Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC), Alberta innoviert Technologie Futures, und Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Alberta Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Protokoll 1: Visualisierung von SOS Stereomikroskopie mit differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung
<ol><li>Embryo-Sammlung<ol>
<li>Bereiten Sie in einem Tank ungechlortem Wasser Kreuze gdf6a+ / Zebrafisch am Abend durch die Kombination einer männlichen Zebrafisch mit einem weiblichen Zebrafisch. Achten Sie darauf, das Weibchen das Männchen trennen,...

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Hier präsentieren wir Ihnen eine standardisierte Reihe von Protokollen, die SOS im sich entwickelnden Zebrafischembryo zu beobachten. Ermitteln, Schließung Verzögerung Phänotypen, konzentrierten sich unsere Protokolle auf die Fähigkeit, die Trennung von zwei diskreten Lappen der dorsalen Nasal und dorsal-zeitliche Seiten des Auges, vergleichbar mit Techniken zur Aderhaut Fissur Verschluss Verzögerung visualisieren unterscheiden in den Augen der ventralen Phänotypen.
Diese Visualisierung...

Die Bildung des vertebrate Auges ist ein hoch konservierte Prozess in dem sorgfältig orchestrierten interzelluläre Signalwege Gewebetypen zu etablieren und regionale Identität1angeben. Störungen zu frühen Auge Morphogenese häufig2Blenden und tiefgreifende Mängel an die Architektur des Auges führen. Einer solchen Krankheit ergibt sich aus der Nichtbeachtung der Aderhaut okulären Riss in der ventralen Seite des Optik-Cup3schließen. Diese Störung, bekannt als okulären Kolobom wird voraussichtlich auftreten bei 1 von 4-5000 Lebendgeburten und Ursache 3-11 % der pädiatrischen Blindheit, gemeinhin als ein Schlüsselloch-artige Struktur, die inferior aus der Pupille in der Mitte des Auges4ragt manifestieren, 5,6. Die Funktion der Aderhaut Fissur soll stellen einen Einstiegspunkt für frühen Gefäßsystem Hineinwachsen in den Optik-Cup, danach werden die Seiten des Risses Sicherung um die Schiffe7umschließen.
Während okulären Kolobom seit der Antike bekannt ist, haben wir vor kurzem eine neue Untergruppe von Kolobom Patienten mit Gewebeverlust beeinflussen den Superior/dorsalen Aspekt des Auges identifiziert. Neuere Arbeiten in unserem Labor führte zur Entdeckung einer okulären Struktur im Zebrafisch dorsalen Auge, die wir als die überlegene okuläre Sulcus (SOS) oder überlegene Fissur8bezeichnen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Struktur verfügt über Eigenschaften von einem Sulcus und ein Riss. Ähnlich wie bei einem Sulcus, ist es eine ständige Gewebeschicht, die sich aus der Nasal der zeitlichen Netzhaut erstreckt. Darüber hinaus die Schließung der Struktur wird nicht durch eine Fusion der beiden gegnerischen Basalmembran vermittelt, und es scheint einen morphogenetischen Prozess zu verlangen, mit dem die Struktur von Zellen besiedelt ist. Jedoch ähnlich wie ein Riss, bildet es eine Struktur, die die nasalen und temporalen Seiten des dorsalen Auges mit der Basalmembran trennt. Aus Konsistenzgründen werden wir bezeichnen es als SOS in diesem Text.
Die SOS ist evolutionär über Wirbeltiere, wobei sichtbar, während Auge Morphogenese in Fische, Küken, Molch und Maus8erhalten. Im Gegensatz zu der Aderhaut Fissur, die von 20 bis 60 Stunden nach Befruchtung (hpf) im Zebrafisch vorhanden ist, die SOS ist sehr flüchtig, wird gut sichtbar von 20-23 hpf und abwesend von 26 hpf-8. Neuere Forschungen in unserem Labor hat festgestellt, dass ähnlich wie bei der Aderhaut Fissur, die SOS eine Rolle bei vaskulären Führung während Auge Morphogenese8 spielt. Obwohl die Faktoren, die die Gründung und Schließung der SOS noch nicht vollständig verstanden sind, unsere Daten für dorsal-Ventral Auge Musterung Gene8Rollen markieren.
Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Modellorganismus der SOS zu studieren. Als Modellsystem, bietet es eine Reihe von Vorteilen bei der Untersuchung der Augenentwicklung: Es ist ein Wirbeltier Modell; Jede Generation weist hohe Fruchtbarkeit (~ 200 Embryonen); seines Genoms wurde vollständig sequenziert, erleichtert die Genmanipulation; und etwa 70 % der menschlichen Gene haben mindestens ein Zebrafisch orthologs, so dass es ein ideales Genetik-basierte Modell der menschlichen Krankheit9,10. Vor allem seine Entwicklung erfolgt extern an die Mutter, und seine Larven sind transparent, wodurch für die Visualisierung des dritten Auges mit relativer Leichtigkeit11.
In dieser Reihe von Protokollen beschreiben wir die Techniken, durch die die SOS im Zebrafischlarven visualisiert werden kann. Die Vielfalt der Visualisierungs-Techniken, die in diesem Bericht verwendeten ermöglicht klare Beobachtung von SOS während der normalen Augenentwicklung sowie die Fähigkeit, SOS Schließung Mängel zu erkennen. Unsere Beispiel-Protokolle werden Untersuchungen von Gdf6, einem BMP in dorsal lokalisiert Auge und bekannten Regulator der SOS-Verschluss. Darüber hinaus können diese Techniken mit experimentellen Manipulationen zu identifizieren genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe, die richtige SOS-Gründung und Schließung beeinflussen kombiniert werden. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll durch die fluoreszente-Bildgebung aller Zellmembranen möglich ist, so dass des Experimentators, morphologische Veränderungen an den Zellen rund um den SOS zu beobachten aufgenommen. Unser Ziel ist es, eine Reihe von standardisierten Protokollen zu etablieren, die in der wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet werden können, bieten neue Einblicke in diese neuartige Struktur des dritten Auges.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Angeborene okulären Kolobom ist eine genetische Erkrankung, die in der Regel als eine Spalte in der minderwertigen Aspekt des Auges infolge unvollständiger choroid Fissur Schließung beobachtet wird. Vor kurzem genannt die Identifikation von Personen mit Kolobom in der überlegene Aspekt der Iris, Netzhaut und Linse führte zur Entdeckung einer neuen Struktur, die überlegene Fissur oder überlegene okuläre Sulcus (SOS), die vorübergehend auf die dorsale vorhanden ist Aspekt der Optik-Cup während der vertebrate Augenentwicklung. Obwohl diese Struktur über Mäuse, Küken, Fisch und Newt konserviert ist, beschränkt sich unser heutiges Verständnis des SOS. Um Faktoren aufzuklären, die zu seiner Entstehung und Schließung beitragen, ist es unerlässlich, dass man es beobachten und erkennen Anomalien, wie Verzögerung bei der Schließung der SOS. Hier wollten wir eine standardisierte Reihe Protokolle erstellen, die verwendet werden, um effizient die SOS visualisieren durch die Kombination von allgemein verfügbaren Mikroskopiertechniken mit gemeinsamen molekularbiologische Techniken wie immunofluorescent Färbung und mRNA Überexpression. Während dieser Reihe von Protokollen konzentriert sich auf die Fähigkeit, SOS Verschluss Verzögerung zu beobachten, es ist anpassbar an die Bedürfnisse der Experimentator und kann leicht geändert werden. Alles in allem hoffen wir, eine zugängliche Methode zu erstellen, durch die unser Verständnis von der SOS vorangebracht werden kann, um das aktuelle Wissen der vertebrate Augenentwicklung zu erweitern.

Der Zebrabärbling SOS erscheint um 20 Uhr hpf in der mutmaßlichen dorsalen Netzhaut-8. Von 23 hpf SOS Übergänge von seiner ursprünglichen engen Architektur auf einen breiten Einzug und 26 hpf-es ist nicht mehr sichtbar8. Daher, um die SOS während der normalen Zebrafisch Augenentwicklung zu untersuchen, die Embryonen zwischen 20-23 hpf einzuhalten. Während dieser Zeit ist die SOS zu beobachten, durch die sezierenden Mikroskop und mitte...

