Name: co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue
Uploaded: 2019-02-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (НИЗ) Грант R01DK109001 (к.с.).

Все процедуры, содержащие животных темы были одобрены центра науки здоровья животного благосостояния Комитет из университета Техаса в Хьюстоне (животных протокол номер: AWC-18-0057).
1. Реагент подготовка
<ol><li>1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4): сделать 1 Л ПБС, распустит?...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+and+obesity.">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotrophin+triggers+adipose+tissue+fibrosis+and+metabolic+dysfunction.">Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction.</a> Nature Communication. 5, 3485 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+functions+of+endotrophin+on+different+cell+populations+in+adipose+tissue.">Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Overexpression+of+VEGF-A+in+Adipose+Tissue+Promotes+Energy+Expenditure+via+Activation+of+the+Sympathetic+Nervous+System.">Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System.</a> Molecular and Cellular Biology. , (2018).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-independent+angiogenesis+in+adipose+tissues+during+cold+acclimation.">Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+TDRG1+enhances+tumorigenicity+in+endometrial+carcinoma+by+binding+and+targeting+VEGF-A+protein.">LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein.</a> BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+effects+of+VEGF-A+on+adipose+tissue+dysfunction.">Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).</li><li>During, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+VEGF+Links+the+White-to-Brown+Fat+Switch+With+Environmental,+Genetic,+and+Pharmacological+Stimuli+in+Male+Mice.">Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice.</a> Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).</li><li>Elias, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+protects+against+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).</li><li>Sung, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vascular+functions+in+modulation+of+obesity,+adipose+metabolism,+and+insulin+sensitivity.">Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+derived+VEGF-A+modulates+cold+tolerance+and+energy+expenditure.">Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure.</a> Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+neuro-adipose+connections+mediate+leptin-driven+lipolysis.">Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis.</a> Cell. 163 (1), 84-94 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>An, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+in+white+adipose+tissue+improves+metabolic+homeostasis+through+enhanced+angiogenesis.">Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li></ol>

Ремоделирование жировой ткани непосредственно связан с метаболической dysregulation во время развития ожирения1,2. Ангиогенез и симпатической иннервации, так необходимых для динамических ремоделирования процесс2,12. Таким образ...

Жировая ткань имеет ключ, метаболические и эндокринные функции1. Она динамически расширяет или сжимает в ответ на различные питательные подчеркивает2. Активный ткани, remodeling процесс состоит из нескольких физиологические пути/шаги включая ангиогенеза, фиброза и формирование местных воспалительных микросреды2,3,4. Некоторые физические раздражители, как холодная воздействием и упражнения, могут вызвать Симпатическая активация, которая в конечном итоге приводит к образованию новой крови судна и симпатической иннервации в жировых тканях5,6. Эти процессы ремоделирования, тесно связаны с системных метаболических исходов, включая чувствительность инсулина, отличительной чертой 2 диабета типа2. Таким образом визуализация этих патологических изменений очень важно для понимания здоровое состояние всей жировой ткани.
Ангиогенез-это процесс формирования новой крови судна. Так как кровеносные сосуды обеспечивают кислорода, питательных веществ, гормонов и факторов роста тканей, ангиогенез считается ключевым шагом в жировой ткани реконструкции, которая документально с различными методами6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, остаются вопросы о разрешение изображений, эффективности иммуноокрашивания и методы для количественного определения плотности судна. По сравнению с корабля Нью кроветворения, долгое время была недооценена иннервации в жировой ткани. Недавно Цзэн и др. 14 используется расширенный прижизненной микроскопии двух фотонов и продемонстрировал, что адипоцитов окружены слоя нервных волокон14. С тех пор исследователи начали ценить ключевую роль симпатической иннервации в регуляции физиологии жировой ткани. Таким образом развитие простой и практический подход к документ жировой нервной иннервации имеет важное значение.
Здесь мы приводим оптимизированный метод для совместного окрашивания кровеносных сосудов и нервных волокон, основанный на наших предыдущих протоколов. С помощью этого метода мы можем добиться четких изображений кровеносных сосудов и нервных волокон без шумной фона. Кроме того мы получаем резолюции, что является достаточно высоким для выполнения количественных измерений плотности с открытым исходным кодом. С помощью этого нового подхода, мы успешно можно сравнить структуры и плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых депо.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Lot: 116969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Lot: 121944</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira 6.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Licensed software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angio tool</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Open source software 
			https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>R&#38;D research system</td>
			<td>AF4666</td>
			<td>Lot: CAAS0115101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>P40101-150</td>
			<td>Lot: aj01215y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses high performance, D=0.17mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>High-viscosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde,16%</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>170215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>P24744</td>
			<td>Silicone isolator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37527X3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path IV Tissue Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton &#935;-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Generic term: octoxynol-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator and rotisseries</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Generic term: Polysorbate 20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue

