Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), natuurwetenschappen en techniek onderzoek Raad (NSERC), Alberta innoveert technologie Futures, en vrouwen en Children's Health Research Institute (WCHRI).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn door de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.
1. protocol 1: Visualisatie van SOS met behulp van stereomicroscopy en differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming
<ol><li>Embryo's worden verzameld<ol>
<li>Bereiden in een tank van dechlorinated water, kruisen van gdf6a+/- zebrafish in de avond door het koppelen van een mannelijke zebrafish met een vrouwelijke zebravissen. Zorg ervoor d...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+coloboma:+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience.">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li><li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+colobomata.">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li><li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+microphthalmia,+anophthalmia+and+coloboma.">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li><li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+coloboma:+clinical+and+basic+science+update.">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li><li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature.">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li><li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma,+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye.">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de SOS in het zich ontwikkelende embryo zebrafish. Om te bepalen sluiting vertraging fenotypen, hebben onze protocollen gericht op de mogelijkheid om te onderscheiden van de scheiding van twee discrete kwabben van de dorsale-nasale en dorsale-temporele zijden van het oog, vergelijkbaar met de technieken die worden gebruikt om te visualiseren choroideus horizontalis sluiting vertraging fenotypen in het ventrale oog.
<p class="jove_cont...

De vorming van de gewervelde oog is een zeer geconserveerde proces waarin zorgvuldig georkestreerde intercellulaire signaalroutes stellen weefseltypes (HLA) en regionale identiteit1opgeven. Verstoringen te vroege oog morfogenese resulteren in ernstige gebreken aan de architectuur van het oog en zijn vaak verblindende2. Een dergelijke ziekte het gevolg van het niet sluiten van de choroideus oogbeschadigingen en/of horizontalis in de ventrale zijde van de optische kop3. Deze aandoening, bekend als oogbeschadigingen en/of coloboma, is naar schatting voorkomen bij 1 op de 4-5000 levendgeborenen en oorzaak 3-11% van de pediatrische blindheid, vaak manifesteert als een sleutelgat-achtige structuur die ondeugdelijkheid van de leerling in het midden van de oog-4uitsteekt, 5,6. De functie van de choroideus horizontalis is bedoeld als een ingangspunt voor vroege therapieën groeien in de optiek beker, waarna de zijkanten van de horizontalis zal smelten om omsluiten de vaartuigen7.
Terwijl oogbeschadigingen en/of coloboma heeft gekend sinds de oudheid, hebben we onlangs geïdentificeerd een roman subset van coloboma patiënten met weefsel verlies beïnvloeden de superior/dorsale aspect van het oog. Recente werkzaamheden in ons lab heeft geleid tot de ontdekking van een oogbeschadigingen en/of structuur in de zebravis dorsale ogen, die wij de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS) of superieure horizontalis8 noemen. Het is belangrijk op te merken dat de structuur kenmerken van zowel een Sulcus (hersenanatomie) en een horizontalis heeft. Gelijkaardig aan een Sulcus (hersenanatomie), het is een voortdurende weefsel laag die van de nasale aan het temporele netvlies omvat. Bovendien, de sluiting van de structuur is niet gemedieerd door een fusie van de twee tegengestelde kelder membraan, en lijkt het een morfogenetische proces waarmee de structuur wordt bevolkt door cellen vereisen. Echter, vergelijkbaar met een horizontalis, vormt het een structuur die scheidt van de nasale en temporele zijkanten van het dorsale oog met het membraan van de kelder. Voor consistentie, zullen we in deze tekst verwijzen ernaar als de SOS.
De SOS is evolutionair bewaard over gewervelde dieren, wordt zichtbaar tijdens oog morfogenese in vis, kuiken, newt en muis8. In tegenstelling tot de choroideus horizontalis, die van 20-60 uur na bevruchting (hpf) in zebrafish aanwezig is, de SOS is zeer voorbijgaande aard, wezen van 20-23 hpf gemakkelijk zichtbaar en afwezig door 26 hpf8. Recent onderzoek in ons lab heeft gevonden dat, vergelijkbaar met de choroideus horizontalis, de SOS een rol in vasculaire begeleiding tijdens oog morfogenese8 speelt. Hoewel de factoren waarmee de vorming en de sluiting van de SOS nog niet volledig begrepen zijn, onze gegevens wijzen op rollen voor dorsal-ventrale oog genen8patronen.