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Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Dieser Satz von standardisierten Protokollen kann verwendet werden, um neue Einblicke in den überlegenen Augensulkus (SOS), eine kürzlich entdeckte Struktur des sich entwickelnden Auges, zu bieten. Diese Protokolle ermöglichen es jedem Experimentator auf der ganzen Welt, das SOS während der Entwicklung von Zebrafischaugen klar zu visualisieren. Beginnen Sie, indem Sie heterozygote Wachstumsdifferenzierung Faktor sechs A männlichen und weiblichen Zebrafisch auf getrennten Seiten eines Teilers in einem Tank mit entchlorten Wasser am Abend vor ihrer Paarung.Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennwand und lassen Sie die Fische für nicht mehr als 30 Minuten züchten. Am Ende der Brutzeit sammeln Sie die Embryonen in Petrischalen mit E3-Medium für ihre Inkubation in einem 28,5-Grad-Inkubator. Nach 20 Stunden nach der Befruchtung den Überstand durch das E3-Medium ersetzen, das 0,004%1-Phenyl-2-thiourea ergänzt, um die Pigmentproduktion zu verhindern, und die Embryonen durch Lichtmikroskopie untersuchen, um zu bestätigen, dass sie sich alle in einem geeigneten Entwicklungsstadium befinden.Legen Sie die Proben unter ein Sezierendes Mikroskop. Entsorgen Sie alle entwicklungsunreifen Embryonen und verwenden Sie feine Zangen, um die Kränze sanft auseinander zu ziehen. Visualisieren Sie das SOS, das als Einzug oder Linie am dorsalen Rand des Auges erscheinen kann.Sortieren Sie dann die Embryonen, die SOS-Verschlussverzögerung zeigen, von denen, die dies nicht tun. Um diese Embryonen mit einem Seziermikroskop zu fotografieren, bereiten Sie eine Petrischale mit 1%Agarose in E3-Medium vor und stechen Sie leicht in die Mitte der Agarose, um ein flaches Loch zu schaffen, in das das Eigelb des Embryos gelegt werden kann. Dann legen Sie einen anästhesierten Embryo seitlich auf die Agarose.Um die Embryonen mit einem zusammengesetzten oder konfokalen Mikroskop abzubilden, übertragen Sie einen Embryo in eine 35-Millimeter-Petrischale, die einen kleinen Bolus aus nicht gegelter 1%niedriger Schmelzpunkt-Agarose enthält, in das E3-Medium und verwenden Sie eine feine Angelschnur, um den Embryo schnell in der seitlichen Position zu positionieren. Wenn die Agarose abgekühlt ist, gießen Sie genügend E3-Medium in die Schale, um die Agarose zu bedecken und verwenden Sie eine 20x Wasser-Immersion objektivLinse, um das SOS zu visualisieren. Ziehen Sie nach der Bildgebung die Agarose vorsichtig aus dem Embryo und fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd oder lassen Sie den Zebrafisch seine Entwicklung fortsetzen.Um das SOS durch fluoreszierende mRNA-Expression zu visualisieren, verwenden Sie ein Mikroinjektionsgerät, um 300 Piktogramme verbesserter GFP-CAX mRNA in Embryonen im Einzellstadium zu injizieren. Verwenden Sie dann ein fluoreszierendes Stereoskop, um Embryonen mit heller, verbesserter GFP-Expression zu überprüfen und Bilder der Embryonen durch eines der gezeigten bildgebenden Verfahren zu erhalten. Für die immunfluoreszierende Färbung von embryonalen Zebrafischen laminin, dechorinatieren Sie die Embryonen wie nachgewiesen und fixieren Sie die Embryonen in einem Mikrozentrifugenrohr in frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker.Am Ende der Fixierung die Embryonen viermal in PBS plus Tween oder PBST waschen, fünf Minuten pro Wäsche, gefolgt von Einer Durchlässigkeit in 10 Mikrogramm pro Milliliter oder Proteinase K bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Waschen Sie die permeabilisierten Embryonen viermal in PBST, wie gezeigt, und blockieren Sie die Embryonen in 5%Ziegenserum und