadas. Se proporcionan ejemplos de análisis post-imagen de los datos de AFM. Específicamente, se describe un algoritmo para determinar el tamaño de las vesículas en la solución basada en la caracterización AFM de los vehículos eléctricos inmovilizados. Los resultados representativos muestran la consistencia del tamaño de la vesícula por AFM con los resultados de la imagen crio-TEM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Los exosomas y otras vesículas extracelulares (EV) son complejos moleculares que consisten en una vesícula de membrana lipídica, su decoración superficial por proteínas de membrana y otras moléculas, y diverso contenido luminal heredado de una célula madre, que incluye ARN, proteínas y los ANN. La caracterización de los tamaños hidrodinámicos de los vehículos eléctricos, que depende del tamaño de la vesícula y su capa coronal formada por decoraciones superficiales, se ha convertido en rutina. Para los exosomas, el más pequeño de los vehículos eléctricos, la diferencia relativa entre los tamaños hidrodinámico y vesícula es significativa. La caracterización de los tamaños de las vesículas mediante la imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), una técnica estándar de oro, sigue siendo un desafío debido al costo del instrumento, la experiencia necesaria para realizar la preparación de la muestra, la toma de imágenes y análisis de datos, y un pequeño número de partículas a menudo observadas en las imágenes. Una alternativa ampliamente disponible y accesible es la microscopía de fuerza atómica (AFM), que puede producir datos versátiles sobre geometría tridimensional, tamaño y otras propiedades biofísicas de las vesículas extracelulares. El protocolo desarrollado guía a los usuarios en la utilización de esta herramienta analítica y describe el flujo de trabajo para el análisis de vehículos eléctricos por el AFM, que incluye la preparación de muestras para la toma de imágenes de vehículos eléctricos en forma hidratada o desecada, la inmovilización electrostática de vesículas en un sustrato, adquisición de datos, su análisis e interpretación. Los resultados representativos demuestran que la fijación de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada es predecible, personalizable y permite al usuario obtener resultados de tamaño para un gran número de vesículas. Se encontró que el tamaño de la vesícula basada en los datos de AFM era consistente con las imágenes crio-TEM.

La fijación superficial de los vehículos eléctricos es un paso crítico en la secuencia de imágenes. La inmovilización electrostática de la superficie de los exosomas, que se sabe que tiene un potencial zeta negativo, se producirá de forma robusta después de que el sustrato de la mica se modifique para tener una carga superficial positiva. Sin el tratamiento con NiCl2 para impartir cambios positivos en la superficie, se encontró que la inmovilización de los vehículos eléctricos en el sustrato era i...

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Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Se describe un procedimiento paso a paso para la inmovilización sin etiquetas de exosomas y vesículas extracelulares a partir de muestras líquidas y sus imágenes mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes AFM se utilizan para estimar el tamaño de las vesículas en la solución y caracterizar otras propiedades biofísicas.

Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Este protocolo describe la preparación simple para la toma de imágenes AFM de vesículas extracelulares en formas hidratadas y desecadas, su inmovilización electrostática, escaneo de superficies, identificación vesical y análisis e interpretación de datos. La principal ventaja de esta técnica es la conveniente fijación electrostática de las vesículas en la superficie de la piel y el análisis post-imagen para tener en cuenta la distorsión de la forma causada por la inmovilización. Los resultados obtenidos del tamaño de las vesículas son consistentes con las imágenes CryoTEM estándar de oro, que sigue siendo una técnica costosa y desafiante.Si usted es un nuevo usuario de AFM, comience con la caracterización de muestras secas antes de proceder a muestras hidratadas. Porque hay numerosos factores adicionales que pueden afectar la adquisición de muestras hidratadas. Para empezar, aísle las vesículas extracelulares de un bio fluido como se describe en el protocolo de texto adjunto.A continuación, fije firmemente un disco de mica a un disco de muestra de acero inoxidable magnético. Corte el disco de mica usando una maquinilla de afeitar afilada para exponer una nueva capa de material. A temperatura ambiente, tratar la superficie superior de la mica durante diez segundos con cien micro litros de una solución de cloruro de níquel II de diez milimolar.Esto modifica la carga de la superficie de negativa a positiva. Borre la solución de cloruro de níquel II con una toallita libre de pelusas o papel hinchado. A continuación, lave la superficie de mica tres veces con agua desionizada y séquela con una corriente de nitrógeno seco.Coloque el disco de muestra AFM con la mica modificada de superficie adjunta en una placa de petri. A continuación, diluir los exosomas con PBS para obtener una concentración entre cuatro y cuarenta mil millones de partículas por mililitro de solución. Validar la concentración de partículas diluida mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas.Forme una gota sésil en la superficie de la mica vaciando cien microlitros de la solución de exosoma diluida de una pipeta. A continuación, coloque la tapa en el plato de petri y séquelo con película de parafen para reducir la evaporación de la muestra. Incubar en el frigorífico durante doce horas.Después de la incubación, aspirar 80 a 90 por ciento de la muestra cuidadosamente sin perturbar la superficie. En este punto, los exosomas serán electrostáticamente inmovilizados en el sustrato de mica. Cuando haga imágenes de muestras hidratadas, enjuague la superficie tres veces con PBS.Tenga cuidado de mantener la muestra hidratada durante todo el proceso de enjuague. Después de lavar la superficie de mica con PBS, retire entre el 80 y el 90 por ciento del líquido y pipetee cuarenta microlitros de PBS fresco para cubrir la muestra. La muestra hidratada está lista para la toma de imágenes.Al tomar imágenes de los EV desecados, retire las sales de la superficie enjuagando el sustrato tres veces con agua desionizada. Después de aspirar tanto líquido como sea posible, sin tocar la superficie, seque el resto con una corriente de nitrógeno seco. Para obtener imágenes de las vesículas extracelulares desecadas, seleccione un voladizo diseñado para escanear en el aire en los modos de toma de imágenes de roscado y sin contacto y colóquelo en el soporte de la sonda.Coloque la muestra en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la muestra en el escenario. Coloque el soporte de la sonda en el AFM.Deje tiempo para que la preparación y la etapa se equilibren térmicamente. Utilice el modo de roscado para escanear un área de 5x5 micras rasterizadas en 512 líneas a una velocidad de escaneo de un hercio. Adquiera las imágenes de altura y fase, ya que proporcionan información gratuita sobre la topografía y las propiedades de superficie de la muestra.El tiempo de escaneo aumentará con un área de imagen y el número de líneas seleccionadas para formar la imagen, pero disminuirá con la velocidad de escaneo. Dado que las velocidades de escaneo rápidas pueden afectar a la calidad de la imagen, la velocidad de rasteración debe ser un equilibrio entre el tiempo de adquisición y la calidad de la imagen. Para tomar imágenes de vesículas hidratadas, seleccione un voladizo adecuado para escanear muestras suaves e hidratadas y monte el voladizo en un soporte de sonda diseñado para escanear en líquidos.Humedezca la punta del voladizo con PBS para reducir la probabilidad de introducir burbujas de aire en el líquido durante el escaneo. A continuación, inmovilice la muestra en la etapa AFM. Una vez que la muestra se equilibra térmicamente, imagen de la superficie de mica hidratada en modo de roscado.Adquiera las imágenes de altura y fase. Para analizar las imágenes tomadas, primero vaya a los modos SPM seleccionados del Proceso de datos, seguido de Tip'y elija Model Tip'Select the geometry and the dimensions of the tip used to scan the sample and click ok'Correct the tip artifact erosions byperforming the surface reconstruction. Abra la imagen.En el menú, seleccione Proceso de datos', seleccione Modos SPM', seguido de Tip', elija Reconstrucción de superficie' y haga clic en Aceptar'Siguiente, seleccione Proceso de datos, seguido de Nivel' y elija Nivel de plano'para alinear el plano de imagen y para que coincida con el plano XY de laboratorio eliminando la inclinación en el sustrato de los datos de escaneado. Alinee filas en la imagen seleccionando Proceso de datos'seguido de Datos correctos' y luego elija Alinear filas'Varias opciones de alineación están disponibles, incluyendo la mediana que es un algoritmo que encuentra una altura media de cada línea de exploración y la resta de los datos. A continuación, vaya a Proceso de datos'seguido por Datos correctos' y elija Eliminar cicatrices'Esto eliminará los errores de escaneo comunes conocidos como Cicatrices'Para alinear la superficie de mica a la altura cero, vaya al menú Proceso de datos'y seleccione Aplanar base'en el menú desplegable Nivel'.Identifique las vesículas celulares adicionales en la superficie escaneada yendo al menú De los granos y usando Mark by Threshold'Este algoritmo identifica los exosomas inmovilizados de la superficie como partículas que sobresalen del sustrato de superficie cero por la altura por encima del umbral seleccionado por el usuario. Seleccione un umbral en el rango entre uno y tres nanómetros. Esto eliminará la mayor parte de la interferencia del fondo del suelo.Por último, realice la caracterización geométrica y dimensional de las vesículas identificadas utilizando los algoritmos de distribuciones disponibles accesibles desde el menú de los granos. Exporte los datos de AFM de Gwyddion para análisis especializados por otras herramientas computacionales y programas informáticos personalizados. La modificación de la superficie del cloruro de níquel da como resultado una inmovilización de vesículas celulares adicionales que depende del tiempo.La concentración superficial de las vesículas inmovilizadas es excesivamente densa después de 24 horas de incubación, mientras que la incubación de 12 horas conduce a menos exosomas y datos de escaneo que son más fáciles de analizar con precisión. Esta imagen de AFM muestra exosomas hidratados MCF7 electrostáticamente inmovilizados en la superficie de mica modificada. La imagen de fase AFM correspondiente confirma que los granos de la imagen de altura son nanopartículas suaves como se debe esperar para las vesículas de membrana.Los datos de altura de tres vesículas a lo largo de la misma línea se muestran aquí. Estos perfiles ilustran una forma aplanada causada por la atracción electrostática de los exosomas a la superficie de carga positiva de la mica modificada. La distorsión de la forma es evidente en una visión ampliada de la vesícula inmovilizada y su sección transversal.Para estimar el tamaño globular de los exosomas en la solución, on puede coincidir con los volúmenes encerrados por envolventes de membrana inmovilizados y esféricos de superficie. La distribución del tamaño de las vesículas globulares en la solución se determinó a partir de los datos AFM de 561 vesículas inmovilizadas. Los tamaños de vesículas en las imágenes de CryoTEM son consistentes con los resultados de AFM.Antes de tomar imágenes de los exosomas hyrdrated, es importante recordar enjuagar bien la superficie con PBS. Esto eliminará los exosomas entrantes y evitará su fijación a la punta de AFM. Cuando haga una toma de imágenes de los exosomas desecados, asegúrese de utilizar agua DI para elevar el sustrato.El lavado DI evitará la formación de cristales de sal en la superficie a medida que el sustrato se seca. Si están presentes, los cristales de sal harán que el procesamiento de imágenes sea una tarea difícil.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Investigación

Bioquímica

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...