Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR), scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC), Alberta Innova Technology Futures e donne e salute Research Institute (WCHRI bambini).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Alberta Animal Care e Comitato di uso.
1. protocollo 1: Visualizzazione di SOS utilizzando stereomicroscopia e imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza
<ol><li>Raccolta degli embrioni<ol>
<li>In un serbatoio di acqua declorurata, preparare croci di zebrafish gdf6a+ /- nella sera, abbinando un zebrafish maschio con una femmina zebrafish. Assicurarsi di separare il maschio dalla femmina con ...

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il SOS nell'embrione di zebrafish sviluppo. Per determinare fenotipi di ritardo di chiusura, i nostri protocolli sono concentrati sulla capacità di distinguere la separazione dei due lobi discreti del lato dorsale-nasale e dorsale-temporale dell'occhio, simile a tecniche utilizzate per visualizzare ritardo chiusura coroidico fenditura fenotipi nell'occhio ventrale.
Queste tecniche di visualizzazione possono essere utilizza...

La formazione dell'occhio dei vertebrati è un processo altamente conservato in cui vie di segnalazione intercellulare attentamente orchestrate stabilire i tipi di tessuto e specifica identità regionale1. Perturbazioni alla morfogenesi occhio presto causare difetti profondi all'architettura dell'occhio e sono frequentemente accecante2. Una tale malattia deriva dall'impossibilità di chiudere la fessura oculare coroidico nella parte ventrale della Coppa ottica3. Questo disturbo, noto come coloboma oculare, è stimato in 1 su 4-5000 nati vivi e causa 3-11% di cecità pediatrica, che si manifesta comunemente come una buco della serratura-come la struttura che sporge inferiorly dalla pupilla al centro dell'occhio4, 5,6. La funzione della fenditura coroidico è di fornire un punto di ingresso per primi sistema vascolare in crescita nella tazza ottica, dopo di che i lati della fenditura fonderanno per racchiudere le navi7.
Mentre coloboma oculare è stata conosciuta fin dai tempi antichi, recentemente abbiamo identificato un sottogruppo romanzo di coloboma pazienti con perdita di tessuto che interessano la funzione superior/dorsale dell'occhio. Lavoro recente nel nostro laboratorio ha portato alla scoperta di una struttura oculare nell'occhio dorsale di zebrafish, che noi definiamo il solco superiore oculare (SOS) o fenditura superiore8. È importante notare che la struttura ha le caratteristiche di un solco e di una fessura. Simile a un solco, è uno strato di tessuto continuo che si estende dal nasale alla retina temporale. Inoltre, la chiusura della struttura non è mediata da una fusione tra i due opposti della membrana dello scantinato, e sembra che richiedono un processo morfogenetico da cui la struttura è popolata dalle cellule. Tuttavia, simile a una fenditura, forma una struttura che separa il lato nasale e temporale dell'occhio dorsale con la membrana dello scantinato. Per coerenza, si farà riferimento ad esso come SOS in questo testo.
Il SOS è evolutivamente conservato in vertebrati, essendo visibile durante la morfogenesi di occhio di pesce, pulcino, newt e mouse8. In contrasto con la fenditura coroidico, che è presente da 20-60 ore post-fertilizzazione (hpf) in zebrafish, il SOS è altamente temporaneo, essendo facilmente visibile da 20-23 hpf e assente da 26 hpf8. Recenti ricerche nel nostro laboratorio ha trovato che, simile alla fenditura coroidico, il SOS svolge un ruolo nell'orientamento vascolare durante occhio morfogenesi8. Anche se i fattori che controllano la formazione e la chiusura di SOS ancora completamente non sono capiti, i nostri dati ha fatto evidenziare ruoli per dorso-ventrale occhio patterning geni8.
Zebrafish è un organismo modello eccellente per studiare il SOS. Come sistema modello, fornisce una serie di vantaggi a studiare lo sviluppo dell'occhio: si tratta di un modello di vertebrati; ogni generazione esibisce alta fecondità (~ 200 embrioni); il suo genoma è stato completamente sequenziato, che facilita la manipolazione genetica; e circa il 70% dei geni umani hanno almeno un ortologo di zebrafish, rendendolo un ideale modello basato su genetica di malattia umana9,10. La cosa più importante, lo sviluppo avviene esternamente alla madre, e le sue larve sono trasparenti, che consente la visualizzazione dell'occhio in via di sviluppo con relativa facilità11.
