Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Эта работа была поддержана канадской институты здравоохранения исследований (КНИИЗ), естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ), Альберта инновационную технологию фьючерсы и женщин и Институт исследований здоровья детей (WCHRI).

Все методы, описанные здесь были одобрены в университете Альберта животное уход и использование Комитета.
1. Протокол 1: Визуализация SOS, используя стереомикроскопия и дифференциальной помехи изображения контрастность (DIC)
<ol><li>Эмбрион коллекция<ol>
<li>В баке дехлорируемым...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+coloboma:+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience.">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li><li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+colobomata.">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li><li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+microphthalmia,+anophthalmia+and+coloboma.">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li><li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+coloboma:+clinical+and+basic+science+update.">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li><li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature.">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li><li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma,+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye.">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов соблюдать SOS в развивающихся zebrafish эмбриона. Чтобы определить закрытие задержки фенотипов, наши протоколы были сосредоточены на способность различать разделение двух дискретных долей спинной носовой и спинной височной стор?...

Формирование позвоночных глаз является весьма сохранены процесс в котором тщательно спланированных межклеточной сигнализации пути установить типы тканей и указать региональной идентичности1. Возмущений в начале глаз морфогенеза приводят к глубокие дефекты в архитектуре глаза и часто слепоте2. Один из таких заболеваний результаты от неспособности закрыть сосудистое глазной щели в брюшной части глазного бокала3. Это расстройство, известный как глазные колобома, оценивается в 1 из 4-5000 живорожденных и причиной детской слепоты, часто проявляется как замочной скважины как структура, которая выступала книзу от ученика в центре глаза4, 3-11% 5,6. Функцию сосудистого трещина является предоставляют точку входа для раннего сосудистую, врастают в глазного бокала, после чего стороны трещины будет предохранитель подложить судов7.
В то время как глазные колобома был известен с древних времен, мы определили недавно подмножество Роман колобома пациентов с потерей ткани, затрагивающих Улучшенный/спинной части глаза. Последние работы в нашей лаборатории привела к открытию глазной структуры в спинной глаза данио рерио, который мы называем Улучшенный глазной борозды (SOS) или Улучшенный трещина8. Важно отметить, что структура имеет характеристики борозды и фиссур. Подобно борозды, это постоянное ткани слой, который охватывает от носа до височной сетчатки. Кроме того закрытие структуры не опосредовано слияние двух противоположных базальной мембраны, и она, как представляется, требуют морфогенетических процесс, в котором структура заполняется клетками. Однако подобно трещина, он образует структуру, которая отделяет носовой и височной стороны спинной глаз с базальной мембраны. Для обеспечения согласованности мы будет ссылаться на него как SOS в этом тексте.
SOS эволюционно сохраняется через позвоночных, будучи видимыми в ходе морфогенеза глаз рыбы, куриных, Тритон и мыши8. В отличие от сосудистое трещина, которая присутствует от 20-60 часов после оплодотворения (hpf) в данио рерио, SOS весьма преходящими, будучи легко видны с 20-23 hpf и отсутствует 26 hpf8. Недавние исследования в нашей лаборатории обнаружил, что, подобно сосудистое трещина, SOS играет роль в сосудистой руководство во время глаз морфогенеза8. Хотя факторы, определяющие формирование и закрытие SOS еще полностью не поняты, наши данные выделить ролей для глаз спинной вентральный кучность генов8.
Данио рерио — организм отличную модель для изучения SOS. Как модель системы, он обеспечивает ряд преимуществ при изучении глаз развития: это позвоночных модель; Каждое поколение проявляет высокую плодовитость (~ 200 эмбрионов); полностью виртуализированных его генома, который облегчает генетические манипуляции; и примерно 70% генов человека имеют по крайней мере один orthologue данио рерио, что делает его идеальным модель на основе генетики человека болезни9,10. Самое главное ее развитие происходит извне для матери, и его личинки являются прозрачными, что позволяет для визуализации развивающихся глаза с относительной легкостью11.
В этом наборе протоколов мы описываем методы, через которые SOS могут быть визуализированы в zebrafish личинки. Разнообразие методов визуализации, используемые в настоящем докладе позволит четкое наблюдение SOS во время разработки нормальный глаз, а также способность обнаруживать SOS закрытия дефектов. Наш пример протоколы будут представлены исследования Gdf6, BMP локализованные в спинной глаз и известных регулятор SOS закрытия. Кроме того эти методы могут быть объединены с экспериментальных манипуляций для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на формирование надлежащего SOS и закрытия. Кроме того мы включили протокол, посредством которого возможна флуоресцентных изображений всех клеточных мембран, позволяя экспериментатор соблюдать морфологические изменения клеток, окружающих SOS. Наша цель – создать набор стандартизованных протоколов, которые могут использоваться на протяжении всего научного сообщества предложить новые идеи в этот роман структуры развивающихся глаза.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Врожденная колобома глазной это генетическое нарушение, которое обычно наблюдается как расщелина в нижней аспект глаза результате неполной сосудистое трещина закрытия. Недавно выявление лиц с колобома в Улучшенный аспекте Ирис, сетчатке и объектив, привели к открытию новой структуры, называется Улучшенный трещина или Улучшенный глазной борозды (SOS), который временно присутствует на дорсальной аспект глазного бокала во время развития позвоночных глаз. Хотя эта структура сохраняется через мышей, цыпленок, рыбы и Тритон, нашего нынешнего понимания особенностей SOS ограничен. Для того, чтобы разъяснить факторы влияющие на его формирование и закрытия, крайне важно, чтобы иметь возможность наблюдать это и выявления аномалий, таких, как задержки в закрытии SOS. Здесь мы намереваемся создать серию стандартизированных протоколов, которые могут быть использованы эффективно визуализировать SOS путем объединения методов широко доступны микроскопии с общие методы молекулярной биологии как immunofluorescent окрашивание и мРНК Гиперэкспрессия. Хотя этот набор протоколов фокусируется на способность наблюдать за задержку закрытия SOS, он адаптируется к потребностям экспериментатора и могут быть легко изменены. В целом мы надеемся создать доступный метод, через который наше понимание SOS можно дополнительно расширить текущий набор знаний развития позвоночных глаз.

