Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
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Este trabalho foi financiado por institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR), ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC), Alberta inova tecnologia futuros e mulheres e Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI infantil).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Alberta cuidado do Animal e Comissão de utilização.
1. Protocolo 1: Visualização de SOS usando estereomicroscópio e imagem latente de interferência diferencial (DIC) de contraste
<ol><li>Colheita de embriões<ol>
<li>Em um tanque de água sem cloro, prepare cruzes de gdf6a+ /- zebrafish à noite emparelhando um zebrafish macho com um fêmea zebrafish. Certifique-se de separar o macho da fêmea u...

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o SOS no desenvolvimento do embrião do zebrafish. Para determinar os fenótipos de atraso de fechamento, nossos protocolos centraram-se sobre a capacidade de distinguir a separação dos dois lobos discretas dos lados nasal dorsal e dorsal-temporal do olho, semelhante às técnicas usadas para visualizar o atraso de fechamento da fissura coroide fenótipos nos olhos ventral.
Estas técnicas de visualização podem ser usada...

A formação do olho de vertebrados é um processo altamente conservado em que vias de sinalização intercelulares cuidadosamente orquestradas estabelecer tipos de tecido em especificam a identidade regional1. Perturbações de início morfogênese olho resultam em defeitos profundos para a arquitetura do olho e são frequentemente cegueira2. Uma tal doença resulta do não-fechamento da fissura coroide ocular no lado ventral da Taça óptica3. Esta doença, conhecida como coloboma ocular, estima-se que ocorrem em 1 a 4-5000 nascidos vivos e % de 3-11 causa de cegueira pediátrica, manifestando-se geralmente como uma estrutura de fechadura que se projeta inferiormente do aluno no centro do olho4, 5,6. A função da fissura coroide é fornecer um ponto de entrada para início vasculatura crescendo no copo de óptica, depois que os lados da fissura irão fundir para delimitar os navios7.
Enquanto coloboma ocular é conhecida desde os tempos antigos, nós identificamos recentemente um romance subconjunto de pacientes coloboma com perda de tecido, afetando a face superior/dorsal do olho. Trabalho recente em nosso laboratório levou à descoberta de uma estrutura ocular no olho dorsal zebrafish, que nos referimos como o sulco ocular superior (SOS) ou fissura superior8. É importante observar que a estrutura tem características de um sulco e uma fissura. É semelhante a um sulco, uma camada de tecido contínua que se estende desde o nasal da retina temporal. Além disso, o fechamento da estrutura não é mediado por uma fusão dos dois opostos da membrana basal, e parece exigir um processo morfogenético, pelo qual a estrutura é preenchida por células. No entanto, semelhante a uma fissura, forma uma estrutura que separa os lados nasais e temporais do olho dorsal com a membrana basal. Para obter consistência, nos referiremos a ela como SOS neste texto.
O SOS é evolutivamente conservado em vertebrados, sendo visível durante a morfogênese de olho no peixe, pintinho, Tritão e rato8. Em contraste com a fissura coroide, que está presente desde a pós-fertilização 20-60 horas (hpf) no zebrafish, o SOS é altamente transitório, sendo facilmente visível a partir de 20-23 hpf e ausente por 26 hpf8. Pesquisas recentes em nosso laboratório encontrou que, semelhante da fissura coroide, o SOS desempenha um papel na orientação vascular durante o olho morfogênese8. Embora os fatores que controlam a formação e o encerramento do SOS ainda não são totalmente compreendidos, nossos dados destacar papéis para dorso-ventral olho padronização genes8.
Zebrafish é um organismo modelo excelente para estudar o SOS. Como um sistema de modelo, ele fornece uma série de vantagens em estudar o desenvolvimento do olho: é um modelo de vertebrados; cada geração apresenta alta fecundidade (~ 200 embriões); seu genoma foi totalmente sequenciada, que facilita a manipulação genética; e cerca de 70% dos genes humanos têm pelo menos um orthologue zebrafish, tornando-se um modelo ideal baseado em genética de doenças humanas9,10. Mais importante ainda, seu desenvolvimento ocorre externamente à mãe, e suas larvas são transparentes, o que permite a visualização do olho em desenvolvimento com relativa facilidade11.
Este conjunto de protocolos, descrevemos as técnicas através das quais o SOS podem ser visualizado em larvas de peixe-zebra. A variedade de técnicas de visualização utilizado neste relatório permitirá clara observação do SOS durante o desenvolvimento do olho normal, bem como a capacidade de detectar defeitos de fechamento do SOS. Nossos protocolos de exemplo contará com investigações de Gdf6, um BMP localizada para o dorsal olho e conhecido regulador de encerramento de SOS. Além disso, essas técnicas podem ser combinadas com manipulações experimentais para identificar fatores genéticos ou agentes farmacológicos que afetam o fechamento e a adequada formação de SOS. Além disso, nós incluímos um protocolo através do qual a imagem fluorescente de todas as membranas celulares é possível, permitindo que o experimentador observar alterações morfológicas que as células circundantes o SOS. Nosso objetivo é estabelecer um conjunto de protocolos padronizados que podem ser usados em toda a comunidade científica para oferecer novos insights sobre esta estrutura nova do olho em desenvolvimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Coloboma ocular congênita é uma desordem genética que normalmente é observada como uma fissura no aspecto inferior do olho resultantes de fechamento da fissura coroide incompleta. Recentemente, a identificação de indivíduos com coloboma no aspecto superior da íris, retina e lente levado à descoberta de uma estrutura nova, conhecido como a fissura superior ou superior sulco ocular (SOS), que está presente transitoriamente na dorsal aspecto da Taça óptica durante o desenvolvimento do olho de vertebrados. Embora esta estrutura é conservada em ratos, garota, peixe e Tritão, nossa compreensão atual do SOS é limitado. A fim de elucidar os fatores que contribuem para sua formação e o encerramento, é imperativo para poder observá-lo e identificar anormalidades, tais como atraso no fechamento do SOS. Aqui, nos propusemos a criar uma série padronizada de protocolos que podem ser usados para visualizar eficientemente o SOS combinando técnicas de microscopia amplamente disponível com técnicas de biologia molecular comuns como coloração imunofluorescente e mRNA superexpressão. Enquanto este conjunto de protocolos enfoca a capacidade de observar o atraso de fechamento de SOS, é adaptável às necessidades do experimentador e pode ser facilmente modificado. Em geral, esperamos criar um método acessível através do qual a nossa compreensão do SOS pode ser avançado para expandir o conhecimento atual do desenvolvimento do olho de vertebrados.