In questa serie di protocolli, descriviamo le tecniche attraverso le quali il SOS possono essere visualizzati nelle larve di zebrafish. La varietà di tecniche di visualizzazione utilizzati in questo report vi permetterà chiara osservazione di SOS durante lo sviluppo normale dell'occhio, così come la capacità di rilevare difetti di chiusura SOS. I nostri protocolli di esempio saranno caratterizzato da indagini di Gdf6, un BMP localizzate alla dorsale occhio e noto regolatore di chiusura SOS. Ulteriormente, queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la chiusura e la corretta formazione di SOS. Inoltre, abbiamo incluso un protocollo attraverso il quale è possibile, l'imaging fluorescente di tutte le membrane cellulari permettendo lo sperimentatore ad osservare i cambiamenti morfologici per le celle circostanti il SOS. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un insieme di protocolli standardizzati che può essere utilizzato in tutta la comunità scientifica per offrire nuove prospettive in questo romanzo struttura dell'occhio in via di sviluppo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Coloboma oculare congenita è una malattia genetica che si osserva tipicamente come una fenditura nella funzione inferiore dell'occhio derivanti dalla chiusura della fenditura coroidico incompleta. Recentemente, l'identificazione degli individui con il coloboma in funzione superiore dell'iride, retina e lente ha portato alla scoperta di una nuova struttura, indicato come la fenditura superiore o superiore del solco oculare (SOS), che è transitoriamente presente sulla dorsale aspetto della Coppa ottica durante lo sviluppo dell'occhio dei vertebrati. Anche se questa struttura è conservata in topi, pulcino, pesce e newt, nostra attuale comprensione di SOS è limitato. Per chiarire i fattori che contribuiscono alla sua formazione e chiusura, è indispensabile essere in grado di osservare e identificare le anomalie, quali ritardo nella chiusura di SOS. Qui, abbiamo deciso di creare una serie standardizzata dei protocolli che può essere utilizzato per visualizzare in modo efficiente il SOS combinando tecniche di microscopia ampiamente disponibili con comuni tecniche di biologia molecolare come macchiatura immunofluorescente e mRNA sovraespressione. Mentre questo set di protocolli si concentra sulla capacità di osservare ritardo chiusura SOS, è adattabile alle esigenze dello sperimentatore e possono essere facilmente modificato. Nel complesso, ci auguriamo di creare un metodo accessibile attraverso il quale la nostra comprensione di SOS può essere avanzato per espandere le conoscenze attuali di sviluppo dell'occhio dei vertebrati.

Zebrafish SOS appare alle 20 hpf nella retina dorsale presuntiva8. Da 23 hpf SOS transizioni dalla sua architettura stretta iniziale a una vasta rientranza e da 26 hpf non è più visibile8. Pertanto, per esaminare il SOS durante lo sviluppo dell'occhio di zebrafish normale, gli embrioni devono essere osservati fra hpf 20-23. Durante questo periodo, il SOS è osservabile attraverso il microscopio per dissezione e tramite immagini DIC come un...

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Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Questo insieme di protocolli di standardizzazione può essere utilizzato per offrire nuove informazioni sul solco oculare superiore, o SOS, una struttura scoperta di recente dell'occhio in via di sviluppo. Questi protocolli consentiranno a qualsiasi sperimentatore in tutto il mondo di visualizzare chiaramente l'SOS durante lo sviluppo degli occhi zebrafish. Inizia posizionando il fattore di differenziazione della crescita eterozigote sei Zebrafish maschio e femmina su lati separati di un divisore in un serbatoio di acqua declorolato la sera prima del loro accoppiamento.La mattina successiva, rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riprodutti per non più di 30 minuti. Alla fine del periodo di riproduzione, raccogliere gli embrioni in piastre di Petri contenenti mezzo E3 per la loro incubazione in un incubatore di 28,5 gradi. A 20 ore dalla concimazione, sostituire il supernatante con mezzo E3 integrato 0,004%1-Fenil-2-tiourea per prevenire la produzione di pigmenti ed esaminare gli embrioni con microscopia ottica per confermare che sono tutti nella fase di sviluppo appropriata.Posizionare i campioni al microscopio di sezionamento. Scartare eventuali embrioni immaturi per lo sviluppo e utilizzare forcep fini per smontare delicatamente i coriaci. Visualizza l'SOS, che può apparire come un'indentazione o una linea al margine dorsale dell'occhio.Quindi, ordina gli embrioni che mostrano un ritardo di chiusura dell'SOS rispetto a quelli che non lo fanno. Per fotografare questi embrioni utilizzando un microscopio sezionato, preparare una piastra di Petri contenente l'1%di agarosio nel mezzo E3 e pungere leggermente il centro dell'agarosio per creare un buco poco profondo in cui è possibile posizionare il tuorlo dell'embrione. Quindi, posizionare un embrione anestetizzato lateralmente sull'agarosio.Per identificare gli embrioni utilizzando un microscopio composto o confocale, trasferire un embrione in una piastra di Petri di 35 millimetri contenente un piccolo bolo di agarosio a punti di fusione basso 1% non