Недавние исследования выявили важную роль по ангиогенез и симпатической иннервации в жировой ткани реконструкции в ходе развития ожирения. Таким образом необходим простой и эффективный метод для документирования динамичные изменения в жировой ткани. Здесь мы описываем модифицированных immunofluorescent подход, который эффективно совместно пятна кровеносных сосудов и нервных волокон в жировых тканях. Наш подход по сравнению с традиционными и недавно разработанных методов, и относительно легко следовать и более эффективным в маркировке кровеносных сосудов и нервных волокон с более высокой плотностью и меньше фона. Кроме того более высокое разрешение изображений далее позволяет нам точно измерить площадь судов, количество ветвления, а длина волокон с открытым исходным кодом. В качестве демонстрации с помощью нашего метода мы покажем что коричневая жировая ткань (BAT) содержит большее количество кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с белой жировой ткани (Ват). Мы также найти, что среди WATs, подкожной Ват (спецназ) имеет более кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с эпидидимальных Ват (eWAT). Наш метод таким образом служат полезным инструментом для изучения ремоделирования жировой ткани.

Были собраны дистальной эпидидимальных белой жировой ткани (eWAT), медиальной регионом дорсально подкожной белой жировой ткани (спецназ) и медиальной региона межлопаточной коричневая жировая ткань (BAT). Места для сбора этих тканей, указаны на рисунке 1.
...

Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Формирование новой крови судна и симпатической иннервации играть решающую роль в реконструкции жировой ткани. Однако остаются технические вопросы в визуализации и количественном измерении жировой ткани. Здесь мы представляем протокол успешно ярлык и количественно сравнить плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых тканях.