Zebravis is een uitstekende modelorganisme te bestuderen van de SOS. Als een modelsysteem, het biedt een aantal voordelen bij het bestuderen van de ontwikkeling van het oog: het is een gewervelde model; elke generatie vertoont hoge vruchtbaarheid (~ 200 embryo's); de genoom heeft zijn gesequenced, die vergemakkelijkt genetische manipulatie; en ongeveer 70% van de menselijke genen hebben ten minste één zebrafish orthologue, waardoor het een ideale genetica gebaseerde model van ziekten bij de mens9,10. Bovenal zijn ontwikkeling plaatsvindt extern aan de moeder en haar larven zijn transparant, waardoor voor de visualisatie van het derde oog met relatief gemak11.
In deze set van protocollen beschrijven we de technieken waarmee de SOS kan worden gevisualiseerd in zebrafish larven. De verscheidenheid van visualisatietechnieken gebruikt in dit verslag kan duidelijk observatie van de SOS tijdens normaal oog ontwikkeling, alsmede de mogelijkheid om te detecteren SOS sluiting gebreken. Onze voorbeeld-protocollen zal onderzoeken van Gdf6 functie, een BMP gelokaliseerd op de dorsale oog en bekende regulator van SOS sluiting. Verder kunnen deze technieken worden gecombineerd met experimentele manipulaties om genetische factoren of farmacologische agenten die goede SOS vorming en sluiting beïnvloeden te identificeren. Daarnaast hebben wij een protocol waardoor de fluorescerende beeldvorming van alle celmembranen is mogelijk opgenomen waardoor de experimentator te observeren morfologische veranderingen aan de cellen rondom de SOS. Ons doel is om een verzameling gestandaardiseerde protocollen die kunnen worden gebruikt in de gehele wetenschappelijke gemeenschap te bieden van nieuwe inzichten in deze nieuwe structuur van het derde oog.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Aangeboren oogbeschadigingen en/of coloboma is een genetische aandoening die wordt meestal waargenomen als een gespleten in het inferieur aspect van het oog die voortvloeien uit onvolledige choroideus horizontalis sluiting. Onlangs, de identificatie van personen met coloboma in het superieure aspect van de iris, het netvlies, en de lens leidde tot de ontdekking van een nieuwe structuur, hierna aangeduid als de superieure horizontalis of superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS), die op de dorsale Transient aanwezig is aspect van de optiek cup tijdens de ontwikkeling van de gewervelde oog. Hoewel deze structuur is behouden over muizen, kuiken, vis en newt, is ons huidige begrip van de SOS beperkt. Om het verhelderen van factoren die aan de vorming en de sluiting bijdragen, is het absoluut noodzakelijk te kunnen observeren en identificeren van afwijkingen, zoals vertraging bij de sluiting van de SOS. Hier, uiteengezet we om een gestandaardiseerde reeks van protocollen die kan worden gebruikt voor het efficiënt visualiseren de SOS door het combineren van verkrijgbaar microscopie technieken met gemeenschappelijke moleculaire biologietechnieken zoals immunefluorescentie kleuring en mRNA te maken overexpressie. Terwijl deze set van protocollen richt zich op de mogelijkheid om te observeren SOS sluiting vertraging, is het aan te passen aan de behoeften van de experimentator en kan eenvoudig worden aangepast. Over het geheel genomen, wij hopen te maken van een toegankelijke methode waardoor ons begrip van de SOS kan worden gevorderd om uit te breiden van de huidige kennis van de ontwikkeling van de gewervelde oog.

