Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
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这项工作得到了加拿大卫生研究所、自然科学和工程研究理事会、艾伯塔省创新技术未来和妇女和儿童健康研究所的支持。

这里描述的所有方法都得到了阿尔伯塔大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 议定书 1: 使用立体显微镜和差分干涉对比成像显示 SOS
<ol><li>胚胎采集<ol>
<li>在一罐无氯水中, 在晚上将雄性斑马鱼与雌性斑马鱼配对, 准备好gdf6a+/ 斑马鱼的十字架。一定要使用分隔器将雄性和雌性分开, 以确保胚胎在很短的时间内出生。</li>
		<li>第二天早上, 拉起分隔线, 让斑马鱼?...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. 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B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

在这里, 我们提出了一系列标准化的方案, 以观察 sos 在发展斑马鱼胚胎。为了确定闭合延迟表型, 我们的协议侧重于区分眼睛背鼻和背时间两侧两个离散裂片的分离能力, 类似于用于显示脉络膜裂隙闭合延迟的技术腹侧眼的表型。
这些可视化技术可与各种基因操作技术结合使用, 以研究抑制某些基因表达或诱导表达的影响, 从而研究它们在 SOS 闭合中的作用。我们选择使用gdf...

脊椎动物眼的形成是一个高度保守的过程, 在这个过程中, 精心编排的细胞间信号通路建立组织类型, 并指定区域身份1。早期眼睛形态发生的扰动导致眼睛结构的深刻缺陷, 并经常致盲2。其中一种疾病是由于未能关闭视神经杯3腹侧的脉络膜眼裂隙造成的。这种被称为眼结肠瘤的疾病, 估计发生在每4-5000个活产中的 1个, 并导致3-11 的儿科失明, 通常表现为一个关键孔状结构,从眼睛中心的瞳孔下突出, 5,6。脉络膜裂隙的功能是为早期血管生长到光学杯中提供一个切入点, 之后裂隙的两侧将融合在血管7中.
虽然眼结节瘤自古以来就被人们所熟知, 但我们最近发现了一个新的结肠瘤患者的组织丢失的子集, 这些患者的组织丢失影响了眼睛的上背部。最近在我们的实验室的工作已经导致发现的眼睛结构斑马鱼背眼, 我们称之为上眼沟 (SOS) 或上裂隙8。需要注意的是, 该结构既有沟的特点, 也有裂缝的特点。类似于沟, 它是一个连续的组织层, 跨越鼻腔到颞部视网膜。此外, 结构的闭合不是由两个相对基底膜的融合介导的, 它似乎需要一个形态发生过程, 通过这个过程, 结构是由细胞填充的。然而, 类似于裂缝, 它形成了一个结构, 分离鼻腔和时间两侧的背眼与基底膜。为了保持一致, 我们将在本文中将其称为 SOS。
SOS 在进化上在脊椎动物中被保守, 在鱼类、小鸡、牛顿和小鼠8的眼睛形态发生过程中可见。与斑马鱼受精后20-60小时的脉络膜裂隙不同, SOS 是高度瞬态的, 从 20-60 hpf 很容易看到, 而在 26 hpf8时不存在。我们实验室最近的研究发现, 与脉络膜裂隙类似, sos 在眼睛形态发生过程中的血管引导中起着一定的作用。尽管控制 SOS 形成和闭合的因素尚未完全了解, 但我们的数据确实突出了背腹眼模式基因8的作用。
斑马鱼是研究 SOS 的优良模型生物。作为一个模型系统, 它为研究眼睛发育提供了许多优势: 它是一个脊椎动物模型;每一代表现出较高的繁殖力 (~ 200个胚胎);它的基因组已被完全测序, 这有利于基因操纵;约70% 的人类基因至少有一种斑马鱼的同源物, 使其成为人类疾病9,10 的理想基因模型。最重要的是, 它的发育发生在母亲的外部, 它的幼虫是透明的, 这使得它可以相对容易地显示发育中的眼睛11。
在这一组协议中, 我们描述了在斑马鱼幼虫中可视化 SOS 的技术。本报告中使用的各种可视化技术将使人们能够在正常的眼睛发育过程中清楚地观察 SOS, 并能够检测 SOS 闭合缺陷。我们的示例协议将以 Gdf6 的调查为特色, BMP 本地化为背眼和已知的 SOS 闭合调节器。此外, 这些技术可以与实验操作相结合, 以确定影响适当的 SOS 形成和关闭的遗传因素或药理作用剂。此外, 我们还包括了一个协议, 通过该协议可以对所有细胞膜进行荧光成像, 使实验者能够观察 SOS 周围细胞的形态变化。我们的目标是建立一套标准化的协议, 可以在整个科学界使用, 为这种新的发展眼结构提供新的见解。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