gelato nel mezzo E3 e utilizzare una lenza fine per posizionare rapidamente l'embrione nella posizione laterale. Quando l'agarosio si è raffreddato, versare abbastanza mezzo E3 nel piatto per coprire l'agarosio e utilizzare una lente obiettivo di immersione in acqua 20x per visualizzare l'SOS. Dopo l'imaging, estrarre delicatamente l'agarosio dall'embrione e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% o consentire al pesce zebra di continuare il suo sviluppo.Per visualizzare l'SOS mediante espressione di mRNA fluorescente, utilizzare un apparato di microiniezione per iniettare 300 picogrammi di mRNA GFP-CAX potenziato in embrioni allo stadio di una cellula. Quindi, utilizzare uno stereoscopio fluorescente per schermare gli embrioni con un'espressione GFP migliorata brillante e ottenere immagini degli embrioni con uno dei metodi di imaging come dimostrato. Per la colorazione immunofluorescente a montaggio intero della laminina di zebrafish embrionale, dechorionare gli embrioni come dimostrato e fissare gli embrioni in un tubo di microcentrifugo in paraformaldeide al 4% preparata al momento per due ore su uno shaker a temperatura ambiente.Al termine della fissazione, lavare gli embrioni quattro volte in PBS più Tween, o PBST, per cinque minuti per lavaggio seguito da permeabilizzazione in 10 microgrammi per millilitro o Proteinasi K a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare gli embrioni permeabili quattro volte in PBST come dimostrato e bloccare gli embrioni nel siero di capra al 5% e due milligrammi per millilitro di albumina di siero bovino in PBST per una o due ore su uno shaker a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione di blocco, incubare gli embrioni nell'anticorpo anti-laminide primario di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker.La mattina seguente, lavare gli embrioni cinque volte in PBST per 15 minuti per lavaggio ed etichettare i tessuti con un anticorpo secondario appropriato durante la notte a quattro gradi Celsius sullo shaker protetto dalla luce. La mattina seguente, lavare gli embrioni quattro volte in PBST per 15 minuti per lavaggio e posizionare gli embrioni in una piccola piastra di Petri contenente PBST fresco. Usando forcep fini, interrompere delicatamente i tuorli e rimuovere le cellule del tuorlo attraverso un lieve raschiamento delle sacche di tuorlo.Trasferire gli embrioni deyolked nel 30% di glicerolo appena preparato in PBS, assicurandosi di posizionare gli embrioni sopra la soluzione e trasferendo il meno possibile la soluzione precedente e attendere che gli embrioni affondino sul fondo del tubo. Quando gli embrioni hanno raggiunto il fondo del contenitore, trasferirli al 50% sequenziale e al 70% di glicerolo nelle soluzioni PBS, come appena dimostrato. Dopo che gli embrioni sono affondati sul fondo del contenitore del 70% di glicerolo, trasferire i campioni su un piccolo piatto di plastica per la dissezione e severare gli embrioni posteriori alle hindbraine.Utilizzando strumenti di dissezione fine, spostare una testa su uno scivolo di vetro con il meno glicerolo possibile e inserire delicatamente un perno di minuzie fine nel ventricolo del probrain dall'interno, spingendo verso il basso per separare le metà destra e sinistra della testa l'una dall'altra. Quando la testa è stata completamente raccordata lungo la linea mediana, montare ogni lato della linea mediana della testa verso il basso, lato oculare verso l'alto. L'SOS è osservabile attraverso il microscopio sezionante a 20-23 ore dopo la fecondazione e attraverso l'imaging a contrasto di interferenza differenziale come una linea sottile nell'occhio dorsale che separa le metà nasali e temporali della retina in via di sviluppo.Inoltre, una sottile indentazione può essere visibile nel confine dorsale dell'occhio. Dopo la colorazione immunofluorescente della laminina, la linea sottile può essere confermata come membrana basale. Quando la chiusura sos è ritardata, la sua presenza prolungata può essere osservata come una pronunciata fenditura nel lato dorsale dell'occhio sotto un microscopio sezionante.Se osservata al microscopio composto utilizzando l'imaging a contrasto di interferenza differenziale, questa caratteristica è ancora più prominente con i lati nasale e temporale dell'occhio separati dall'SOS, che è chiaramente visibile come una linea nell'occhio dorsale. Entro 28 ore dalla fecondazione in zebrafish di tipo selvatico, la colorazione laminina dimostra chiaramente che l'SOS è completamente chiuso, rendendolo il palcoscenico ideale per monitorare i ritardi nella chiusura della fessura. L'iniezione di mRNA GFP-CAX potenziato consente la visualizzazione delle membrane cellulari di embrioni vivi o fissi per tracciare i cambiamenti nella morfologia delle cellule che portano alla chiusura sos.Visualizzare l'SOS può essere difficile, in quanto è stretto e transitorio. Tuttavia, è imperativo mantenere un metodo di punteggio coerente quando si valutano i ritardi di chiusura nei punti di tempo successivi. Queste tecniche possono essere combinate con manipolazioni sperimentali per identificare fattori genetici o agenti farmacologici che influenzano la corretta formazione e chiusura dell'SOS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali