Name: co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue
Uploaded: 2019-02-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (til K.S.).

Alle prosedyrer som inneholder dyr fag er godkjent av dyr velferd komiteen av University of Texas Health Science Center i Houston (dyr Protokollnummer: AWC-18-0057).
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4): for å gjøre 1 L 1 x PBS, oppløse 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann. Justere pH 7.4 og fyll med destillert vann å oppnå et endelig antall 1 L.</li>
	<li>1% parafo...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+and+obesity.">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotrophin+triggers+adipose+tissue+fibrosis+and+metabolic+dysfunction.">Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction.</a> Nature Communication. 5, 3485 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+functions+of+endotrophin+on+different+cell+populations+in+adipose+tissue.">Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Overexpression+of+VEGF-A+in+Adipose+Tissue+Promotes+Energy+Expenditure+via+Activation+of+the+Sympathetic+Nervous+System.">Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System.</a> Molecular and Cellular Biology. , (2018).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-independent+angiogenesis+in+adipose+tissues+during+cold+acclimation.">Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+TDRG1+enhances+tumorigenicity+in+endometrial+carcinoma+by+binding+and+targeting+VEGF-A+protein.">LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein.</a> BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+effects+of+VEGF-A+on+adipose+tissue+dysfunction.">Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).</li><li>During, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+VEGF+Links+the+White-to-Brown+Fat+Switch+With+Environmental,+Genetic,+and+Pharmacological+Stimuli+in+Male+Mice.">Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice.</a> Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).</li><li>Elias, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+protects+against+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).</li><li>Sung, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vascular+functions+in+modulation+of+obesity,+adipose+metabolism,+and+insulin+sensitivity.">Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+derived+VEGF-A+modulates+cold+tolerance+and+energy+expenditure.">Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure.</a> Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+neuro-adipose+connections+mediate+leptin-driven+lipolysis.">Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis.</a> Cell. 163 (1), 84-94 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>An, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+in+white+adipose+tissue+improves+metabolic+homeostasis+through+enhanced+angiogenesis.">Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li></ol>

Fettvev remodeling er direkte knyttet til metabolske feilregulering under fedme utvikling1,2. Angiogenese og sympatisk gir er både viktig for dynamisk remodeling prosessen2,12. Derfor utvikler en gjeldende tilnærming for å se den nye blodkar, samt nerve fiber er av stor betydning. Metodene er rapportert for å dokumentere angiogenese i fettvev. Imidlertid fortsatt noen problemer med disse tilnærminger...

Fettvev har metabolske og endokrine fungerer1. Det dynamisk utvides eller forminskes svar på ulike næringsstoffer understreker2. Aktive vev remodeling prosessen består av flere fysiologiske baner/trinn inkludert angiogenese fibrose og utformingen av lokale inflammatorisk microenvironments2,3,4. Noen fysiske stimuli, som kaldt eksponering og mosjon, kan utløse sympatisk aktivisering, som til slutt fører til dannelse av nytt blod fartøy og sympatisk gir i liggende under adipose vev5,6. Prosessene remodeling er knyttet tett til systemisk metabolsk resultater inkludert insulinfølsomhet, kjennetegnet av type 2 diabetes2. Dermed er visualisering av disse patologiske forandringer svært viktig å forstå sunne status for hele liggende under adipose vev.
Angiogenese er prosessen av nytt blod fartøy formasjon. Siden blodkar skaffe oksygen, næringsstoffer, hormoner og vekstfaktorer til vev, angiogenese har vært ansett som et viktig skritt i fettvev remodeling, som har blitt dokumentert med ulike teknikker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. det beholdes imidlertid spørsmål om oppløsningen på bildene, effektiviteten av immunostai- og metoder for kvantifisering av fartøyet. Sammenlignet med nytt blod fartøy formasjon, har gir i fettvev vært undervurdert i lang tid. Nylig Zeng et al. 14 brukes Avansert intravital to-fotonet mikroskopi og vist at adipocytter er omgitt av lag av nerve fibre14. Siden da begynte forskere å verdsette den avgjørende rollen sympatisk gir i regulering av fettvev fysiologi. Derfor er det viktig å utvikle en enkel og praktisk tilnærming til dokumentet adipose nerve gir.
Her rapporterer vi en optimalisert metode for den co flekker av blod fartøy og nerve fiber basert på våre tidligere protokoller. Med denne metoden kan vi oppnå klare bilder av blod fartøy og nerve fiber uten støyende bakgrunn. Dessuten får vi en oppløsning som er høy nok til å utføre kvantitativ måling av tettheter med åpen kildekode. Ved hjelp av denne nye tilnærmingen, kan vi kunne sammenligne strukturer og tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige adipose depoter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Lot: 116969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Lot: 121944</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira 6.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Licensed software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angio tool</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Open source software 
			https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>R&#38;D research system</td>
			<td>AF4666</td>
			<td>Lot: CAAS0115101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>P40101-150</td>
			<td>Lot: aj01215y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses high performance, D=0.17mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>High-viscosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde,16%</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>170215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>P24744</td>
			<td>Silicone isolator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37527X3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path IV Tissue Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton &#935;-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Generic term: octoxynol-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator and rotisseries</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Generic term: Polysorbate 20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue

Nyere studier har fremhevet kritisk rolle angiogenese og sympatisk gir i fettvev remodeling under utviklingen av fedme. Det er derfor nødvendig å utvikle en enkel og effektiv metode for å dokumentere de dynamiske endringene i fettvev. Her beskriver vi en modifisert immunofluorescent tilnærming som effektivt co flekker blod fartøy og nerve fiber i liggende under adipose vev. Sammenlignet med tradisjonelle og nylig utviklet metoder, er vår tilnærming relativt enkle å følge og mer effektive i merking blodkar og nervefibrene med høyere tetthet og mindre bakgrunn. Videre tillater høyere oppløsning av bildene ytterligere oss å måle nøyaktig området av fartøy, mengde forgrening, og lengden på fiber av open source programvare. Som en demonstrasjon ved hjelp av vår metode, viser vi den brune fettvev (BAT) inneholder større mengder blod fartøy og nerve fibre sammenlignet med hvit fettvev (WAT). Vi videre finner at blant WATs, subkutan WAT (sWAT) har mer blod fartøy og nerve fiber i forhold til epididymal WAT (eWAT). Vår metode gir dermed et nyttig verktøy for å undersøke fettvev remodeling.

Den distale regionen epididymal hvite fettvev (eWAT), mediale regionen dorsolumbar subkutan hvit fettvev (sWAT) og mediale regionen interscapular brun fettvev (BAT) ble samlet. Stedene for å samle disse vev angis i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59266/59266fig1.jpg"> Figur 1: anatomi av subkutan hvit fettvev (sWAT), epididymal hvit fettvev (eWAT) og b...

Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Nytt blod fartøy dannelse og sympatisk gir spille viktige roller i fettvev remodeling. Det gjenstår imidlertid tekniske problemer i visualisere og kvantitativt måle fettvev. Her presenterer vi en protokoll for å kunne merke og kvantitativt sammenligne tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige liggende under adipose vev.

