Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Författarna erkänner ekonomiskt stöd från National Science Foundation (Award nummer IGERT-0903715), University of Utah (Institutionen för kemiteknik Seed Grant och Graduate Research Fellowship Award), och Skolkovo Institute of Science och teknik (Skoltech Fellowship).

1. isolering av EVS från en kroppsvätskemetabolomik
<ol><li>Isolera EVS med en av de etablerade metoderna, som differential ultracentrifugering8, nederbörd eller storleks uteslutnings kromatografi9.</li>
	<li>Bekräfta närvaron av förväntade yt-och luminala-biomarkörer och frånvaron av biomarkörer som indikerar korskontaminering av preparatet. Bekräfta lipidbilayer morfologin av isolerade partiklar med elektronmikroskopi. Anmärkning: vid iso...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

Immobiliseringen av EVs från en biologisk vätska, ytscanning, och bildanalys är de väsentliga stegen i det utvecklade protokollet för AFM karakterisering av EVs i vätska. Antalet blåsor som kan vara mottagliga för AFM-avbildning vågar med den avbildade ytan och ytkoncentrationen av vesiklarna immobiliserade på underlaget. Givet en negativ Zeta-potential hos EVS och undanflykt18förespråkar vi elektrostatisk fixering av EVS från vätskeprover till AFM-substrat. Immobiliseringen är effe...

