Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), אלברטה מתפתחת טכנולוגיה עתידיות, ונשים, מכון מחקר בריאות (WCHRI לילדים).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אלברטה חיה אכפת והוועדה שימוש.
1. פרוטוקול 1: ויזואליזציה של SOS באמצעות stereomicroscopy ודימות ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית
<ol><li>אוסף העובר<ol>
<li>בתוך מיכל מים dechlorinated, הכן חוצה של gdf6a+ /- דג זברה בשעות הערב על ידי זיווג דג ז?...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+coloboma:+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience.">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li><li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+colobomata.">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li><li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+microphthalmia,+anophthalmia+and+coloboma.">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li><li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+coloboma:+clinical+and+basic+science+update.">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li><li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature.">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li><li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma,+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye.">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן על המצוקה של העובר המתפתח דג זברה. כדי לקבוע פנוטיפים עיכוב הסגר, פרוטוקולים שלנו התמקדו היכולת להבחין בהפרדה בין שתי האונות דיסקרטית של הצד הגבי-אפיים ואת הגבי-טמפורלית של העין, דומה טכניקות השתמשו כדי להמחיש פיסורה דמית העין הסגר עיכוב...

היווצרות של העין חוליות הוא תהליך מאוד שנשמרת בו מתוזמר בקפידה איתות המסלולים המערכת לקבוע סוגי רקמות, ציין הזהות האזורית1. לפליטת עד תחילת מורפוגנזה עין לגרום פגמים מעמיקה הארכיטקטורה של העין, לעתים קרובות מסנוור2. מחלה אחד כזה נובע הכשל כדי לסגור את פיסורה עינית דמית העין בצד הגחוני של גביע אופטיים3. הפרעה זו, המכונה coloboma עינית, מעריכים כי ב- 1 מתוך 4-5000 לידות חי ו- % 3-11 לגרום לעיוורון בילדים, מפגין נפוץ כמו מבנה דמוי מנעול זה בולטת האישון במרכז עין4, נלסון! 5,6. הפונקציה של פיסורה דמית העין היא כדי לספק נקודת כניסה מוקדמת להערכת גדל לתוך הכוס אופטיים, לאחר מכן צידי פיסורה הפתיל כדי להקיף את כלי7.
בעוד coloboma עינית ידוע מאז ימי קדם, לאחרונה זיהינו תת-קבוצה הרומן של coloboma חולים עם איבוד רקמות המשפיעים על ההיבט סופריור/הגבי של העין. עבודה במעבדה שלנו הובילה לגילוי של מבנה עינית בעין דג זברה הגבי, שאותם אנו מכנים sulcus עינית סופריור (SOS) או פיסורה מעולה8. חשוב לציין כי המבנה יש מאפייני sulcus והן סדק. בדומה sulcus, זה שכבת רקמת מתמיד החובקת מ אפי אל הרשתית טמפורלית. בנוסף, הסגר של המבנה שאינו מתווך על ידי שילוב של השניים מנוגדים קרום המרתף, ונראה לדרוש morphogenetic תהליך שבו המבנה מאוכלס על ידי התאים. עם זאת, בדומה סדק, היא יוצרת מבנה המפריד את האף ובצד הטמפורלי של העין הגבי עם קרום המרתף. עקביות, נתייחס אליו כמו SOS בטקסט זה.
אות המצוקה אבולוציונית כולו לאורך החוליות, להיות גלוי במהלך מורפוגנזה עין דג, צ'יק, ניוט ו העכבר8. בניגוד פיסורה דמית העין, אשר נמצא במקום מ- 20-60 שעות שלאחר ההפריה (hpf) בדג זברה, אות המצוקה הוא מאוד חולף, להיות גלויים בקלות מ- 20-23 hpf, נעדר מאת 26 hpf8. מחקר שנערך לאחרונה במעבדתנו נמצא כי, בדומה פיסורה דמית העין, אות המצוקה ממלאת תפקיד הדרכה כלי הדם בזמן העין מורפוגנזה8. למרות הגורמים השולטים על היווצרות וסגירת אות המצוקה אינם עדיין לגמרי מובנים, הנתונים שלנו הדגש תפקידי עין הגבי הגחוני / תכנים גנים8.