先天性眼结肠瘤是一种遗传性疾病, 通常被观察为眼睛下部的裂隙, 其原因是不完全的脉络膜裂隙闭合。最近, 在虹膜、视网膜和晶状体的上侧识别有结肠瘤的个体, 发现了一种新的结构, 称为上裂隙或上眼沟 (SOS), 这种结构是暂时存在于背侧的在脊椎动物眼睛发育过程中的视杯方面。虽然这种结构是在小鼠、小鸡、鱼和纽特之间保存的, 但我们目前对 SOS 的理解是有限的。为了阐明有助于其形成和关闭的因素, 必须能够观察到它, 并查明异常情况, 例如在关闭 SOS 方面的延误。在这里, 我们着手创建一系列标准化的协议, 可用于通过将广泛使用的显微镜技术与免疫荧光染色和 mRNA 等常见的分子生物学技术相结合, 有效地可视化 SOS表达。虽然这一组协议侧重于观察 sos 闭包延迟的能力, 但它能适应实验者的需要, 可以很容易地修改。总的来说, 我们希望创造一种平易近人的方法, 通过这种方法, 我们可以提高对 sos 的理解, 以扩大目前对脊椎动物眼睛发育的了解。

斑马鱼 sos 出现在 20 hpf在推定的背侧视网膜8。由 23 hpf sos 从它的最初的狭窄的建筑学转换到一个宽广的缩进和由 26 hpf 它不再是可看见的 8。因此, 要检查正常斑马鱼眼睛发育过程中的 SOS, 必须在 20-23 hpf 之间观察胚胎。在此期间, 通过解剖显微镜和 DIC 成像可以观察到 sos, 它是将发育中视网膜的鼻腔和颞半分开的背眼的一条细线 (<strong cl...

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Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

达尼奥胚胎发生过程中的上眼硫可视化

在这里, 我们提出了一系列标准化的协议, 以观察上眼沟, 最近确定的, 进化保存的结构在脊椎动物的眼睛。利用斑马鱼幼虫, 我们展示了必要的技术, 以确定有助于形成和关闭的上眼沟的因素。

