Name: imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Yazarlar Ulusal Bilim Vakfı (ödül numarası IGERT-0903715), Utah Üniversitesi (Kimya Mühendisliği Tohum Hibe ve Lisansüstü Araştırma Bursu Ödülü Bölümü) ve Skolkovo Bilim Enstitüsü mali destek kabul ve Teknoloji (Skoltech Bursu).

1. EVs bir biyosıvı dan izolasyon
<ol><li>Diferansiyel ultrasantrifüj8,yağış veya boyut dışlama kromatografisi9gibi yerleşik yöntemlerden biri ile EVs izole .</li>
	<li>Beklenen yüzey ve luminal biyobelirteçlerin varlığını ve preparatın çapraz kontaminasyonunu gösteren biyobelirteçlerin eksikliğini doğrulayın. Elektron mikroskobu ile izole edilmiş parçacıkların lipid çift katmanlı morfolojisini doğrulayın. NOT: Ekzozomlar...

<ol>
	<li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes.">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li><li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility.">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li><li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles.">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning.">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li><li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001 (2018).</li><li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions.">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).</li><li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling.">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li><li>Ne&#269;as, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gwyddion:+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis.">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li><li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling.">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 34 (2013).</li><li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features.">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li><li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays.">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells.">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li><li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+amniocytes+express+hTERT,+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles.">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li><li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes.">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).</li><li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops.">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li><li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy.">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li><li>Pastr&#233;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions:+A+Theoretical+and+Experimental+Study.">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification,+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li></ol>

EVs'nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV'lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar18negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunuc...

Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV'ler arasında en küçük boyut ile diğer EV'lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en yaygın olarak kullanılan boyut karakterizasyon tekniği ― evs'lerin boyutunu, çözeltideki EV'lerin Brownian hareketliliğine karşı direnci karakterize eden hidrodinamik çapları olarak tahmin eder. Bir vezikül daha büyük bir hidrodinamik çapı sıvı düşük hareketlilik anlamına gelir. Veziküllerin etrafındaki koronal tabaka, membran yüzeyine demirlemiş veya adsorbe edilmiş yüzey proteinlerinden ve diğer moleküllerden oluşan, hareketliliği önemli ölçüde engeller ve EVs'lerin hidrodinamik boyutunu artırır. Göreceli olarak, bu artış özellikle ekzozomlar için büyüktür 3, Şekil 1'degösterildiği gibi .
Kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme, sulu hallerinde vezikül boyutları ve morfolojisini karakterize etmede belirleyici bir tekniktir. Ancak, enstrümantasyon yüksek maliyet ve doğru sulu EVs görüntü alternatif tekniklerin keşfi motive kullanmak için gerekli özel uzmanlık. Edinilmiş kriyo-TEM görüntülerinde gözlenen veya karakterize edilen nispeten az sayıda EV bu tekniğin bir diğer önemli dezavantajıdır.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yüzeydeki parçacıkların görüntüsünü canlandırmak için substrat boyunca bir sonda tarayarak sulu veya kurutulmuş EVs4,5,6 üç boyutlu topografya görselleştirir. EVs'i AFM ile karakterize etmek için protokolün temel adımları bu çalışmada özetlenmiştir. Sıvı vezikülleri görüntülemeden önce, bir substrat üzerinde ya işlevsel bir yüzeye tethering tarafından immobilize edilmelidir, bir filtre içinde bindirme, ya da elektrostatik çekim7. Pozitif yüklü bir substrat üzerindeki elektrostatik fiksasyon, negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların immobilizasyonu için özellikle uygun bir seçenektir. Ancak, yüzeydeki hücre dışı vezikülleri hareketsiz hale getiren aynı elektrostatik kuvvetler de şekillerini bozar, bu da post-görüntüleme veri analizini gerekli kılar. Bu noktayı, yüzeyde hareketsiz hale getirilen ekzozomların çarpık şekli ne kadar çarpık şekli ne kadar aparat lara dayanarak çözümdeki küresel veziküllerin boyutunu tahmin eden algoritmayı tanımlayarak ayrıntılı olarak ele alıyoruz.