Co flekker blod fartøy og Nerve fiber i fettvev

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Nyere studier har fremhevet den kritiske rollen angiogenese og sympatisk innovasjon i Fettvev remodeling under utviklingen av fedme. Her demonstrerer vi en modifisert immunofluorescence metode som effektivt står blodkar og nervefibre i fettvev. Vår tilnærming er rett frem og effektiv uten kompromisser om stående effektivitet og kvaliteten.Vi kjøper bildene ved hjelp av konfokal mikroskopi. Den høye oppløsningen av bildene tillater oss å rekonstruere blodkarnettverkene og nøyaktig analysere egenskapene. Begynn denne prosedyren med anestesi og perfusjon av seks ukers C57 Black-6J hannmus som beskrevet i tekstprotokollen.Dissekere hvite og brune fettproblemer fra musene. Bruk saks for å bryte vevsprøvene i små biter av biter. Overfør de små bitene med de steriliserte pinsettene inn i vevsinnbyggingskassettene med riktig merking av vevsprøvene på kassettene.Dypp de innebygde kassettene som inneholder vevsprøver i fikseringsløsningen ved fire grader celsius i 24 til 48 timer. Overfør de små biter ble sterilisert pinsett til en petriskål. Vask prøvene 3 ganger med børste 1x PBS buffer ved 0,5 milliliter per vask.Skjær nå de faste vevsprøvene i omtrent to kubikkmillimeter med den steriliserte saksen. For permeabalisering, overfør prøvene til et 1,5 milliliter rør som inneholder en milliliter 1% Triton PBS-buffer og roter forsiktig rørene ved romtemperatur i 1 time ved 18 RPM. Etter en time forsiktig fjerne 1% Triton PBS buffer ved aspirasjon vaske prøvene tre ganger ved å legge 1x PBS direkte inn i de samme rørene.Under hver vask, inverter rørene flere ganger. For blokkering, tilsett 0,5 milliliter blokkerende buffer til prøvene og inkubatoren ved romtemperatur i to timer med mild rotasjon. For å forberede 0,4 milliliter primær antistoffoppløsning, fortynne to mikroliter anti Endomusin og to mikroliter antityrosinhydroksylase antistoffer til 396 mikroliter blokkerer buffer.Vortex og spinne ned for å gjenopprette volumet. Fjern nå blokkeringsbufferen forsiktig fra vevsbitene. Tilsett 100 mikroliter av den tilberedte primære antistoffløsningen i rør og inkuber ved fire grader celcius over natten.Neste dag, nøye samle den primære antistoffløsning for gjenbruk hvis ønskelig. Vask prøvene tre ganger med 1x PBST ved 500 mikroliter per vask i 30 minutter med skånsom rotasjon ved 18 O/min. For fremstilling av sekundære antistoffer løsning, fortynne to mikroliter av flouro-flouro konjugert anti-gud IGG i to mikroliter av flouro-flouro konjugert anti-rabiat IGG i 396 mikroliter av blokkerer buffer.Vortex og spinn kort for å samle all væsken. Fjern nå den siste vaskebufferen fra prøvene. Tilsett 100 mikroliter sekundær antistoffoppløsning i rørene.Inkuber prøvene ved romtemperatur i to timer med skånsom rotasjon ved 18 O/min. Etter nøye fjerning av den sekundære antistoffoppløsningen, vask prøvene tre ganger med 1x PBST ved 500 mikroliter per vask i 30 minutter hver med skånsom rotasjon ved 18 RPM. For optisk klaring, dypp prøvene i en milliliter på 90% glyserol og hold prøvene på fire grader celcius i mørket til de blir gjennomsiktige.Legg her en silisiumisolator til lysbildet for å skape en brønn for volumavbildning. Hold høyden på silikonet til eller litt mindre enn prøvens høyde. Overfør prøvene forsiktig til brønnen og fyll den med monteringsmediet.Legg en dekkslipp på overflaten og forsegle kvartalene av dekkglasset med høy viskositetsmedium. La monteringsmediet kurere i 24 timer ved romtemperatur og mørke. Etter at herdingen er fullført, forsegler du kantene på dekkglasset for optimal prøveleve levetid.Få Z stabel bilder med 20 ganger målet om et konfokal mikroskop og tilsvarende programvare. Start systemet. Klikk på konfigurasjonsfanen og aktiver både Argon laser og He-Ne 633 laser.Klikk på hent fanen. I det synlige laserlinjer-panelet flytter du glidebryterne med tilsvarende intensitet opp for å velge laserlinjene opp 488 nanometer og 633 nanometer. I utgangspunktet intensitetene kan settes til 20 til 30%Nå velger du 488, 561, 633 trippeldichroic speil.Aktiver bildemultiplikatorene ved å klikke på de aktive avmerkingsboksene. Velg photomultiplier en for utslipp utøves av 488 nanometer laser og photomultiplier 34 for at av 633 nanometer