Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) والبرتا يبتكر التكنولوجيا المستقبلية، والمرأة ومعهد أبحاث صحة (وتشري الطفل).

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1-البروتوكول 1: التصور للاستغاثة باستخدام ستيريوميكروسكوبي وتصوير التباين (DIC) التدخل التفاضلية
<ol><li>جمع الجنين<ol>
<li>في خزان مياه الكلور، إعداد الصلبان من gdf6a+/- الزرد في المساء بالاقتر...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+coloboma:+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience.">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li><li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+colobomata.">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li><li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+microphthalmia,+anophthalmia+and+coloboma.">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li><li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+coloboma:+clinical+and+basic+science+update.">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li><li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature.">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li><li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma,+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye.">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

وهنا، نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة SOS في الجنين النامي الزرد. لتحديد تعمل تأخير الإغلاق، ولدينا بروتوكولات ركزت على القدرة على التمييز بين فصل الفصوص منفصلة اثنين من الجانبين الظهرية الآنف والظهريه الزمانية العين، مماثلة للتقنيات المستخدمة لتصور تأخير إغلاق الشق شرويد تعم?...

تشكيل العين الفقاريات هي عملية عالية مصانة التي تحدد أنواع الأنسجة مدبرة بعناية من مسارات الإشارات بين الخلايا وتحديد الهوية الإقليمية1. الاضطرابات إلى أوائل العين morphogenesis ينتج عيوب عميقة على بنية العين، وهي التي كثيرا ما تسبب العمى2. واحد مثل هذا المرض نتيجة لعدم إغلاق الشق العين تشورويد في الجانب البطني من كأس البصرية3. ويقدر هذا الاضطراب، المعروفة باسم الثلامه العين، تحدث في 1 من أصل 4-5000 مولود والسبب 3-11% من العمى طب الأطفال، يظهر عادة كبنية مثل ثقب المفتاح الذي يبرز إينفيريورلي من التلميذ في مركز العين4، 5،6. وظيفة الشق شرويد توفير نقطة انطلاق للمفرج المبكر المتزايد في كأس البصرية، بعد ذلك سوف الصمامات على جانبي الشق أن أرفق سفن7.
بينما كان معروفا الثلامه العين منذ العصور القديمة، لقد حددنا مجموعة فرعية جديدة من المرضى الثلامه مؤخرا مع فقدان الأنسجة التي تؤثر على الجانب الأعلى/الظهرية للعين. عمل مؤخرا في مختبر لدينا أدت إلى اكتشاف بنية العين بالعين الظهرية الزرد، والتي نشير إلى أنها متفوقة ناصف العين (SOS) أو شرخ متفوقة8. من المهم أن نلاحظ أن البنية خصائص ناصف والشق. شبيه ناصف، أنها طبقة نسيج مستمر الذي يمتد من الآنف أن الشبكية الزمانية. وباﻹضافة إلى ذلك، إغلاق الهيكل هو عدم توسط مزيجاً من اثنين يعارضان الغشاء، ويبدو أنها تتطلب عملية مورفوجينيتيك التي يسكنها الهيكل الخلايا. ومع ذلك، شبيه الشق، وأنها تشكل هيكل الذي يفصل بين جانبي الآنف والزمانية العين الظهرية مع الغشاء الطابق السفلي. للاتساق، سنشير إليها كاستغاثة في هذا النص.
SOS هو يحافظ تقحم عبر الفقاريات، يجري مرئية أثناء morphogenesis العين في الأسماك، والفرخ، نيوت، والماوس8. خلافا للشق شرويد، الذي موجود من 20-60 ساعة بعد الإخصاب (hpf) في الزرد، الغاية عابرة، يجري مرئية بسهولة من 20-23 هبف SOS وغائبة من 26 هبف8. قد وجدت البحوث التي أجريت مؤخرا في مختبر لدينا، مماثلة للشق choroid, SOS يلعب دوراً في توجيه الأوعية الدموية خلال العين morphogenesis8. على الرغم من أن العوامل التي تتحكم في تشكيل وإغلاق SOS لا يفهم تماما بعد من، سلطت الضوء على البيانات المتوفرة لدينا أدوار للعين الظهرية البطني الزخرفة الجينات8.
الزرد كائن حي نموذجا ممتازا لدراسة SOS. كنظام نموذجي، ويوفر عددا من المزايا في دراسة التنمية العين: نموذج فقاريات؛ كل جيل يسلك خصوبة عالية (~ 200 الأجنة)؛ أن الجينوم قد تم تماما متتابعة، مما يسهل التلاعب بالجينات؛ وحوالي 70% جينات البشرية أورثولوجوي الزرد واحد على الأقل، مما يجعل من نموذج مثالي المستندة إلى علم الوراثة من الأمراض البشرية9،10. الأهم من ذلك، تنميته تأخذ مكان خارجياً للأم، ولها يرقات تتسم بالشفافية، مما يسمح لتصور العين النامية بسهولة نسبية11.
في هذه المجموعة من البروتوكولات، يصف لنا التقنيات التي من خلالها يمكن تصور SOS في الزرد اليرقات. تسمح مجموعة متنوعة تقنيات التصوير المستخدمة في هذا التقرير الملاحظة واضحة للاستغاثة أثناء تطوير العين العادية، وكذلك القدرة على اكتشاف العيوب الإغلاق SOS. لدينا بروتوكولات المثال سوف تتميز بتحقيقات Gdf6، بمب المترجمة إلى الظهرية العين ومنظم المعروفة للإغلاق SOS. علاوة على ذلك، يمكن الجمع بين هذه التقنيات مع المعالجات التجريبية لتحديد العوامل الوراثية أو وكلاء الدوائية التي تؤثر على تشكيل SOS السليم والإغلاق. وباﻹضافة إلى ذلك، أدرجنا بروتوكول الممكن من خلالها التصوير الفلورسنت جميع أغشية الخلايا، السماح المجرب لمراقبة التغيرات المورفولوجية للخلايا المحيطة الاستغاثة. أن هدفنا هو إنشاء مجموعة من بروتوكولات موحدة يمكن استخدامها في جميع أنحاء المجتمع العلمي لتقديم رؤى جديدة في هذا الهيكل رواية العين النامية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

