Name: visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), naturliga vetenskaper och Engineering Research rådet (NSERC), Alberta utvecklar teknik Futures, och kvinnor och barns hälsa Research Institute (WCHRI).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av University of Alberta djur vård och användning kommittén.
1. protokoll 1: Visualisering av SOS med hjälp av stereomicroscopy och differentiell störningar kontrast (DIC) imaging
<ol><li>Embryosamlingsgruppen<ol>
<li>I en tank dechlorinated vatten, förbereda korsningar av gdf6a+/- Zebrafiskar på kvällen genom att para ihop en manlig Zebrafiskar med en kvinnlig Zebrafiskar. Var noga med att skilja hanen från honan m...

<ol>
	<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+eye+development+in+vertebrates.">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li><li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+genes+and+known+syndromes.">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li><li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+coloboma:+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience.">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li><li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+colobomata.">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li><li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+microphthalmia,+anophthalmia+and+coloboma.">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li><li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+coloboma:+clinical+and+basic+science+update.">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li><li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature.">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li><li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma,+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye.">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li><li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish.">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+visual+system.">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li><li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye.">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10:+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy.">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).</li><li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo.">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).</li></ol>

Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att följa SOS i det växande embryot Zebrafiskar. För att avgöra stängningen försening fenotyper, har våra protokoll fokuserat på förmågan att särskilja separation av två diskreta lober av dorsala-nasala och dorsal-temporal sidor av ögat, liknande tekniker används för att visualisera koroidea fissur stängningen försening fenotyper i ventrala ögat.
Dessa visualiseringstekniker kan användas tillsammans med en mängd genet...

Bildandet av vertebrate ögat är en mycket process där noggrant iscensatta intercellulära signalvägar upprätta vävnadstyper och ange regional identitet1. Störningar till tidig ögat morfogenes resultera i djupa defekter till arkitekturen i ögat och är ofta bländande2. En sådan sjukdom resulterar från underlåtenhet att stänga den koroidea okulära sprickan i ventrala sida av optic cup3. Denna sjukdom, som kallas okulär coloboma, uppskattas förekomma hos 1 av 4-5000 levande födda och orsak 3-11% av pediatrisk blindhet, ofta manifesterar sig som ett nyckelhål-liknande struktur som sticker ut inferiorly från eleven i mitten av ögat4, 5,6. Funktionen av koroidea spricka är att ge en startpunkt för tidig vaskulatur växer i optic koppen, varefter sidorna av sprickan kommer säkring för att innesluta den fartyg7.
Medan okulär coloboma har varit känt sedan urminnes tider, har vi nyligen identifierat en roman delmängd av coloboma patienter med vävnad förlust påverkar den superior/dorsala aspekten av ögat. Senaste arbete i vårt labb har lett till upptäckten av en okulär struktur i Zebrafiskar dorsala ögat, som vi kallar den överlägsna okulär sulcus (SOS) eller överlägsna spricka8. Det är viktigt att notera att strukturen har egenskaper från både en sulcus och en spricka. Liknar en sulcus, det är en kontinuerlig vävnad skikt som spänner från nässlemhinnan på tidsmässiga näthinnan. Dessutom stängningen av strukturen är inte medieras av en fusion av de två motsatta basalmembranet, och det verkar kräva en morphogenetic process genom vilken struktur är befolkad av celler. Dock liknar en spricka, det bildar en struktur som skiljer nasal och tidsmässiga sidorna av dorsala ögat med basalmembranet. För konsekvens hänvisar vi till det som SOS i denna text.
SOS är evolutionärt bevarad över ryggradsdjur, att vara synlig under ögat morfogenes i fisk, chick, newt och mus8. I motsats till den koroidea spricka, som finns från 20-60 timmar efter befruktning (hpf) i Zebrafiskar, SOS är mycket övergående, lätt synlig från 20-23 hpf och frånvarande av 26 hpf8. Senare forskning i vårt labb har funnit att, liknar den koroidea sprickan, SOS spelar en roll i vaskulär vägledning under ögat morfogenes8. Även om de faktorer som styr bildandet och nedläggning av SOS inte är ännu helt klarlagda, våra data Markera roller för dorsal-ventrala öga mönstring gener8.
Zebrafisk är en utmärkt modellorganism att studera SOS. Som modellsystem, det ger ett antal fördelar i att studera ögats utveckling: det är en vertebrate modell; varje generation uppvisar hög fruktsamhet (~ 200 embryon). dess arvsmassa har varit fullt sekvenserade, vilket underlättar genetisk manipulation; och cirka 70% av mänskliga gener har minst en Zebrafiskar orthologue, vilket gör det till en idealisk genetik-baserad modell av mänskliga sjukdomar9,10. Viktigast av allt, dess utveckling sker externt till mamman, och dess larver är transparenta, vilket möjliggör visualisering av utveckla ögat med relativ lätthet11.
I denna uppsättning protokoll beskriver vi de metoder genom vilka SOS kan visualiseras i Zebrafiskar larver. Olika visualiseringstekniker som används i denna rapport gör att tydlig observation av SOS under normala ögats utveckling, liksom förmågan att upptäcka SOS stängning defekter. Våra exempel protokoll kommer att innehålla undersökningar av Gdf6, BMP lokaliserad till den dorsala öga och kända regulator av SOS nedläggning. Ytterligare, dessa tekniker kan kombineras med experimentella manipulationer för att identifiera genetiska faktorer eller farmakologiska medel som påverkar korrekt SOS bildandet och stängning. Vi har dessutom inkluderat ett protokoll genom vilket den fluorescerande avbildning av alla cellmembran är möjligt, att låta försöksledaren att iaktta morfologiska förändringar i celler som omger SOS. Vårt mål är att fastställa en uppsättning standardiserade protokoll som kan användas i hela det vetenskapliga samfundet för att erbjuda nya insikter i denna nya struktur i utvecklingsländer ögat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>AGA001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC/Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioImager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 1545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1752-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-laminin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO Dnase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure low-melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the superior ocular sulcus during danio rerio embryogenesis