Extracellulära blåsor (EVs) är närvarande i alla kroppsvätskor, inklusive blod, urin, saliv, mjölk, och fostervattnet. Exosomes bildar en distrikts klass av EVs åtskilda från andra EVs av endosomalt biogenes, markörer för den endosomala vägen, och den minsta storleken bland alla EVs. Exosomernas storlek rapporteras ofta med stor variation mellan studierna. Storleks resultaten befanns vara metod beroende, vilket återspeglar skillnaden i fysikaliska principer som används av olika analytiska tekniker för att uppskatta EV-storlekarna1,2. Till exempel, nanopartiklar spårningsanalys (NTA) ― den mest använda storleks karakterisering teknik ― uppskattar storleken på EVS som deras hydrodynamiska diametrar, som kännetecknar motståndet mot den Brownian rörligheten för EVS i lösningen. En större hydrodynamisk diameter av en vesikel innebär dess lägre rörlighet i vätska. Det koronala skiktet runt vesikler, bestående av ytproteiner och andra molekyler som är förankrade eller adsorberade till membranytan, försvårar väsentligen rörligheten och ökar den hydrodynamiska storleken på EVs. I relativa termer är denna ökning särskilt stor för undanflykt3, vilket illustreras i figur 1.
Den kryogena transmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM) Imaging är en definitiv teknik för att karakterisera vesikelstorlekar och morfologi i deras hydrerade tillstånd. Men den höga kostnaden för instrumenteringen och den specialiserade expertis som behövs för att använda den på rätt sätt motivera utforskning av alternativa tekniker som kan bilden hydratiserade EVs. Ett relativt litet antal EVs observeras eller kännetecknas i den förvärvade cryo-TEM bilder är en annan anmärkningsvärd nackdel med denna teknik.
Atomkraft mikroskopi (AFM) visualiserar den tredimensionella topografin av hydratiserade eller Desiccated EVS4,5,6 genom att skanna en sond över underlaget till rasterbilden av partiklarna på ytan. De väsentliga stegen i protokollet för att karakterisera EVs av AFM beskrivs i denna studie. Före avbildning av vesiklarna i vätska, måste de immobiliseras på ett substrat genom att antingen tjudra till en funktionaliserad yta, svällning i ett filter, eller av elektrostatisk attraktion7. Den elektrostatiska fixering på ett positivt laddat substrat är ett särskilt bekvämt alternativ för immobilisering av undanflykt kända för att ha en negativ Zeta potential. Men samma elektrostatiska krafter som immobiliserar de extracellulära vesiklarna på ytan förvränger också deras form, vilket gör post-Imaging dataanalys viktigt. Vi utvecklar denna punkt genom att beskriva den algoritm som uppskattar storleken på de globulära vesiklarna i lösningen baserat på AFM data på den förvrängda formen av exosomer immobiliserade på ytan.
I det utvecklade protokollet presenteras förfarandet för den robusta elektrostatiska immobiliseringen av vesikler och följs av de steg som behövs för att utföra Atom krafts avbildning i de hydrerade eller uttorkade tillstånden. De faktorer som påverkar ytkoncentrationen hos de immobiliserade vesiklarna identifieras. Vägledningen ges om hur man utför elektrostatisk immobilisering för prover med olika koncentrationer av EVs i lösningen. Urvalet av experimentella tillstånd som möjliggör uppskattning av empiriska sannolikhetsfördelningar av olika biofysiska egenskaper som baseras på ett tillräckligt stort antal immobiliserade blåsor diskuteras. Exempel på analys efter avbildning av AFM-data ges. Specifikt beskrivs en algoritm för bestämning av storleken på vesikler i lösningen baserad på AFM-karakteriseringen av immobiliserade EVs. De representativa resultaten visar att vesikeln dimensionering av AFM överensstämmer med resultaten av cryo-TEM Imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Exosomes och andra extracellulära blåsor (EVs) är molekylära komplex bestående av en lipid membran vesikel, dess yta dekoration av membranproteiner och andra molekyler, och varierande luminala innehåll ärvs från en förälder cell, som omfattar RNAs, proteiner och DNAs. Karakteriseringen av de hydrodynamiska storlekarna av EVs, som beror på storleken på vesikeln och dess koronala skikt som bildas av ytdekorationer, har blivit rutin. För exosomer, den minsta av EVs, är den relativa skillnaden mellan de hydrodynamiska och vesikler storlekar betydande. Karakterisering av vesikler storlekar av kryogen transmission elektronmikroskopi (cryo-TEM) avbildning, en guld standardteknik, är fortfarande en utmaning på grund av kostnaden för instrumentet, den expertis som krävs för att utföra provet beredning, avbildning och dataanalys och ett litet antal partiklar som ofta observeras i bilder. Ett allmänt tillgängligt och lättillgängligt alternativ är Atom kraftens mikroskopi (AFM), som kan producera mångsidiga data om tredimensionell geometri, storlek och andra biofysiska egenskaper hos extracellulära blåsor. Det utvecklade protokollet vägleder användarna i utnyttjandet av detta analysverktyg och beskriver arbetsflödet för analys av EVs av AFM, vilket inkluderar prov preparationen för avbildning av EVs i hydrerad eller Desiccated form, elektrostatisk immobilisering av substrat, datainsamling, analys och tolkning. De representativa resultaten visar att fixering av EVs på den modifierade glimmer ytan är förutsägbar, anpassningsbar, och tillåter användaren att få dimensionerings resultat för ett stort antal blåsor. Vesikeldimensionering baserad på AFM-data konstaterades överensstämma med cryo-TEM Imaging.

Ytfixering av EVs är ett kritiskt steg i bildsekvensen. Elektrostatisk ytimmobilisering av exosomer, kända för att ha en negativ Zeta-potential, kommer att uppstå kraftigt efter att glimmerets substrat har modifierats för att ha en positiv ytladdning. Utan behandling med NiCl2 för att ge positiva ytförändringar visade sig immobiliseringen av EVS på underlaget vara ineffektiv. Höjd bilden i figur 10a, förvärvad i luften efter att MCF-7 exosome-provet med 2,59 x 101...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Ett steg-för-steg-förfarande beskrivs för etikett fri immobilisering av exosomer och extracellulära blåsor från vätskeprover och deras avbildning med atomkraft mikroskopi (AFM). AFM-bilderna används för att uppskatta storleken på vesiklarna i lösningen och karakterisera andra biofysiska egenskaper.