الثلامه العين الخلقية هو اضطراب وراثي هو عادة ما يحتفل فيه المشقوق في الجانب السفلي العين الناجمة عن الإغلاق الشق شرويد غير مكتملة. مؤخرا، تحديد هوية الأفراد مع الثلامه في الجانب متفوقة القزحية والشبكية، والعدسة التي أدت إلى اكتشاف بنية الرواية، يشار إلى الشق متفوقة أو متفوقة ناصف العين (SOS)، موجود عابر على الظهرية جانب كأس البصرية أثناء تطوير عين الفقاريات. على الرغم من أن هذا الهيكل هو حفظت عبر نيوت والأسماك، الفئران والفرخ، يقتصر فهمنا الحالي للاستغاثة. من أجل توضيح العوامل التي تسهم في تشكيل والإغلاق، يتحتم أن تكون قادرة على الاحتفال به وتحديد شذوذ، مثل التأخير في إقفال SOS. هنا، نحن المبينة لإنشاء مجموعة موحدة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها بكفاءة عن طريق الجمع بين تقنيات الفحص المجهري متاحة على نطاق واسع مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية المشتركة مثل تلطيخ إيمونوفلوريسسينت ومرناً تصور SOS أوفيريكسبريشن. بينما يركز هذا المجموعة من البروتوكولات على القدرة على مراقبة تأخير إغلاق SOS، هو يتكيف مع احتياجات المجرب ويمكن تعديلها بسهولة. وعموما، نأمل أن إنشاء أسلوب ودود من خلالها يمكن المتقدم فهمنا للاستغاثة توسيع المعارف الراهنة للتنمية عين الفقاريات.