O zebrafish SOS aparece aos 20 hpf no retina dorsal presuntivo8. Por 23 hpf o SOS transições de sua arquitetura inicial estreita para um recuo de largura e 26 hpf não é mais visível8. Portanto, para examinar o SOS durante o desenvolvimento do olho normal zebrafish, os embriões devem ser observados entre 20-23 hpf. Durante este período, o SOS é observável através do microscópio de dissecação e através de imagem de DIC como uma l...

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Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Este conjunto de protocolos de padronização pode ser usado para oferecer uma nova visão sobre o sulco ocular superior, ou SOS, uma estrutura recentemente descoberta do olho em desenvolvimento. Esses protocolos permitirão que qualquer experimentador em todo o mundo visualize claramente o SOS durante o desenvolvimento dos olhos de zebrafish. Comece colocando o fator de diferenciação de crescimento heterozigous seis Um peixe-zebra macho e fêmea em lados separados de um divisor em um tanque de água descrente na noite anterior ao seu emparelhamento.Na manhã seguinte, remova o divisor e deixe o peixe procriar por não mais do que 30 minutos. Ao final do período de reprodução, colete os embriões em placas de Petri contendo meio E3 para sua incubação em uma incubadora de 28,5 graus. Às 20 horas após a fertilização, substitua o supernascer por E3 médio suplementado 0,004%1-Phenyl-2-thiourea para evitar a produção de pigmentos e examinar os embriões por microscopia leve para confirmar que estão todos no estágio de desenvolvimento apropriado.Coloque as amostras sob um microscópio dissecando. Descarte quaisquer embriões imaturos de desenvolvimento e use fórceps finos para separar suavemente os acordes. Visualize o SOS, que pode aparecer como um recuo ou linha na margem dorsal do olho.Então, classifique os embriões que mostram o atraso de fechamento do SOS daqueles que não o fazem. Para fotografar esses embriões usando um microscópio dissecando, prepare uma placa de Petri contendo 1%de agarose em E3 médio e levemente espinhoso no centro da agarose para criar um buraco raso no qual a gema do embrião pode ser colocada. Em seguida, coloque um embrião anestesiado lateralmente sobre a agarose.Para imaginar os embriões usando um microscópio composto ou confocal, transfira um embrião para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo um pequeno bolus de ponto de fusão não-gelado de 1% baixo em meio E3 e use linha de pesca fina para posicionar rapidamente o embrião na posição lateral. Quando a agarose tiver esfriado, despeje bastante E3 médio no prato para cobrir a agarose e use uma lente objetiva de imersão de água de 20x para visualizar o SOS. Após a imagem, puxe suavemente a agarose do embrião e fixe o tecido em 4% de paraformaldeído ou permita que o zebrafish continue seu desenvolvimento.Para visualizar o SOS pela expressão fluorescente mRNA, use um aparelho de microinjeção para injetar 300 picogramas de mRNA GFP-CAX aprimorado em embriões no estágio de uma célula. Em seguida, use um estereoscópio fluorescente para testar embriões com expressão GFP brilhante e obter imagens dos embriões por um dos métodos de imagem, como demonstrado. Para coloração imunofluorescente de montagem total de laminina de zebrafish embrionário, descorionato os embriões como demonstrado e fixar os embriões em um tubo de microcentrifuge em recém-preparado 4% paraformaldeído por duas horas em um agitador de temperatura ambiente.Ao final da fixação, lave os embriões quatro vezes em PBS mais Tween, ou PBST, por cinco minutos por lavagem seguido de permeabilização em 10 microgramas por mililitro ou Proteinase K à temperatura ambiente por cinco minutos. Lave os embriões permeabilizados quatro