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Detta protokoll skisserar enkel förberedelse för AFM bildframställning av extracellulära vesicles i hydrerade och uttorkad former, deras elektrostatisk immobilisering, yta skanning, vesical identifiering och data analys och tolkning. Den största fördelen med denna teknik är den bekväma elektrostatiska fixering av vesiklar på hudens yta och post imaging analys att redogöra för formförvrängning orsakad av immobilisering. De erhållna vesicles dimensionering resultat överensstämmer med Gold Standard CryoTEM Imaging som fortfarande är kostsam och utmanande teknik.Om du är en ny AFM-användare, börja med karakterisering av torra prover innan du fortsätter till hydratiserade prover. Eftersom det finns många ytterligare faktorer som kan påverka hydratiserade prov förvärv. Till att börja isolera extracellulära vesiklar från en bio-vätska som beskrivs i den medföljande textprotokoll.Därefter fäster du fast en glimmerskiva på en magnetisk preparatskiva av rostfritt stål. Klyva glimmerskivan genom att använda en vass rakkniv för att exponera ett nytt lager av material. Vid rumstemperatur, behandla den övre ytan av glimmer i tio sekunder med hundra mikro-liter av en tio millimolar nickel II kloridlösning.Detta ändrar ytans laddning från negativ till positiv. Blot nickel II kloridlösning med en ludd fri torka eller blotting papper. Sedan tvättar du glimmerytan tre gånger med avjoniserat vatten och torkar den med en ström av torrt kväve.Placera AFM-preparatskivan med den bifogade ytanmodifierade glimmern i en petriskål. Därefter späd exosomerna med PBS för att få en koncentration mellan fyra och fyrtio miljarder partiklar per milliliter lösning. Validera den utspädda partikelkoncentrationen med hjälp av nanopartikelspårningsanalys.Bilda en sessile droppe på ytan av glimmer genom att tömma hundra mikroliter av den utspädda exosomen lösningen från en pipett. Placera sedan locket på petriskålen och försegla den med parafenfilm för att minska provavdunstningen. Inkubera i kylskåp i tolv timmar.Efter inkubation, aspirera 80 till 90 procent av provet försiktigt utan att störa ytan. Vid denna punkt kommer exosomerna att elektrostatiskt immobiliseras på glimmersubstratet. När du avbildar hydratiserade prover, skölj ytan tre gånger med PBS.Var noga med att hålla provet hydratiskt under hela sköljningsprocessen. Efter tvätt av glimmerytan med PBS, avlägsna 80 till 90 procent av vätskan och pipetten fyrtio mikroliter av färska PBS för att täcka provet. Det hydrerade provet är klart för avbildning.När du imaging de uttorkad EV:s, ta bort salterna från ytan genom att skölja underlaget tre gånger med avjoniserat vatten. Efter aspirerande så mycket vätska som möjligt, utan att vidröra ytan, torka resten med en ström av torrt kväve. För att avbilda de uttorkade extracellulära vesiklarna, välj en cantilever avsedd för skanning i luften i tappning och beröringsfria bildhanteringslägen och montera den på sondhållaren.Placera provet på AFM-scenen. Den magnetiska rostfritt stål exemplar skiva kommer immobilisera provet på scenen. Placera sondhållaren i AFM.Låt förberedelsen och stadiets tid ekvilo termiskt. Använd tappningsläget för att skanna ett område som är 5x5 mikrometer som rasterade i 512 linjer med en skanningshastighet på en hertz. Skaffa både höjd- och fasbilderna då de ger gratis information om topografin och ytegenskaperna hos provet.Scan tiden kommer att öka med en avbildad yta och antalet linjer som valts för att bilda bilden, men minska med skanningsfrekvensen. Eftersom snabba skanningshastigheter kan påverka bildkvaliteten, bör hastigheten för rastrering vara en balans mellan förvärvstid och bildkvalitet. För att avbilda hydrerade vesiklar, välj en cantilever som är lämplig för att skanna mjuka, hydrerade prover och montera cantilever på en sondhållare avsedd för skanning i vätskor.Blöt spets på cantilever med PBS för att minska sannolikheten för att införa luftbubblor till vätskan under skanning. Därefter immobilisera provet på AFM-scenen. När provet är termiskt ekvillibrerat