Geliştirilen protokolde, veziküllerin sağlam elektrostatik immobilizasyonu için prosedür sunulur ve sulu veya kurutulmuş durumlarda atomik kuvvet görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli adımları takip eder. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonunu etkileyen faktörler tanımlanır. Çözeltide farklı yoğunlukta EV'lere sahip numuneler için elektrostatik immobilizasyonun nasıl gerçekleştirilenekadar gerçekleştirildiği konusunda kılavuz verilir. Yeterince çok sayıda hareketsiz veziküle dayalı farklı biyofiziksel özelliklerin ampirik olasılık dağılımlarının tahmin edilmesine izin veren deneysel koşulların seçimi tartışılmıştır. AFM verilerinin post-görüntüleme analiziörnekleri verilmiştir. Özellikle, immobilize EVs AFM karakterizasyonu dayalı çözüm veziküllerin boyutunu belirlemek için bir algoritma açıklanmıştır. Temsili sonuçlar, AFM tarafından kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile vezikül boyutlandırmasının tutarlılığını göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">AFM/STM Controller&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Bruker</td>
			<td style="width:93px;">Multimode Nanoscope V</td>
			<td style="width:173px;">This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">16207</td>
			<td>Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM/STM Mica discs (10 mm)</td>
			<td>TedPella</td>
			<td align="right">50</td>
			<td>Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085&#8221;) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for imaging in the air</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TESP-V2</td>
			<td>High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AFM probe for soft sample imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.&#160; The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Double sided tape</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>360-77705</td>
			<td>Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ExoQuick-TC</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EXOTC50A-1</td>
			<td>ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>&#160;MTFML-V2</td>
			<td>This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160; The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.&#160; The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.&#160; The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gwyddion</td>
			<td>Czech Metrology Institute.</td>
			<td>Version 2.52</td>
			<td>Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lint-free blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Whatman&#160;</td>
			<td>Grade GB003 Blotting Paper</td>
			<td>Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica&#39;s substrate.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lint-free cleanroom wipes</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>AlphaWipe TX1004</td>
			<td>Use these polyester wipes for surface cleaning.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Nickel(II) chloride (NiCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">339350</td>
			<td>Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of extracellular vesicles by atomic force microscopy

Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA'lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV'lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E'leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.