laser. Sett bølgelengdeområdet til mellom 500 og 550 nanometer for fotomultiplikator en.I 650 til 750 nanometer, for foto multiplikator tre. Velg pseudofargen som skal brukes til bildevisning, ved å dobbeltklikke på det fargede rektangelet ved siden av hver bildemultiplikator og velge en farge fra hurtigmenyen. Klikk nå på live for å sjekke bildet på prøvene.Bruk Z-posisjonsnob til å velge et fokusplan i XY-området av interesse. Juster lysstyrken på bildene ved å dreie laserintensiteten, smart forsterkning og offset. Utfør denne justeringen under visningsmodusen for hurtigoppslagstabellen for hver fluorescenskanal.Klikk på den raske oppslagstabellknappen for å gå inn i hurtigoppslagstabellmodusen der mettede piksler vises i blått for å hjelpe innstillingen av riktig lysstyrkenivå. Klikk to ganger på den raske oppslagstabellknappen for å gå tilbake til pseudofargevisningsmodus. Mens du skanner, dreier du Z-posisjonsnob mot klokken for å flytte fokusplanet til den ene enden av interessevolumet.Klikk deretter på endepilhodet for å angi skanning og posisjon. Vri Z-posisjonsnoben med klokken for å flytte fokusplanet gjennom prøven til den andre enden av interessevolumet. Klikk deretter på startpilhodet for å angi skanneopp begynneposisjon.Juster Z-trinnstørrelsen til tre mikron. Endre bildekvaliteten ved å velge et format på 1024 x 1024, En hastighet på 100 Hz og et linjegjennomsnitt på to. Velg start for å starte Z-stakken bildeanskaffelse For maksimal projeksjon av den anskaffede bildestakken, Klikk på prosessfanen og deretter verktøy;velg 3D-projeksjon og skriv inn maksimum i metodelisten uten endringer til X, Y og Z.Set terskel til null, klikk på bruk.Maksimal intensitet av Z-volumet vil bli stablet inn i et 2D-bilde som vises. Hvis du vil analysere 2D-bildene via programvare med åpen kildekode, åpner du de stablede bildene i programvaren. Juster fartøyets diameter og intensitet til alle fartøysstrukturer kan velges riktig.Velg kjør analyse og eksporter dataene etter veiledning av programvaren. Hvis du vil analysere 3D-bildene via lisensprogramvaren, åpner du rådataene til bilder med programvaren. Juster intensitetsterskelen og andre parametere til karstrukturene i hvert lag av Z-volumet er riktig segmentert.Skeletonize den resulterende binarised bildestakken for å få en spesiell graf. Analyser de valgte segmentegenskapene og eksporter dataene etter veiledning av programvaren. Den distale regionen epididymale hvite fettvev, medial regionen av dorsal lumbal subkutant hvitt fettvev og medial regionen av intra-scapular brun fettvev ble samlet.Etter en hel mount farging, ble vev trunker montert og avbildet med konfokal mikroskop. Flere blodårer var positivt farget. Med anti-endomusin antistoff i glyserol inkubert subkutant hvitt fettvev, noe som tyder på at clearing trinnet er avgjørende for fullstendig farging av blodkarene.For å avgjøre om blodkar og nervefibre viser forskjellige mønstre blant deponene med denne metoden, ble det utført kommunal fluorescensfarging i fettvev med antistoffer med anti-Endomusin for å vise blodkar og med antitytyrosinhydroksylase for å vise nervefibre. Interessant, resultatene viser at de var betydelig flere blodårer enn nervefibre i brunt fettvev sammenlignet med hvitt fettvev. Blant det hvite fettvevet viste det subkutane hvite fettvevet høyere blodkaretetthet enn det epididymale hvite fettvevet.Merk, mens nervefibrene ekspanderte parallelt med blodårene, viste de ikke signifikant sam lokalisering. Karområdet, antall veikryss og rørlengde ble deretter kvalitativt målt med 2D-metoden i disse tre typene fettvev og fant lignende resultater. Denne metoden effektivt cos-hi blodkar og nervefibre og fettvev.Det høres ut som et nyttig verktøy for å studere den dynamiske endringen i fettvev under utviklingen av fedme. Kraftig munnhy-de er giftig. Vennligst utfør P-ifa involvert trinn i en En bredere hudkontakt og og innånding og riktig håndtere P-ifa Fordi laserstrålene har blitt fokal mikroskop, men skade øyet.Unngå øyeeksponering for bjelkene som kommer fra målet,

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av fettvev immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Bruk av en Monocyte ett lag Assay å evaluere Fcy Receptor-mediert Fagocytose

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...