דג זברה היא אורגניזם מודל מצויין ללמוד אות המצוקה. כמערכת מודל, היא מספקת מספר יתרונות בלימוד התפתחות העין: זה מודל חוליות; כל דור תערוכות פוריות גבוהה (~ 200 עוברי); הגנום שלו יש כבר וסודרו באופן מלא, אשר מקלה על מניפולציה גנטית; כ- 70% של גנים אנושיים יש לפחות אחד orthologue דג זברה, שהופך אותו מודל אידיאלי מבוסס-גנטיקה של מחלות אנושיות9,10. והכי חשוב, התפתחותו לוקח מקום חיצוני עם האמא, הזחלים שלה הם שקופים, מה שמאפשר עבור הפריט החזותי של העין לפתח בקלות יחסית11.
בקבוצה זו של פרוטוקולים, נתאר את הטכניקות שדרכו ניתן לאבחן אות המצוקה של דג זברה הזחלים. מגוון רחב של טכניקות הדמיה השתמשו בדוח זה יאפשר התבוננות ברור ה'אס במהלך התפתחות העין נורמלי, כמו גם את היכולת לזהות פגמים הסגר SOS. הפרוטוקולים בדוגמה שלנו יכלול חקירות של Gdf6, BMP מקומית מהראש ועין וסת הידועות של SOS הסגר. יתרה מזאת, טכניקות אלה יכול להיות משולב עם ניסיוני מניפולציות כדי לזהות גורמים גנטיים או סוכנים תרופתי המשפיעים על היווצרות SOS הנכונה וסגירת. בנוסף, כללנו פרוטוקול שדרכו אפשרית ההדמיה פלורסנט של כל קרום התא, המאפשר הנסיין לבחון שינויים מורפולוגיים לתאים שסביבה אות המצוקה. המטרה שלנו היא להקים קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים יכול לשמש בכל רחבי הקהילה המדעית להציע תובנות חדשות זה מבנה הרומן של העין המתפתח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Coloboma עינית מולדת היא הפרעה גנטית זה בדרך כלל נצפית כמו בקע בהיבט נחות של העין הסגר פיסורה דמית העין לא שלם. לאחרונה, הזיהוי של אנשים עם coloboma בהיבט מעולה של איריס, רשתית, עדשה הובילו הגילוי של מבנה הרומן, מכונה מעולה פיסורה או sulcus עינית סופריור (SOS), כי קיים transiently על מהראש ההיבט של גביע הראייה במהלך התפתחות העין חוליות. למרות המבנה כולו על פני עכברים, חומוס, דג, ניוט, ההבנה הנוכחית שלנו של אות המצוקה היא מוגבלת. כדי להבהיר גורמים שתורמים שלה היווצרות, הסגר, זה הכרחי כדי שניתן יהיה לבחון אותה ולזהות מומים, כגון עיכוב הסגר ה'אס. כאן, אנחנו יצא כדי ליצור סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים יכול לשמש ביעילות להמחיש אות המצוקה על ידי שילוב של טכניקות במיקרוסקופ נרחב זמין עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כגון צביעת immunofluorescent mRNA ביטוי. בעוד זו קבוצה של פרוטוקולים מתמקד היכולת להתבונן SOS הסגר עיכוב, היא יכולת הסתגלות לצרכים של הנסיין, ניתן לשנות בקלות. בסך הכל, אנו מקווים ליצור שיטה נוחה שדרכו ניתן מתקדמים ההבנה שלנו של אות המצוקה כדי להרחיב את הידע הנוכחי של התפתחות העין חוליות.