EVs yüzey fiksasyonu görüntüleme dizisinde kritik bir adımdır. Negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların elektrostatik yüzey immobilizasyonu mikanın substratı pozitif yüzey yüküne sahip olacak şekilde değiştirildikten sonra sağlam bir şekilde ortaya çıkar. NiCl2 ile pozitif yüzey değişiklikleri sağlamak için tedavi olmadan, substrat üzerinde EVs immobilizasyon etkisiz olduğu bulunmuştur. Şekil 10A'dakiyükseklik görüntüsü, PBS'n...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Bu protokol, sulu ve kurutulmuş formlarda hücre dışı veziküllerin AFM görüntülemesi, elektrostatik immobilizasyonu, yüzey taraması, vesitik tanımlama ve veri analizi ve yorumlanması için basit bir hazırlık özetlensin. Bu tekniğin en büyük avantajı, veziküllerin cilt yüzeyinde uygun elektrostatik fiksasyonu ve immobilizasyonun neden olduğu şekil bozulmasını hesaba katmak için post görüntüleme analizidir. Elde edilen vezikül boyutlandırma sonuçları, pahalı ve zorlu bir teknik olmaya devam eden Altın Standart KriyoTEM Görüntüleme ile uyumlu.Yeni bir AFM kullanıcısıysanız, sulu numunelere geçmeden önce kuru numunelerin karakterizasyonuyla başlayın. Çünkü sulu numune alımLarını etkileyebilen çok sayıda ek faktör vardır. Başlamak için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi ekstrasellüler vezikülleri bir biyo-sıvıdan ayırın.Daha sonra, manyetik paslanmaz çelik numune diskine mika diski sıkıca takın. Yeni bir malzeme tabakasını ortaya çıkarmak için keskin bir jilet kullanarak mika diski ayırın. Oda sıcaklığında, on milimolar nikel II klorür çözeltisi yüz mikro litre ile on saniye mika üst yüzeyi tedavi.Bu, yüzeyin yükünü negatiften pozitife değiştirir. Nikel II klorür çözeltisini tüy bırakmayan silme veya lekeleme kağıdı ile lekele. Daha sonra mika yüzeyini üç kez deiyonize suyla yıkayın ve kuru bir azot akışı ile kurulayın.AFM numune diskini bağlı yüzeymodifiye mika ile bir petri kabına yerleştirin. Daha sonra, çözeltimililitre başına dört ve kırk milyar parçacık arasında bir konsantrasyon elde etmek için PBS ile ekzozomları seyreltin. Nano parçacık izleme analizini kullanarak seyreltilmiş parçacık konsantrasyonu doğrulayın.Bir pipetten seyreltilmiş ekzozom çözeltisinin yüz mikrolitresini boşaltarak mika yüzeyinde sessile bir damla oluşturun. Daha sonra petri kabının kapağını yerleştirin ve numune buharlaşmasını azaltmak için parafen filmile kapatın. Buzdolabında 12 saat kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra, yüzeyi bozmadan numunenin yüzde 80-90'ını dikkatlice aspire edin. Bu noktada, ekzozomlar mika substrat üzerinde elektrostatik olarak hareketsiz hale gelecektir. Sulu numuneleri görüntülerken yüzeyi PBS ile üç kez durulayın.Durulama işlemi boyunca numunenin sulu tutulmasına özen tin. Mika yüzeyini PBS ile yıkadıktan sonra, numuneyi kapsayacak şekilde sıvı ve pipet kırk mikrolitre taze PBS'nin yüzde 80 ila 90'ını çıkarın. Sulu numune görüntüleme için hazır.Kurutulmuş EV'leri görüntülerken, substratı üç kez deiyonize suyla durulayarak tuzları yüzeyden çıkarın. Mümkün olduğunca çok sıvı aspire ettikten sonra, yüzeye dokunmadan, kuru azot akışı ile geri kalanı kuru. Kurutulmuş hücre dışı vezikülleri görüntülemek için, dokunarak ve temassız görüntüleme modlarında havada tarama için tasarlanmış bir kantili seçin ve sonda tutucuya monte edin.Örneği AFM aşamasına yerleştirin. Manyetik paslanmaz çelik numune diski sahnede numuneyi hareketsiz hale getirecektir. Sonda tutucuyu AFM'ye yerleştirin.Hazırlık ve sahne termal olarak dengelemek için zaman bekleyin. 512 satırda 5x5 mikron olan bir alanı bir hertz'in tetkik hızında tmak için dokunma modunu kullanın. Topografya ve numunenin yüzey özellikleri hakkında ücretsiz bilgi sağlarken hem yükseklik hem de faz görüntülerini elde edin.Görüntülenmiş bir alan ve görüntüyü oluşturmak için seçilen satır sayısı yla tazyik süresi artar, ancak tazyik hızıyla azalır. Hızlı tetkik hızları görüntü kalitesini etkileyebilecek olduğundan, hız kazanılması süresi ile görüntü kalitesi arasında bir denge olmalıdır. Sulu vezikülleri görüntülemek için yumuşak, sulu numuneleri taramak için uygun bir kantil i