Данио рерио SOS появляется в 20 hpf предполагаемого спинной сетчатки8. 23 hpf SOS переходы от его первоначального узкого архитектуры для широкого отступы и 26 hpf, это больше не видны8. Таким образом для изучения SOS во время разработки глаз обычных данио р...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Визуализация глазной борозды Superior во время эмбриогенеза данио рерио

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов для наблюдения за Улучшенный глазной борозды, недавно выявленных, эволюционно сохраняется структура в позвоночных глаз. С помощью данио рерио личинки, мы демонстрируем методов, необходимых для выявления факторов, влияющих на формирование и закрытие Улучшенный глазной борозды.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Этот набор протоколов стандартов может быть использован, чтобы предложить новое понимание превосходного глазного сулькуса, или SOS, недавно обнаруженной структуры развивающегося глаза. Эти протоколы позволят любому экспериментатору во всем мире четко визуализировать SOS во время развития глаз зебры. Начните с размещения гетерозиготного фактора дифференциации роста 6 Самец и самка зебры на отдельных сторонах делитера в баке дехлорированной воды вечером перед их спариванием.На следующее утро снимите разделитель и дайте рыбе размножаться не более 30 минут. В конце периода размножения, собирать эмбрионы в чашки Петри, содержащие E3 среды для их инкубации в 28,5 градусов инкубатора. В течение 20 часов после оплодотворения замените супернатант на E3 средний, дополненный 0,004%1-фенил-2-тиуреа, чтобы предотвратить выработку пигмента и изучить эмбрионы с помощью световой микроскопии, чтобы подтвердить, что все они находятся на соответствующей стадии развития.Поместите образцы под рассечение микроскопа. Откажитесь от любых незрелых эмбрионов и используйте тонкие типсы, чтобы аккуратно разобрать хорионы. Визуализуй SOS, который может выглядеть как отступ или линия на спинной грани глаза.Затем сортировать эмбрионы, которые показывают задержку закрытия SOS от тех, которые этого не делают. Чтобы сфотографировать эти эмбрионы с помощью рассечения микроскопа, подготовить чашку Петри, содержащую 1%agarose в E3 среды и слегка колоть центр агарозы, чтобы создать мелкое отверстие, в которое желток эмбриона может быть помещен. Затем поместите анестезироваемый эмбрион сбое на агарозу.Чтобы изобразить эмбрионы с помощью соединения или конфокального микроскопа, перенесите эмбрион в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую небольшой болюс не гелеобразной точки плавления 1%low agarose в E3 medium и используйте тонкую лестню, чтобы быстро располагать эмбрион в боковом положении. Когда агароза остынет, залить достаточно E3 среды в блюдо, чтобы покрыть агарозу и использовать 20x воды погружения объектив для визуализации SOS. После визуализации, осторожно вытащить агарозу из эмбриона и исправить ткани в 4%paraformaldehyde или позволить зебры продолжать свое развитие.Чтобы визуализировать SOS с помощью флуоресцентного экспрессии мРНК, используйте микроинъекции аппарата для введения 300 пикограмм расширенной GFP-CAX мРНК в эмбрионы на одноклеточной стадии. Затем используйте флуоресцентный стереоскоп для проверки эмбрионов с ярким улучшенным выражением GFP и получения изображений эмбрионов одним из методов визуализации, как это было продемонстрировано. Для цельно-монтажного иммунофлуоресцентного окрашивания эмбрионального ламинина зебры, дехорионат эмбрионов, как это было продемонстрировано, и фиксирует эмбрионы в микроцентрифугной трубке в свежеприготовленном 4%параформальдегиде в течение двух часов на шейкере комнатной температуры.