דג זברה SOS מופיע בגיל 20 hpf ב רשתית הגבי הרב, שעורר8. 23 hpf אות המצוקה מעברים מן הארכיטקטורה צר הראשונית כניסה רחב ועל ידי 26 hpf. זה כבר לא נראה לעין8. לכן, כדי לבחון את SOS במהלך התפתחות העין נורמלי דג זברה, העוברים יש להקפיד בין hpf 20-23. במהלך תקופה זו, הוא או?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

קבוצה זו של פרוטוקולים סטנדרטיים יכולה לשמש כדי להציע תובנה חדשה לתוך סולקוס עיני מעולה, או SOS, מבנה שהתגלה לאחרונה של העין המתפתחת. פרוטוקולים אלה יאפשרו לכל ניסוי ברחבי העולם לדמיין בבירור את ה-SOS במהלך התפתחות העיניים של הזברה. התחל על ידי הצבת מפריד צמיחה הטרוזיגי גורם שש זכר ונקבה זברה בצדדים נפרדים של מחיצה במיכל של מים dechlorinated ערב לפני הזיווג שלהם.למחרת בבוקר, להסיר את המפריד ולאפשר לדגים להתרבות במשך לא יותר מ 30 דקות. בתום תקופת הרבייה, לאסוף את העוברים לתוך מנות פטרי המכילות E3 בינוני עבור הדגירה שלהם באינקובטור 28.5 מעלות. ב 20 שעות לאחר ההפריה, להחליף את supernatant עם E3 בינוני בתוספת 0.004%1-פניל-2-thiourea כדי למנוע ייצור פיגמנט ולבחון את העוברים על ידי מיקרוסקופיה אור כדי לאשר שהם כולם בשלב ההתפתחותי המתאים.מקם את הדגימות תחת מיקרוסקופ חיטוי. השליכו עוברים לא בוגרים התפתחותית ולהשתמש במטלפים עדין כדי לפרק בעדינות את הצ'ירונים. דמיין את ה- SOS, שעשוי להופיע ככניסה או כקו בשולי הגב של העין.לאחר מכן, מיין את העוברים ההצגים עיכוב סגירת SOS מאלה שלא. כדי לצלם עוברים אלה באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, הכינו צלחת פטרי המכילה 1%agarose במדיום E3 ודקרו קלות את מרכז ההתעוררות כדי ליצור חור רדוד שלתוכם ניתן להציב את החלמון של העובר. לאחר מכן, מניחים עובר הרדמה באופן מאוחר על אגרוז.כדי לדמיין את העוברים באמצעות תרכובת או מיקרוסקופ קונפוקל, להעביר עובר לתוך צלחת פטרי 35 מילימטר המכיל בולוס קטן של נקודת התכה נמוכה 1% לא מסולסלים התעורר לתוך E3 בינוני ולהשתמש בקו דיג עדין כדי למקם במהירות את העובר בתמורה הנגלית. כאשר אגרוז התקרר, יוצקים מספיק מדיום E3 לתוך המנה כדי לכסות את אגרוז ולהשתמש עדשה אובייקטיבית טבילה מים 20x כדי לדמיין את SOS. לאחר הדמיה, בעדינות למשוך את agarose מן העובר ולתקן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde או לאפשר דג הזברה להמשיך את התפתחותו.כדי לדמיין את ה- SOS על ידי ביטוי mRNA פלואורסצנטי, השתמש במנגנוני microinjection כדי להזריק 300 פיקוגרמות של MRNA GFP-CAX משופר לעוברים בשלב התא האחד. לאחר מכן, השתמש בסטריאוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן עוברים עם ביטוי GFP משופר בהיר ולקבל תמונות של העוברים על ידי אחת משיטות ההדמיה כפי שהוכח. עבור כתם immunofluorescent כל הר של למינין זברה עוברי, dechorionate העוברים כפי שהוכח ולתקן את העוברים בצינור microcentrifuge ב 4% paraformaldehyde מוכן טרי במשך שעתיים על שייקר טמפרטורת החדר.