avbildar du den hydrerade glimmerytan i tappningsläge.Skaffa både höjd- och fasbilderna. För att analysera bilderna som tas, först gå till Data Process'select SPM lägen, följt av Tip'och välj Modell Tips 'Välj geometri och måtten på den spets som används för att skanna provet och klicka på OK'Korrigera spetsen erosion artefakter genom att utföra ytan återuppbyggnaden. Öppna bilden.På menyn väljer du Data Process'välj sedan SPM Modes'följt av Tip'välj sedan Ytrekonstruktion'och klicka på OK'Nästa, välj Data process, följt av Level'och välj Plan Level'för att justera bildplan och för att matcha laboratoriet XY-plan genom att ta bort lutningen i substratet från scan-data. Justera rader i bilden genom att välja Data Process'följt av Korrigera data'och välj sedan Justera rader'Flera justeringsalternativ finns tillgängliga inklusive median som är en algoritm som hittar en genomsnittlig höjd av varje skanningslinje och subtraherar den från data. Därefter går till Data Process'följt av Korrigera data'och välj Ta bort ärr'Detta kommer att ta bort vanliga skanningsfel som kallas Scars'Att anpassa glimmer ytan på noll höjd, gå till Data Process'menyn och välj Platta Base'i Level'drop down menyn.Identifiera de extra cellulära vesicles på den skannade ytan genom att gå till Grains'menu och använda Mark by Threshold'Denna algoritm identifierar ytan immobiliserade exosomer som partiklar som sticker ut från nollytans substrat av höjden över användarens valda tröskel. Välj ett tröskelvärde i intervallet mellan en och tre nanometer. Detta kommer att eliminera de flesta av ryggen marken störningar.Slutligen, utföra geometriska och dimensionella karakterisering av de identifierade vesiklar med hjälp av de tillgängliga distributioner algoritmer åtkomliga från Grains'menu. Exportera AFM-data från Gwyddion för specialiserad analys av andra beräkningsverktyg och anpassade datorprogram. Nickelkloridytans modifiering resulterar i en immobilisering av extra cellulära vesiklar som är tidsberoende.Ytkoncentrationen av de immobiliserade vesiklarna är alltför tät efter 24 timmars inkubation medan 12 timmars inkubation leder till färre exosomer och skanna data som är lättare att analysera exakt. Denna AFM bild visar hydrerade MCF7 exosomer elektrostatiskt immobiliserade på den modifierade glimmer ytan. Motsvarande AFM fas bilden bekräftar att kornen i höjdbilden är mjuka nano partiklar som bör förväntas för membran vesiklar.Höjddata för tre vesiklar längs samma linje visas här. Dessa profiler illustrerar en tillplattad form som orsakas av exosomernas elektrostatiska dragningskraft på den modifierade glimmerns positivt laddningsyta. Formdistorsionen är uppenbar i en förstorad syn på den immobiliserade vesikel och dess tvärsnitt.För att uppskatta den klotformiga storleken på exosomerna i lösningen, på kan matcha de volymer som omsluts av ytan immobiliserade och sfäriska membrankuvert. Storleksfördelningen av klotformiga vesiklar i lösningen fastställdes från AFM-data från 561 immobiliserade vesiklar. Vesikelstorlekarna i CryoTEM-bilderna stämmer överens med AFM-resultaten.Innan du imaging de hyrdrated exosomer, är det viktigt att komma ihåg att noggrant skölja ytan med PBS. Detta kommer att ta bort inkommande exosomer och förhindra deras fastsättning till AFM spets. När du avbildar de utsöndrerade exosomerna, se till att använda DI-vatten för att stiga underlaget.DI-tvätten kommer att förhindra bildandet av saltkristaller på ytan när substratet torkar. Om närvarande, salt kristaller kommer att göra bildbehandling en svår uppgift.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering av vävnads extracellulära blåsor från levern

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snabb fluorescens-baserade karakterisering av enda extracellulär blåsor i människans blod med nanopartiklar-tracking analys

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimering av flödescytometriska sorteringsparametrar för isolering med hög genomströmning och rening av små extracellulära vesiklar

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...