يظهر الزرد SOS في 20 هبف في الشبكية الظهرية الظني8. طريق التحولات هبف SOS 23 من بنيتها الضيقة الأولى إلى المسافة بادئة واسعة و 26 هبف أنها لم تعد مرئية8. ولذلك، يجب دراسة SOS أثناء تطوير العين الزرد العادية، التقيد بالأجنة بين 20-23 هبف. وخلال هذه الفترة، هو ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

التصور "ناصف العين العليا" خلال Embryogenesis ريريو دانيو

وهنا، فإننا نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة ناصف العين متفوقة، بنية حددت مؤخرا، وحفظت تقحم في عين الفقاريات. استخدام اليرقات الزرد، علينا أن نظهر التقنيات اللازمة لتحديد العوامل التي تسهم في تشكيل وإغلاق ناصف العين متفوقة.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

يمكن استخدام هذه المجموعة من بروتوكولات المعايير لتقديم نظرة جديدة إلى sulcus العين متفوقة، أو SOS، وهو هيكل اكتشفت مؤخرا من العين النامية. هذه البروتوكولات سوف تسمح لأي مجرب في جميع أنحاء العالم لتصور واضح SOS خلال تطوير العين حمار وحشي. تبدأ بوضع عامل تمايز النمو heterozygous ستة حمار وحشي ذكر وأنثى على جانبي منفصلة من مقسم في خزان من المياه كلوريه في المساء قبل الاقتران بهم.في صباح اليوم التالي، وإزالة المقسم والسماح للأسماك لتربية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. في نهاية فترة التكاثر، اجمع الأجنة في أطباق بيتري التي تحتوي على E3 المتوسطة لاحتضانها في حاضنة 28.5 درجة. في 20 ساعة بعد الإخصاب، استبدال سوبرنات مع E3 المتوسطة تكمل 0.004٪- فينيل-2-ثيريو لمنع إنتاج الصباغ وفحص الأجنة عن طريق المجهر الخفيفة للتأكد من أنهم جميعا في مرحلة النمو المناسبة.ضع العينات تحت مجهر تشريح. تخلص من أي أجنة غير ناضجة من الناحية التنموية واستخدم ملقطًا جيدًا لسحب المشيات برفق. تصور SOS، والتي قد تظهر كمسافة بادئة أو خط عند الهامش الظهري للعين.ثم، فرز الأجنة التي تظهر تأخير إغلاق SOS من تلك التي لا. لتصوير هذه الأجنة باستخدام مجهر تشريح، وإعداد طبق بيتري يحتوي على 1٪ agarose في E3 المتوسطة ووخز طفيفة مركز agarose لخلق ثقب ضحل الذي يمكن وضع صفار الجنين في. ثم، ضع جنينًا مُغَدَّدًا لاحقًا على الأغاروز.لتصوير الأجنة باستخدام مجهر مركب أو مجهر confocal، نقل جنين في طبق بيتري 35 ملليمتر يحتوي على بولوس صغير من غير هلام 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E3 المتوسطة واستخدام خط الصيد غرامة لوضع بسرعة الجنين في الموقف الجانبي. عندما يبرد agarose، صب ما يكفي E3 المتوسطة في الطبق لتغطية agarose واستخدام عدسة الهدف غمر الماء 20x لتصور SOS. بعد التصوير، سحب بلطف agarose من الجنين وإصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde أو السماح للحمار الوحشي لمواصلة تطورها.لتصور SOS بواسطة التعبير مرنا الفلورسنت، استخدم جهاز الحقن المجهري لحقن 300 بيكوغرام من MRNA GFP-CAX المحسنة في الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة. ثم استخدم منظار استريو الفلورسنت لفحص الأجنة مع التعبير GFP المعزز الساطع والحصول على صور للأجنة بواسطة إحدى طرق التصوير كما هو موضح. لتلوين كامل من دونيفورسنت من لامينين حمار وحشي جنيني، dechorionate الأجنة كما هو موضح وإصلاح الأجنة في أنبوب microcentrifuge في إعداد حديثا 4٪ شبهformaldehyde لمدة ساعتين على شاكر درجة حرارة الغرفة.