De zebravis SOS verschijnt op 20 hpf in de vermoedelijke dorsale netvlies8. Door 23 hpf de SOS overgang van de eerste smalle architectuur naar een breed inspringing en 26 hpf het is niet langer zichtbaar8. Daarom moeten de embryo's te onderzoeken de SOS tijdens de ontwikkeling van de ogen van de normale zebrafish, in acht te worden genomen tussen hpf 20-23. Tijdens deze periode is de SOS waarneembare via de ontleden Microscoop en DIC imaging...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualisatie van de Superior oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) tijdens Danio rerio embryogenese

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie), een onlangs geïdentificeerd, evolutionair geconserveerd structuur in de gewervelde ogen. Met behulp van zebravis larven, aantonen we technieken die nodig zijn ter specificatie van de factoren die aan de vorming en de sluiting van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie bijdragen).

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Deze set standaardiseert protocollen kan worden gebruikt om nieuw inzicht te bieden in de superieure oculaire sulcus, of SOS, een onlangs ontdekte structuur van het ontwikkelende oog. Deze protocollen zullen elke experimentator over de hele wereld in staat stellen om de SOS duidelijk te visualiseren tijdens de ontwikkeling van zebravissenoogontwikkeling. Begin met het plaatsen van heterozygootlijke groei differentiatie factor zes Een mannelijke en vrouwelijke zebravis op afzonderlijke zijden van een scheidingswand in een tank van gedechloreerd water de avond voor hun koppeling.De volgende ochtend, verwijder de verdeler en laat de vis te broeden voor niet meer dan 30 minuten. Verzamel aan het einde van de broedperiode de embryo's in petrischaaltjes met E3-medium voor hun incubatie in een couveuse van 28,5 graden. Vervang na 20 uur na de bevruchting het supernatant door E3-medium aangevuld met 0,004%1-Fenyl-2-thiourea om de productie van pigment te voorkomen en de embryo's te onderzoeken door lichte microscopie om te bevestigen dat ze zich allemaal in het juiste ontwikkelingsstadium bevinden.Leg de monsters onder een ontledenmicroscoop. Gooi alle ontwikkelingsrijpe embryo's weg en gebruik fijne tangen om de chorions voorzichtig uit elkaar te trekken. Visualiseer de SOS, die kan worden weergegeven als een inkeping of lijn aan de dorsale rand van het oog.Sorteer vervolgens de embryo's die sos-sluitingsvertraging laten zien van degenen die dat niet doen. Om deze embryo's te fotograferen met behulp van een ontledenmicroscoop, bereidt u een petrischaaltje met 1%agarose in E3-medium en prik het midden van de agarose lichtjes in om een ondiep gat te creëren waarin de dooier van het embryo kan worden geplaatst. Plaats vervolgens een verdoofd embryo lateraal op de agarose.Om de embryo's met behulp van een verbinding of confocale microscoop in beeld te brengen, breng je een embryo over in een petrischaaltje van 35 millimeter met een kleine bolus van niet-gelled 1%laag smeltpunt in E3-medium en gebruik je fijne vislijn om het embryo snel in de zijdelingse positie te plaatsen. Wanneer de agarose is afgekoeld, giet genoeg E3 medium in de schotel om de agarose te dekken en gebruik een 20x water onderdompeling objectieve lens om de SOS visualiseren. Trek na beeldvorming voorzichtig de agarose uit het embryo en bevestig het weefsel in 4% paraformaldehyde of laat de zebravis zijn ontwikkeling voortzetten.Om de SOS te visualiseren door fluorescerende mRNA-expressie, gebruikt u een micro-injectieapparaat om 300 picogrammen van verbeterde GFP-CAX mRNA in embryo's te injecteren in het stadium met één cel. Gebruik vervolgens een fluorescerende stereoscoop om te screenen op embryo's met een heldere verbeterde GFP-expressie en verkrijg beelden van de embryo's door een van de beeldvormende methoden zoals aangetoond. Voor het geheel monteren van immunofluorescente kleuring van embryonale zebravis laminine, dechorioneren de embryo's zoals aangetoond en bevestig de embryo's in een microcentrifuge buis in vers bereide 4%paraformaldehyde gedurende twee uur op een kamertemperatuur shaker.Aan het einde van de fixatie, was de embryo's vier keer in PBS plus Tween, of PBST, gedurende vijf minuten per wasbeurt, gevolgd door permeabilisatie in 10 microgram per milliliter of Proteinase K bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Was de permeabiliseerde embryo's vier keer in PBST zoals aangetoond en blokkeer de embryo's in 5% geitenserum en twee milligram per milliliter runderserum albumine in PBST gedurende één tot twee uur op een kamertemperatuurshaker. Aan het einde van de blokkerende incubatie, incubeer de embryo's in de primaire anti-laminine antilichaam van belang op vier graden Celsius 's nachts op een shaker.De volgende ochtend, was de embryo's vijf keer in PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt en etiket de weefsels met een geschikte secundaire antilichaam 's nachts op vier graden Celsius op de shaker beschermd tegen licht. De volgende ochtend was je de embryo's vier keer in PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt en leg je de embryo's in een kleine petrischaal met verse PBST. Met behulp van fijne tangen, voorzichtig verstoren de dooiers en verwijder de dooier cellen door middel van milde schrapen van de dooier zakjes.Breng de deyolked embryo's over in vers bereide 30%glycerol in PBS, zorg ervoor dat de embryo's bovenop de oplossing worden geplaatst en breng zo weinig mogelijk van de vorige oplossing over en wacht tot de embryo's naar de bodem van de buis zinken. Wanneer de embryo's de bodem van de container hebben bereikt, breng ze over op sequentiële 50% en 70%glycerol in PBS-oplossingen, zoals zojuist is aangetoond. Nadat de embryo's zijn gezonken naar de bodem van de 70%glycerol container, breng de monsters naar een kleine plastic schotel voor dissecties en verbreken de embryo's achterste naar de hindbrains.Met behulp van fijne dissectie tools, beweeg een hoofd naar een glazen glijbaan met zo weinig glycerol mogelijk en voorzichtig steek een fijne gehaktspeld pin in de voorhersenen ventrikel van het interieur, naar beneden duwen om de rechter en linker helften van het hoofd van elkaar te scheiden. Wanneer het hoofd volledig is gefileerd in de middellijn, monteer elke kant van het hoofd middellijn naar beneden, eye-side omhoog. De SOS is waarneembaar door de ontledenmicroscoop bij 20 tot 23 uur na de bevruchting en via differentiële interferentie contrastbeeldvorming als een dunne lijn in het rugoog die de neus- en temporele helften van het zich ontwikkelende netvlies scheidt.Bovendien kan een subtiele inkeping zichtbaar zijn in de ruggrens van het oog. Na de immunofluorescente kleuring van laminine kan de dunne lijn worden bevestigd als het keldermembraan. Wanneer SOS-sluiting wordt uitgesteld, kan de langdurige aanwezigheid ervan worden waargenomen als een uitgesproken spleet in de rugzijde van het oog onder een ontledende microscoop.Wanneer waargenomen onder een samengestelde microscoop met behulp van differentiële interferentie contrast beeldvorming, deze functie is nog prominenter met de nasale en tijdelijke zijden van het oog gescheiden door de SOS, die duidelijk zichtbaar is als een lijn in het rugoog. Tegen 28 uur na de bevruchting bij wildtype zebravissen toont de lamininevlekken duidelijk aan dat de SOS volledig gesloten is, waardoor dit de ideale fase is voor het monitoren van vertragingen bij de sluiting van de spleet. De injectie van verbeterde GFP-CAX mRNA maakt de visualisatie van de celmembranen van levend of vast embryo mogelijk voor het bijhouden van veranderingen in de morfologie van de cellen die leiden tot SOS-sluiting.Het visualiseren van de SOS kan moeilijk zijn, omdat het smal en van voorbijgaand is. Het is echter noodzakelijk dat u een consistente scoringsmethode handhaaft bij het evalueren van afsluitingsvertragingen op latere punten. Deze technieken kunnen worden gecombineerd met experimentele manipulaties voor het identificeren van genetische factoren of farmacologische agentia die de juiste SOS-vorming en -sluiting beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...