seçin ve kantili sıvılarda tarama için tasarlanmış bir sonda tutucuya monte edin.Tarama sırasında sıvıya hava kabarcıkları sokulma olasılığını azaltmak için kantilin ucunu PBS ile ısla. Ardından, örneği AFM aşamasına geçirin. Numune termal olarak dengelendikten sonra, sulu mika yüzeyini dokunma modunda görüntüleyin.Hem yükseklik hem de faz görüntülerini edinin. Alınan görüntüleri analiz etmek için önce Veri İşlemi'nin seçtiği SPM modlarına gidin, ardından Tip'i seçin ve Örneklem'i tatmak için kullanılan geometriyi ve ucun boyutlarını seçin ve yüzey rekonstrüksiyonunu gerçekleştirerek Tamam'Düzelt'i tıklatın. Görüntüyü açın.Menüden Veri İşlemi'ni seçin, Daha sonra SPM Modes'u seçin', ardından Yüzey Rekonstrüksiyonunu seçin ve Ok'Next'i seçin, Veri İşlemi'ni seçin, ardından Düzey'i seçin ve görüntüleme düzlemini hizalamak ve yüzeydeki eğimi tetkikten kaldırarak laboratuvar XY düzlemini eşleştirmek için Düzlem Seviyesi'ni seçin. Veri İşlemi'ni doğru veriler'i seçerek görüntüdeki satırları hizala ve ardından Hizalama Satırları'nın her bir tarama satırının ortalama yüksekliğini bulan ve verilerden çıkaran bir algoritma olan medyan dahil olmak üzere çeşitli hizalama seçenekleri kullanılabilir. Daha sonra, Veri İşlemi'nin ardından Doğru Veri'ye gidin ve Scars'Bu olarak bilinen yaygın tarama hatalarını ortadan kaldır', mika yüzeyini sıfır yükseklikte hizalamak, Veri İşlemi'nin menüsüne gidin ve Level'drop menüsünden Flatten Base'in'ini seçin.Grains'in menüsüne giderek taranmış yüzeydeki ekstra hücresel vezikülleri tanımlayın ve Threshold'Bu algoritma, yüzeyimsiz ekzozomları, kullanıcı seçilen eşiğin üzerindeki yüksekliğe göre sıfır yüzey yüzeyinden çıkan parçacıklar olarak tanımlar. Bir ve üç nanometre arasındaki aralıkta bir eşik seçin. Bu arka zemin girişim çoğu ortadan kaldıracaktır.Son olarak, Tanecikler menüsünden erişilebilen kullanılabilir dağılım algoritmalarını kullanarak tanımlanan veziküllerin geometrik ve boyutsal karakterizasyonunu gerçekleştirin. Diğer hesaplama araçları ve özel bilgisayar programları tarafından özel analiz için Gwyddion'dan AFM verilerini dışa aktarın. Nikel klorür yüzey modifikasyonu zamana bağlı ekstra hücresel veziküllerin immobilizasyonu ile sonuçlanır.Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonu 24 saatlik kuluçkadan sonra aşırı yoğundur, 12 saatlik kuluçka ise daha az ekzozom ve doğru analiz edilmesi daha kolay olan verileri taranan verilere yol açar. Bu AFM görüntüsü, modifiye mika yüzeyinde elektrostatik olarak hareketsiz hale getirilen sulu MCF7 ekzozomlarını göstermektedir. İlgili AFM faz görüntüsü, yükseklik görüntüsündeki tanelerin membran vezikülleri için beklendiği gibi yumuşak nano parçacıklar olduğunu doğrular.Aynı çizgi boyunca üç veziküliçin yükseklik verileri burada gösterilmiştir. Bu profiller, modifiye mikanın pozitif yük yüzeyine ekzozomların elektrostatik çekiminin neden olduğu düzleştirilmiş bir şekli göstermektedir. Şekil bozulması immobilize vezikül ve kesitinin geniş bir görünümünde belirgindir.Çözeltideki ekzozomların küresel boyutunu tahmin etmek için, yüzey immobilize ve küresel membran zarfları ile çevrili hacimleri eşleşebilir. Çözeltideki globüler veziküllerin boyut dağılımı 561 immobilize veziküllerin AFM verilerinden belirlendi. CryoTEM görüntülerindeki vezikül boyutları AFM sonuçlarıyla uyumlu.Hyrrated ekzozomları görüntülemeden önce yüzeyi PBS ile iyice durulamayı unutmamak önemlidir. Bu, gelen ekzozomları ortadan kaldırır ve AFM ucuna bağlanmalarını önler. Kurutulmuş ekzozomları görüntülerken, substratı yükselmek için DI suyu kullandığınızdan emin olun.DI yıkama substrat kurur gibi yüzeyde tuz kristallerinin oluşumunu önleyecektir. Varsa, tuz kristalleri görüntü işleme zor bir görev yapacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...