В конце фиксации, мыть эмбрионы четыре раза в PBS плюс Tween, или PBST, в течение пяти минут за стирку следуют протеабилизации в 10 микрограмм на миллилитр или Proteinase K при комнатной температуре в течение пяти минут. Вымойте промеабилизированные эмбрионы четыре раза в PBST, как попродемонстрировано, и блокируйте эмбрионы в сыворотке крови 5%goat и два миллиграмма на миллилитр альбумин сыворотки крупного рогатого скота в PBST в течение одного-двух часов на шейкере комнатной температуры. В конце блокирующего инкубации инкубировать эмбрионы в первичных антиламинин антитела интереса на четыре градуса по Цельсию ночь на шейкере.На следующее утро, мыть эмбрионы пять раз в PBST в течение 15 минут за стирку и этикетки тканей с соответствующим вторичным антителом на ночь при четырех градусах по Цельсию на шейкер защищен от света. На следующее утро, мыть эмбрионы четыре раза в PBST в течение 15 минут за стирку и поместить эмбрионы в небольшой чашке Петри, содержащей свежие PBST. Используя тонкие миппы, аккуратно нарушить желтки и удалить желтковые клетки через мягкий соскабливание желтковых мешков.Перенесите дейолкенные эмбрионы в свежеприготовленный 30%глицерол в PBS, убедившись, что поместите эмбрионы на верхней части раствора и передачи как можно меньше предыдущего решения, как это возможно, и ждать эмбрионов, чтобы опуститься на дно трубки. Когда эмбрионы достигли дна контейнера, перенесите их в последовательные 50%и 70% глицерол в решениях PBS, как только что продемонстрировано. После того, как эмбрионы опустились на дно 70%-глицерола контейнера, передать образцы в небольшой пластиковой тарелке для вскрытия и разорвать эмбрионы задней к задним сбрерам.Используя тонкие инструменты вскрытия, переместить одну голову на стеклянную горку с как можно меньше глицерол, как это возможно, и аккуратно вставить тонкую минутин булавку в желудочек forebrain из интерьера, толкая вниз, чтобы отделить правую и левую половинки головы друг от друга. Когда голова была полностью филе вниз по средней линии, смонтировать каждую сторону головы средней линии вниз, глаз вверх. SOS наблюдается через рассечение микроскопа на 20 до 23 часов после оплодотворения и с помощью дифференциальных помех контрастной визуализации, как тонкая линия в спинном глазу, который отделяет носовые и височные половинки развивающейся сетчатки.Кроме того, тонкий отступ может быть виден в спинной границе глаза. После иммунофлуоресцентного окрашивания ламинина тонкая линия может быть подтверждена в качестве мембраны подвала. Когда закрытие SOS задерживается, его длительное присутствие может наблюдаться как выраженная расщелина в спинной стороне глаза под рассеченным микроскопом.При наблюдении под соединением микроскопа с использованием дифференциальных помех контрастной визуализации, эта функция является еще более заметным с носовой и височной стороны глаза разделены SOS, который хорошо виден как линия в спинном глазу. К 28 часам после оплодотворения в диком типе зебры, окрашивание ламинина ясно демонстрирует, что SOS полностью закрыта, что делает это идеальным этапом для мониторинга задержек в закрытии трещины. Инъекция расширенной GFP-CAX mRNA позволяет визуализировать клеточные мембраны живого или фиксированного эмбриона для отслеживания изменений в морфологии клеток, которые приводят к закрытию SOS.Визуализация SOS может быть трудной, так как она узкая и преходящая. Тем не менее, крайне важно, чтобы вы поддерживаете последовательный метод скоринга при оценке задержек закрытия в более поздних точках времени. Эти методы могут сочетаться с экспериментальными манипуляциями для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на надлежащее образование и закрытие SOS.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Оценка материнской сосудистого ремоделирования во время беременности в матке мышей

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...