Medfödd okulär coloboma är en genetisk sjukdom som observeras vanligtvis som en skreva i sämre aspekt av ögat följd av ofullständig koroidea fissur stängning. Nyligen, identifiering av individer med coloboma i överlägsen aspekten av iris, näthinnan och linsen som ledde till upptäckten av en ny struktur, kallad den överlägsna spricka eller överlägsen okulär sulcus (SOS), som tillfälligt finns på den dorsala aspekt av optic cup under ryggradsdjur öga utveckling. Även om denna struktur är bevarad över möss, chick, fisk och newt, är vår nuvarande förståelse av SOS begränsad. För att belysa faktorer som bidrar till dess bildande och nedläggning, är det absolut nödvändigt för att kunna följa det och identifiera avvikelser, såsom fördröjning i stängningen av SOS. Här, syftar vi till att skapa en standardiserad serie av protokoll som kan användas för att effektivt visualisera SOS genom att kombinera allmänt tillgängliga mikroskopi tekniker med gemensamma molekylärbiologiska tekniker såsom Immunofluorescerande färgning och mRNA överuttryck. Medan denna uppsättning protokoll är inriktad på förmågan att iaktta SOS stängningen försening, det är anpassningsbar till de experimenter's behov och kan enkelt ändras. Sammantaget hoppas vi skapa en lättillgänglig metod genom vilken vår förståelse av SOS kan föras fram för att expandera den aktuella kunskapen om ryggradsdjur öga utveckling.

Zebrafiskar SOS visas 20 hpf i presumtiva dorsala retina8. Av 23 hpf SOS övergångar från dess ursprungliga smala arkitektur till en bred indrag och 26 hpf är inte längre synlig8. Därför, för att undersöka SOS under normala Zebrafiskar öga utveckling, embryon måste observeras mellan 20-23 hpf. Under denna period är SOS observerbar via mikroskopet dissekera och DIC imaging som en tunn linje i dorsala ögat som separerar de nasala o...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis at JoVE.com

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualisering av Superior okulär Sulcus under Danio rerio embryogenes

Här presenterar vi en standardiserad serie av protokoll att iaktta den överlägsna okulära sulcus, en nyligen identifierade, evolutionärt bevarade struktur i ryggradsdjur öga. Med Zebrafiskar larver, demonstrerar vi tekniker behövs för att identifiera faktorer som bidrar till bildning och stängning av den överlägsna okulära sulcus.