Совместное окрашивание кровеносных сосудов и нервных волокон в жировой ткани

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Недавние исследования подчеркнули важную роль ангиогенеза и симпатической инновации в адиповозной ткани ремоделирования во время развития ожирения. Здесь мы демонстрируем модифицированный метод иммунофлуоресценции, который эффективно стоит кровеносных сосудов и нервных волокон в жировой ткани. Наш подход является прямым и эффективным без какого-либо компромисса по эффективности и качеству.Мы приобретаем изображения с помощью конфокальные микроскопии. Высокое разрешение изображений позволяет реконструировать сети кровеносных сосудов и точно проанализировать его характеристики. Начните эту процедуру с анестезии и перфузии шестинедельных мышей C57 Black-6J, как описано в текстовом протоколе.Рассекают белые и коричневые жировые проблемы с мышами. Используйте ножницы, чтобы разбить образцы тканей на мелкие кусочки куска. Перенесите небольшие куски с стерилизованным пинцетом в ткань, встраивая кассеты с надлежащей маркировкой образцов тканей на кассетах.Погрузите встроенные кассеты, содержащие образцы тканей, в раствор фиксации при четырех градусах по Цельсию в течение 24-48 часов. Передача небольших кусков была стерилизована пинцетом в чашку Петри. Вымойте образцы 3 раза с помощью буфера 1x PBS на 0,5 миллилитров за стирку.Теперь разрежьте образцы фиксированной ткани примерно на два кубических миллиметра кубиками с стерилизованными ножницами. Для пермебализации перенесите образцы в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр буфера 1%Triton PBS, и аккуратно поверните трубки при комнатной температуре в течение 1 часа при 18 об/мин. Через час тщательно удалите 1%Triton PBS буфер путем аспирации мыть образцы три раза, добавив 1x PBS непосредственно в те же трубы.Во время каждой стирки, инвертировать трубки несколько раз. Для блокировки добавьте 0,5 миллилитра блокирующего буфера в образцы и инкубатор при комнатной температуре в течение двух часов с нежным вращением. Для приготовления 0,4 миллилитров первичного раствора антител разбавляют двумя микролитрами антиокомузына и двумя микролитров антитирозинового гидрокси-антитела до 396 микролитров блокирующего буфера.Vortex и спина вниз, чтобы восстановить громкость. Теперь осторожно удалите блокирующий буфер из кусков ткани. Добавьте 100 микролитров подготовленного раствора первичных антител в трубки и инкубировать при четырех градусах цельсия на ночь.На следующий день тщательно соберите первичный раствор антител для повторного использования при желании. Мыть образцы три раза с 1x PBST при 500 микро-литров на стирку в течение 30 минут с нежным вращением при 18 об/мин. Для приготовления вторичного раствора антител разбавить два микролитров flouro-flouro спряженных антибога IGG в двух микролитров flouro-flouro спряженных анти-бешеный IGG в 396 микролитров блокирующего буфера.Vortex и спина кратко собрать всю жидкость. Теперь удалите последний буфер стирки из образцов. Добавьте в трубки 100 микролитров вторичного раствора антител.Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов с нежным вращением при 18 об/мин. После тщательного удаления вторичного раствора антител, мыть образцы три раза с 1x PBST при 500 микролитров на стирку в течение 30 минут каждый с нежным вращением при 18 об/мин. Для оптического очистки, погрузить образцы в один миллилитр 90%глицерол и держать образцы на четыре градуса цельсия в темноте, пока они не станут прозрачными.Добавьте здесь изолятор кремния к скольжению для того чтобы создать наилучшим образом для изображения тома. Держите высоту силикона или немного меньше, чем у образца. Аккуратно перенесите образцы в колодец и заполните его монтажной средой.Положите крышку на поверхность и запечатать четверти крышки с высокой вязкости среды. Пусть монтаж среднего лечения в течение 24 часов при комнатной температуре и темноте. После завершения лечения, полностью запечатать края крышки для оптимального долголетия образца.Приобрети изображения стека с целью 20 раз конфокального микроскопа и соответствующего программного обеспечения. Запустите систему. Нажмите на вкладку конфигурации и активируйте лазер Argon и лазер He-Ne 633.Нажмите на вкладку приобретения. В видимой панели лазерных линий, переместить соответствующую интенсивность ползунки вверх, чтобы выбрать лазерные линии до 488 нанометров и 633 нанометров. Первоначально интенсивности могут быть установлены на 20 до 30%Теперь выберите 488, 561, 633 тройное дихроическое зеркало.