בסוף הקיבעון, לשטוף את העוברים ארבע פעמים PBS בתוספת Tween, או PBST, במשך חמש דקות לשטוף ואחריו permeabilization ב 10 מיקרוגרם למיליליטר או Proteinase K בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לשטוף את העוברים permeabilized ארבע פעמים PBST כפי שהודגם ולחסום את העוברים בסרום עזים 5% ושני מיליגרם למיליליטר של אלבומין סרום בשר ב PBST במשך שעה עד שעתיים על שייקר טמפרטורת החדר. בסוף הדגירה החוסמת, דגירה העוברים בנוגדן העיקרי נגד למינין של עניין בארבע מעלות צלזיוס לילה על שייקר.למחרת בבוקר, לשטוף את העוברים חמש פעמים PBST במשך 15 דקות לכל לשטוף ולתייג את הרקמות עם נוגדן משני מתאים לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את העוברים ארבע פעמים PBST במשך 15 דקות לכל לשטוף ולמקום את העוברים בצלחת פטרי קטנה המכילה PBST טרי. באמצעות מלקחיים עדין, בעדינות לשבש את החלמונים ולהסיר את תאי החלמון באמצעות גירוד קל של החלמון.מעבירים את העוברים deyolked לתוך טרי מוכן 30% גליצרול ב PBS, הקפדה למקם את העוברים על גבי הפתרון והעברת מעט של הפתרון הקודם ככל האפשר ולחכות העוברים לשקוע לתחתית הצינור. כאשר העוברים הגיעו לתחתית המיכל, מעבירים אותם ל-50% ו-70% גליצרול רציפים בפתרונות PBS, כפי שהודגם זה בלבד. לאחר שהעוברים שקעו לתחתית מיכל ה-70%גליצרול, מעבירים את הדגימות לצלחת פלסטיק קטנה לניתוחים ומנתקים את העוברים האחוריים אל הישבנים.באמצעות כלי ניתוח עדין, להעביר ראש אחד לשקופית זכוכית עם גליצרול קטן ככל האפשר בעדינות להכניס סיכת minutien בסדר לתוך החדר הקדם מן הפנים, דוחף כלפי מטה כדי להפריד את החצי הימני והשמאלי של הראש אחד מהשני. כאשר הראש כבר פילה לחלוטין לאורך קו האמצע, הר כל צד של קו האמצע של הראש למטה, צד העין למעלה. ה- SOS ניתן לצפייה דרך המיקרוסקופ הניתוח בשעה 20 עד 23 שעות לאחר ההפריה ובאמצעות הדמיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית כקו דק בעין הגבית המפריד בין חצאי האף והקצב של הרשתית המתפתחת.בנוסף, כניסה עדינה עשויה להיות גלויה בגבול הגבי של העין. בעקבות הכתם immunofluorescent של למינין, הקו הדק יכול להיות מאושר כמו קרום המרתף. כאשר סגירת SOS מתעכבת, נוכחותה הממושכת ניתן לראות שסוע בולט בצד הגבי של העין תחת מיקרוסקופ ניתוח.כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ מורכב באמצעות דימות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, תכונה זו בולטת עוד יותר עם הצדדים האף והקצבי של העין מופרדים על ידי SOS, אשר נראה בבירור כקו בעין הגבית. על ידי 28 שעות לאחר ההפריה של דגי זברה בר, כתמי למין מדגים בבירור כי SOS סגור לחלוטין, מה שהופך את זה השלב האידיאלי לניטור עיכובים בסדק סגירה. הזרקת MRNA GFP-CAX משופרת מאפשרת הדמיה של קרום התא של עובר חי או קבוע למעקב אחר שינויים במורפולוגיה של התאים שמובילים לסגירת SOS.הדמיה של ה- SOS יכולה להיות קשה, מכיוון שהיא צרה וחולף. עם זאת, הכרחי שתשמור על שיטת ניקוד עקבית בעת הערכת עיכובים בסגירה בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקות אלה ניתן לשלב עם מניפולציות ניסיוניות לזיהוי גורמים גנטיים או סוכנים תרופתיים המשפיעים על היווצרות SOS נכונה וסגירה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...