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Denna uppsättning av standardiserar protokoll kan användas för att erbjuda ny insikt i den överlägsna okulär sulcus, eller SOS, en nyligen upptäckt struktur av det utvecklande ögat. Dessa protokoll kommer att tillåta alla experimenter runt om i världen att tydligt visualisera SOS under zebrafish ögonutveckling. Börja med att placera heterozygous tillväxt differentiering faktor sex En manlig och kvinnlig zebrafisk på separata sidor av en avdelare i en tank av deklorerat vatten kvällen innan deras parning.Nästa morgon, ta bort avdelaren och låt fisken att häcka i högst 30 minuter. Vid slutet av avelsperioden, samla embryona i Petri-rätter som innehåller E3 medium för deras inkubation i en 28,5 graders inkubator. Vid 20 timmar efter befruktning, ersätta supernatanten med E3 medium kompletteras 0,004%1-Phenyl-2-thiourea att förhindra pigmentproduktion och undersöka embryon genom ljusmikroskopi för att bekräfta de är alla på lämpligt utvecklingsstadium.Placera proverna under ett dissekerande mikroskop. Kassera alla utvecklingsmässigt omogna embryon och använd fina tång för att försiktigt dra isär chorions. Visualisera SOS, som kan visas som ett indrag eller linje vid ögats ryggmarginal.Sedan sortera embryon som visar SOS stängning dröjsmål från dem som inte gör det. För att fotografera dessa embryon med hjälp av ett dissekerande mikroskop, förbereda en Petri-rätt som innehåller 1%agaros i E3 medium och lätt prick mitten av agaros för att skapa ett grunt hål där äggulan av embryot kan placeras. Placera sedan ett sövt embryo i senare tid på agarosen.För att avbilda embryona med hjälp av ett sammansatt eller konfokalmikroskop, överför ett embryo till en 35 millimeter petriskål som innehåller en liten bolus av icke-gelerad 1%-låg smältpunkt uppstod i E3-medium och använd fin fiskelina för att snabbt placera embryot i lateralt läge. När agaros har svalnat, häll tillräckligt E3 medium i skålen för att täcka agaros och använda en 20x vatten nedsänkning objektiv för att visualisera SOS. Efter avbildning, dra försiktigt agarose från embryot och fixera vävnaden i 4%paraformaldehyd eller låta zebrafisken fortsätta sin utveckling.För att visualisera SOS genom fluorescerande mRNA-uttryck, använd en mikroinjektionsapparatur för att injicera 300 piogram av förstärkt GFP-CAX mRNA i embryon på encellsstadiet. Använd sedan ett fluorescerande stereoscope för att skärmen för embryon med ljust förstärkt GFP-uttryck och få bilder av embryona genom en av de bildframställningsmetoder som visats. För fullmontering immunofluorescent färgning av embryonala zebrafisk laminin, dehorionate embryona som visat och fixera embryon i en microcentrifug rör i nyligen beredda 4%paraformaldehyd i två timmar på en rumstemperatur shaker.Vid slutet av fixeringen, tvätta embryona fyra gånger i PBS plus Tween, eller PBST, i fem minuter per tvätt följt av permeabilisering i 10 mikrogram per milliliter eller Proteinase K vid rumstemperatur i fem minuter. Tvätta de permeabilized embryona fyra gånger i PBST som visats och blockera embryon i 5%get serum och två milligram per milliliter av nötkreatur serum albumin i PBST för en till två timmar på en rumstemperatur shaker. I slutet av blockeringsinkubationen inkuberar du embryona i den primära anti-lamininantikroppen av intresse vid fyra grader Celsius över natten på en shaker.Nästa morgon, tvätta embryon fem gånger i PBST i 15 minuter per tvätt och märka vävnaderna med en lämplig sekundär antikropp över natten vid fyra grader Celsius på shaker skyddas från ljus. Nästa morgon, tvätta embryon fyra gånger i PBST i 15 minuter per tvätt och placera embryon i en liten petriskål som innehåller färska PBST. Med hjälp av fina tuppar, försiktigt störa äggulorna och ta bort äggula cellerna genom mild skrapning av äggula säckar.Överför de avyolkade embryona till nyberedd 30%glycerol i PBS, se till att placera embryona ovanpå lösningen och överföra så lite av den tidigare lösningen som möjligt och vänta på att embryona sjunker till botten av röret. När embryona har nått botten av behållaren, överför dem till sekventiella 50%och 70%glycerol i PBS-lösningar, som just visat. Efter att embryona har sjunkit till botten av 70%glycerol behållaren, överför proverna till en liten plast skålen för dissektioner och bryta embryona posterior till hindbrains.Med hjälp av fina dissektionsverktyg, flytta ett huvud till en glasrutschbana med så lite glycerol som möjligt och försiktigt sätta in en fin minutien stift i framhjärnan ventrikel från det inre, trycka nedåt för att separera höger och vänster halvor av huvudet från varandra. När huvudet har helt filead ner mittlinjen, montera varje sida av huvudet mittlinjen ner, öga-sida upp. SOS är observerbara genom dissekera mikroskop vid 20 till 23 timmar efter befruktning och via differentiell inblandning kontrast imaging som en tunn linje i dorsala ögat som skiljer nasala och temporala halvor av utvecklande näthinnan.Dessutom kan en subtil indrag vara synlig i dorsala gränsen för ögat. Efter immunofluorescerande färgning av laminin, kan den tunna linjen bekräftas som källaren membran. När SOS-stängningen fördröjs kan dess långvariga närvaro observeras som en uttalad klyfta i ögats dorsala sida under ett dissekerande mikroskop.När observeras under en sammansatt mikroskop med hjälp av differentialinterdistanser kontrast imaging, denna funktion är ännu mer framträdande med nasala och tidsmässiga sidorna av ögat åtskilda av SOS, som är tydligt synlig som en linje i dorsala ögat. Genom 28 timmar efter befruktning i vildtyp zebrafisk, visar laminin färgning tydligt att SOS är helt stängd, vilket gör detta till den idealiska scenen för övervakning förseningar i spricka stängning. Injektionen av förstärkt GFP-CAX mRNA möjliggör visualisering av cellmembranen av levande eller fast embryo för spårning av förändringar i morfologin hos de celler som leder till SOS-stängning.Visualisering av SOS kan vara svårt, eftersom det är smalt och övergående. Det är dock absolut nödvändigt att du behåller en konsekvent bedömningsmetod när du utvärderar fördröjningar för stängning vid senare tidpunkter. Dessa tekniker kan kombineras med experimentella manipulationer för att identifiera genetiska faktorer eller farmakologiska medel som påverkar korrekt SOS-bildning och stängning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Bedömning av Maternal kärlremodellering under graviditeten i musen livmoder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metod för att karaktärisera embryogenes i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM och Microrheology i cellen zebrafiskar Embryo äggula

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analys av hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes använder hela Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...