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

这组标准化协议可用于提供对高级眼动管（SOS）的新见解，这是最近发现的发育眼结构。这些协议将允许世界各地的任何实验者在斑马鱼眼发育期间清楚地可视化 SOS。首先将异质生长分化因子六 A 雄性斑马和雌性斑马鱼放在分温器的单独两侧，在配对前一天晚上放入一罐去氯水中。第二天早上，去除分压器，让鱼繁殖不超过30分钟。在育种期结束时，将胚胎收集到含有E3培养的培养皿中，在28.5度培养箱中孵化。在受精后20小时，用E3介质补充0.004%1-苯基-2-硫化液代替上清液，以防止色素产生，并通过光显微镜检查胚胎，以确认它们都处于适当的发育阶段。将样品放在解剖显微镜下。丢弃任何发育不成熟的胚胎，并使用细钳子轻轻拉开胆小子。可视化 SOS，该 SOS 可能显示为眼部边缘处的缩进或线。然后，对显示 SOS 关闭延迟的胚胎进行排序，以表示未关闭的胚胎。要使用解剖显微镜拍摄这些胚胎，请准备一个在E3介质中含有1%agarose的培养皿，轻轻刺破黄糖的中心，形成一个浅孔，将胚胎的蛋黄放入其中。然后，将麻醉胚胎横向放在阿加罗斯上。要使用化合物或共体显微镜对胚胎进行成像，请将胚胎移植到35毫米培养皿中，其中含有一小块非凝胶1%的低熔点阿加罗斯，然后使用细钓鱼线快速将胚胎置于横向位置。当加糖冷却后，倒入足够的E3介质，以覆盖加糖，并使用20倍水浸式客观透镜可视化SS。成像后，轻轻地从胚胎中拉出甲糖，将组织固定在4%的甲醛中，或让斑马鱼继续发育。要通过荧光mRNA表达来可视化SS，使用微注射装置在单细胞阶段将300个增强性GFP-CAX mRNA图的象形图注入胚胎。然后，使用荧光立体镜对具有明亮增强型GP表达的胚胎进行筛查，并采用一种成像方法获取胚胎图像，如所证明的。对于胚胎斑马鱼层胺的全安装免疫荧光染色，将胚胎如证明的去功能化，并在新鲜准备的4%对蛋白二甲醛的微离状管中将胚胎修复两个小时。室温摇动器上。在固定结束时，在PBS加Tween或PBST中清洗胚胎四次，每次洗涤5分钟，然后以每毫升10微克或每毫升10微克的蛋白质酶K进行渗透5分钟。如证明，在PBST中四次清洗渗透胚胎，并在PBST中每毫升牛血清白蛋白中用5%的山羊血清和两毫克的胚胎清洗一到两个小时。在阻断孵育结束时，在摇床上一夜之间在四摄氏度的原发性抗层压素抗体中孵育胚胎。第二天早上，每次洗涤在PBST中洗胚5次，洗涤15分钟，并在防光摇床上用适当的二级抗体在4摄氏度下过夜地给组织贴上适当的二级抗体标签。第二天早上，在PBST中清洗胚胎四次，每次洗涤15分钟，将胚胎放在含有新鲜PBST的小培养皿中。使用精细钳子，轻轻扰乱蛋黄，并通过蛋黄囊的轻微刮擦去除蛋黄细胞。将脱卵胚胎转移到PBS中新鲜准备的30%甘油中，确保将胚胎放在溶液顶部，并尽可能少地转移先前的溶液，等待胚胎沉入管底。当胚胎到达容器底部时，在PBS溶液中将它们转移到连续的50%和70%甘油，正如刚刚证明的。胚胎沉入70%甘油容器底部后，将样品转移到一个小塑料盘中进行解剖，然后将胚胎后脑分离至后脑。使用精细的解剖工具，用尽可能少的甘油将一个头移动到玻璃滑梯上，然后从内部轻轻地将细小针插入前脑心室，向下推，将头部的左右两半彼此分开。当头部完全从中线向下角角时，将头部中线的每一侧向下安装，眼睛侧向上。SOS在受精后20至23小时通过解剖显微镜观察，并通过差分干扰对比度成像，作为后眼的细线，将发育中的视网膜的鼻腔和时间部分分部。此外，在眼睛的后界中可能可以看到细微的缩进。继层压素的免疫荧光染色后，细线可被确认为基膜。当 SOS 闭合延迟时，在解剖显微镜下，可以观察到其长时间存在，如眼部侧有明显的裂痕。当使用差分干涉对比度成像在复合显微镜下观察时，这一特征在由 SOS 分隔的眼睛的鼻侧和时间侧时更加突出，在后眼中，该线清晰可见。在野生型斑马鱼受精后28小时，层压染色清楚地表明，SOS已完全关闭，使其成为监测裂变闭合延迟的理想阶段。增强型 GFP-CAX mRNA 的注入允许活体或固定胚胎的细胞膜可视化，以跟踪导致 SOS 闭合的细胞形态的变化。可视化 SOS 可能很困难，因为它很窄且瞬态。但是，在评估以后时间点的闭合延迟时，必须保持一致的评分方法。这些技术可以与实验操作相结合，用于识别影响正确 SOS 形成和闭合的遗传因素或药理剂。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

从诱导多能干得出视网膜色素上皮（RPE）（IPS），由胚体大小不同的细胞

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

科研

发育生物学

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

产妇血管重构的评估在怀孕期间在小鼠子宫

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

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人类骨髓微环境在小鼠中的生物工程及其通过实时成像的可视化

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A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

斑马鱼胚胎卵黄细胞中的 AFM 和 Microrheology

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发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化

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Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

评估原小鼠眼部表面细胞/干细胞对紫外线-C （UV-C） 损伤的反应

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