vezes em PBST como demonstrado e bloqueie os embriões em 5% de soro de cabra e dois miligramas por mililitro de albumina de soro bovino em PBST por uma a duas horas em um agitador de temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, incubar os embriões no principal anticorpo anti-laminina de interesse a quatro graus Celsius durante a noite em um shaker.Na manhã seguinte, lave os embriões cinco vezes em PBST por 15 minutos por lavagem e rotule os tecidos com um anticorpo secundário apropriado durante a noite a quatro graus Celsius no shaker protegido da luz. Na manhã seguinte, lave os embriões quatro vezes em PBST por 15 minutos por lavagem e coloque os embriões em uma pequena placa de Petri contendo PBST fresco. Usando fórceps finos, interrompa suavemente as gemas e remova as células da gema através de raspagem leve dos sacos de gema.Transfira os embriões desolados para o recém-preparado 30% glicerol na PBS, certificando-se de colocar os embriões em cima da solução e transferir o mínimo possível da solução anterior e esperar que os embriões afundem até o fundo do tubo. Quando os embriões chegarem ao fundo do recipiente, transfira-os para 50% e 70% de glicerol sequencial em soluções PBS, como apenas demonstrado. Depois que os embriões afundarem até o fundo do recipiente de 70%, transfira as amostras para um pequeno prato plástico para dissecções e corte os embriões posteriores aos cérebros traseiros.Usando ferramentas de dissecção finas, mova uma cabeça para um deslizamento de vidro com o mínimo de glicerol possível e insira suavemente um pino minutien fino no ventrículo de antebraína do interior, empurrando para baixo para separar as metades direita e esquerda da cabeça uma da outra. Quando a cabeça estiver completamente preenchida pela linha média, monte cada lado da linha média da cabeça para baixo, olho para cima. O SOS é observável através do microscópio dissecando em 20 a 23 horas após a fertilização e através de interferência diferencial a imagem de contraste como uma linha fina no olho dorsal que separa as metades nasais e temporais da retina em desenvolvimento.Além disso, um recuo sutil pode ser visível no limite dorsal do olho. Após a coloração imunofluorescente da laminina, a linha fina pode ser confirmada como a membrana do porão. Quando o fechamento do SOS é adiado, sua presença prolongada pode ser observada como uma fissura pronunciada no lado dorsal do olho sob um microscópio dissecando.Quando observada sob um microscópio composto usando imagens de contraste de interferência diferencial, essa característica é ainda mais proeminente com os lados nasais e temporais do olho separados pelo SOS, que é claramente visível como uma linha no olho dorsal. Por 28 horas após a fertilização em zebrafish de tipo selvagem, a coloração de laminina demonstra claramente que o SOS está completamente fechado, tornando este o estágio ideal para monitorar atrasos no fechamento de fissuras. A injeção de mRNA GFP-CAX aprimorado permite a visualização das membranas celulares de embriões vivos ou fixos para rastrear alterações na morfologia das células que levam ao fechamento do SOS.Visualizar o SOS pode ser difícil, pois é estreito e transitório. No entanto, é imperativo que você mantenha um método de pontuação consistente ao avaliar atrasos de fechamento em pontos de tempo posteriores. Essas técnicas podem ser combinadas com manipulações experimentais para identificação de fatores genéticos ou agentes farmacológicos que afetam a formação e o fechamento adequados do SOS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

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Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

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