zwei Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin in PBST für ein bis zwei Stunden auf einem Raumtemperatur-Shaker. Am Ende der blockierenden Inkubation die Embryonen in den primären Antilaminin-Antikörper von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker inkubieren.Am nächsten Morgen die Embryonen fünfmal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem lichtgeschützten Shaker mit einem geeigneten Sekundärantikörper kennzeichnen. Am nächsten Morgen die Embryonen viermal in PBST für 15 Minuten pro Wäsche waschen und die Embryonen in eine kleine Petrischale mit frischem PBST legen. Mit feinen Zangen, sanft stören die Dotter und entfernen Sie die Eigelbzellen durch mildes Abkratzen der Dottersäcke.Übertragen Sie die entyolkierten Embryonen in frisch zubereitetes 30%Glycerin in PBS, stellen Sie sicher, dass die Embryonen auf die Lösung gestellt werden, und übertragen Sie so wenig wie möglich von der vorherigen Lösung und warten Sie, bis die Embryonen auf den Boden des Rohres sinken. Wenn die Embryonen den Boden des Behälters erreicht haben, übertragen Sie sie in sequenzielle 50% und 70%Glycerin in PBS-Lösungen, wie gerade gezeigt. Nachdem die Embryonen auf den Boden des 70%-Glyzerinbehälters gesunken sind, übertragen Sie die Proben auf eine kleine Plastikschale für Sezieren und trennen Sie die Embryonen nach trägen zu den Hinterhirnen.Mit feinen Sezierwerkzeugen bewegen Sie einen Kopf auf eine Glasrutsche mit so wenig Glyzerin wie möglich und legen Sie vorsichtig einen feinen Minutienstift in die Vorhirnkammer vom Inneren ein, wobei Sie nach unten drücken, um die rechte und linke Kopfhälfte voneinander zu trennen. Wenn der Kopf vollständig auf der Mittellinie verfüllbar ist, montieren Sie jede Seite der Kopflinie nach unten, Augenseite nach oben. Das SOS ist durch das Sezieren des Mikroskops bei 20 bis 23 Stunden nach der Befruchtung und durch Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung als dünne Linie im dorsalen Auge zu beobachten, die die Nasen- und Diezeitliche Hälfte der sich entwickelnden Netzhaut trennt.Darüber hinaus kann ein subtiler Einzug in der dorsalen Grenze des Auges sichtbar sein. Nach der immunfluoreszenten Färbung von Laminin kann die dünne Linie als Kellermembran bestätigt werden. Wenn sich der SOS-Verschluss verzögert, kann seine längere Anwesenheit als ausgeprägte Spalte in der rückenden Seite des Auges unter einem Sezierendes Mikroskop beobachtet werden.Bei der Beobachtung unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit Differentialinterferenzkontrast-Bildgebung ist dieses Merkmal noch stärker ausgeprägt, wenn die Nasen- und Zeitseiten des Auges durch das SOS getrennt sind, das als Linie im dorsalen Auge deutlich sichtbar ist. Durch die 28-stündige Nachdüngung bei Wildtyp-Zebrafischen zeigt die Lamininfärbung deutlich, dass das SOS vollständig geschlossen ist, was dies zur idealen Bühne für die Überwachung von Verzögerungen bei der Schließung von Spalt. Die Injektion von verbesserter GFP-CAX mRNA ermöglicht die Visualisierung der Zellmembranen von lebenden oder festen Embryonen zur Verfolgung von Veränderungen in der Morphologie der Zellen, die zu einem SOS-Verschluss führen.Die Visualisierung des SOS kann schwierig sein, da es eng und vorübergehend ist. Es ist jedoch zwingend erforderlich, dass Sie bei der Bewertung von Schließungsverzögerungen zu späteren Zeitpunkten eine konsistente Bewertungsmethode beibehalten. Diese Techniken können mit experimentellen Manipulationen kombiniert werden, um genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, die die richtige SOS-Bildung und -Schließung beeinflussen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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