في نهاية التثبيت، وغسل الأجنة أربع مرات في برنامج تلفزيوني زائد توين، أو PBST، لمدة خمس دقائق لكل غسل تليها permeabilization في 10 ميكروغرام في المليلتر أو البروتينات K في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. غسل الأجنة permeabilized أربع مرات في PBST كما ثبت ومنع الأجنة في مصل الماعز 5٪واثنين من ملليغرام لكل ملليلتر من الألبومين مصل البقر في PBST لمدة ساعة إلى ساعتين على شاكر درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، احتضان الأجنة في الأجسام المضادة الأولية المضادة للصمين من الفائدة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر.في صباح اليوم التالي، يغسل الأجنة خمس مرات في PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسل وتسمية الأنسجة مع جسم مضاد الثانوية المناسبة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، غسل الأجنة أربع مرات في PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسل ووضع الأجنة في طبق بيتري صغير يحتوي على PBST جديدة. باستخدام ملقط غرامة، وتعطيل بلطف صفار وإزالة خلايا صفار من خلال كشط خفيف من الحويصلات صفار.نقل الأجنة deyolked إلى إعداد حديثا 30٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، مع التأكد من وضع الأجنة على رأس الحل ونقل أقل قدر ممكن من الحل السابق والانتظار للأجنة لتغرق إلى أسفل الأنبوب. عندما وصلت الأجنة إلى قاع الحاوية، نقلها إلى 50٪ و 70٪ من الجلسرين في حلول PBS، كما هو موضح للتو. بعد أن غرقت الأجنة إلى الجزء السفلي من حاوية الجلسرين 70٪، نقل العينات إلى طبق بلاستيكي صغير للتشريح وقطع الأجنة الخلفية إلى الهيمين.باستخدام أدوات تشريح غرامة، تحرك رأس واحد إلى شريحة زجاجية مع أقل القليل من الجلسرين قدر الإمكان وإدراج بلطف دبوس minutien غرامة في البطين من الداخل، ودفع إلى الأسفل لفصل اليمين واليسار نصفي الرأس من بعضها البعض. عندما يكون الرأس قد تم فيليه تماما أسفل خط الوسط، جبل كل جانب من خط منتصف الرأس إلى أسفل، العين الجانب لأعلى. يمكن ملاحظة SOS من خلال المجهر التشريحي في فترة 20 إلى 23 ساعة بعد الإخصاب وعبر التصوير بالتباين بالتداخل التفاضلي كخط رفيع في العين الظهرية الذي يفصل بين النصفين الأنفي والزمني للشبكية النامية.بالإضافة إلى ذلك، قد تكون المسافة البادئة خفية مرئية في الحدود الظهرية للعين. بعد تلطيخ المثبط المناعي لللامينين ، يمكن تأكيد الخط الرفيع كغشاء الطابق السفلي. عندما يتأخر إغلاق SOS ، يمكن ملاحظة وجودها لفترة طويلة على أنه شق واضح في الجانب الظهري للعين تحت مجهر تشريح.عندما لوحظ تحت مجهر مركب باستخدام التصوير التباين التداخل التفاضلي، هذه الميزة هي أكثر بروزا مع الجانبين الأنف والزماني للعين مفصولة من قبل SOS، والتي هي واضحة للعيان كخط في العين الظهرية. قبل 28 ساعة بعد الإخصاب في أسماك الحمار الوحشي ذات النمط البري ، يوضح تلطيخ اللامينين بوضوح أن SOS مغلق تمامًا ، مما يجعل هذه المرحلة مثالية لرصد التأخير في إغلاق الشق. حقن تعزيز GFP-CAX مرنا يسمح التصور من أغشية الخلية من الجنين على قيد الحياة أو ثابتة لتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلايا التي تؤدي إلى إغلاق SOS.يمكن أن يكون تصور SOS صعبًا ، لأنه ضيق وعابر. ومع ذلك، فمن الضروري أن تحافظ على أسلوب تسجيل نقاط متناسقة عند تقييم تأخيرات الإغلاق في نقاط زمنية لاحقة. ويمكن الجمع بين هذه التقنيات وبين عمليات التلاعب التجريبية لتحديد العوامل الوراثية أو العوامل الدوائية التي تؤثر على تكوين والإغلاق السليمين.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...