Активируйте мультипликаторы фотографий, нажав на активные чек-боксы. Выберите photomultiplier один для излучения, оказываемого 488 нанометровый лазер и photomultiplier 34 для этого из 633 нанометрового лазера. Установите диапазон длин волн до 500-550 нанометров для фото мультипликатора.В 650 до 750 нанометров, для фото мультипликатор три. Выберите псевдоцвет, который будет использоваться для отображения изображения, дважды нажав на цветной прямоугольник рядом с каждым мультипликатором фотографии и выбрав цвет из всплывающего меню. Теперь нажмите на живой, чтобы проверить изображение на образцах.Используйте nob положения q для того чтобы выбрать плоскость фокуса внутри область XY интереса. Отрегулируйте яркость изображений, повернув интенсивность лазера, интеллектуальную прибыль и смещение. Для каждого канала флуоресценции выполните эту регулировку в режиме быстрого отображения таблицы просмотра.Нажмите на кнопку быстрого просмотра таблицы, чтобы войти в режим быстрого просмотра таблицы, в котором насыщенные пиксели отображаются синим цветом, чтобы помочь настройке соответствующего уровня яркости. Нажмите дважды на кнопку быстрого просмотра таблицы, чтобы вернуться в режим псевдоцветного отображения. При сканировании поверните nob положения nob по часовой стрелке, чтобы переместить плоскость фокусировки на один конец объема интереса.Затем нажмите на конец наконечника стрелы, чтобы установить сканирование и положение. Поверните nob положения q по часовой стрелке для того чтобы двинуть плоскость фокуса через образец к другому концу тома интереса. Затем нажмите на наконечник стрелки, чтобы установить начало сканирования позиции.Отрегулируйте размер шага до трех микрон. Измените качество изображения, выбрав формат 1024 к 1024 году, скорость 100 Гц и среднюю линию в два. Выберите начало инициировать приобретение изображения стека для максимальной проекции приобретенного стека изображений, Нажмите на вкладку процесса, а затем инструмент;выберите 3D проекцию и введите максимум в списке методов без изменений в порог x, Y и q.Set до нуля, нажмите на применить.Максимальная интенсивность громкости q будет уложена в 2D-изображение, которое отображается. Для анализа 2D-изображений с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом откройте сложенные изображения в программном обеспечении. Отрегулируйте диаметр и интенсивность сосуда до тех пор, пока не будут правильно выбраны все структуры сосудов.Выберите анализ запуска и экспорт данных в соответствии с рекомендациями программного обеспечения. Для анализа 3D-изображений с помощью лицензионного программного обеспечения откройте необработанные данные изображений с помощью программного обеспечения. Отрегулируйте порог интенсивности и другие параметры до тех пор, пока структуры сосудов в каждом слое объема не будут должным образом сегментированы.Скелетизировать полученный стек binarised изображения для получения специального графика. Проанализируйте выбранные характеристики сегмента и экспортируйте данные по указанию программного обеспечения. Были собраны дистальная область эпидидимальной белой жировой ткани, медиальная область спинной поясничной подкожной белой жировой ткани и медиальная область внутрикапулярной коричневой жировой ткани.После целого монтажа окрашивания стволы тканей были установлены и изображены с помощью конфокального микроскопа. Больше кровеносных сосудов были положительно окрашены. С анти-эндомузын антитела в глицерол инкубируется подкожной белой жировой ткани, предполагая, что очистка шаг имеет решающее значение для полного окрашивания кровеносных сосудов.Чтобы определить, являются ли кровеносные сосуды и нервные волокна проявляют различные модели среди свержения с помощью этого метода, коммунальные флуоресценции окрашивания была выполнена в жировой ткани с антителами с анти-эндомузин, чтобы показать кровеносные сосуды и с антитирозин гидроксиной лазе, чтобы показать нервных волокон. Интересно, что результаты показывают, что они были значительно больше кровеносных сосудов, чем нервные волокна в коричневой жировой ткани по сравнению с белой жировой ткани. Среди белой жировой ткани, подкожная белая жировая ткань выставлена более высокая плотность кровеносных сосудов, чем эпидидимальная белая жировая ткань.Следует отметить, что, хотя нервные волокна расширялись параллельно кровеносным сосудам, они не проявили значительной совместной локализации. Площадь сосуда, количество соединений и длина трубки были затем качественно измерены с помощью 2D-метода в этих трех типах жировой ткани и обнаружили аналогичные результаты. Этот метод эффективно cos-дены кровеносных сосудов и нервных волокон и жировой ткани.Это звучит как полезный инструмент для изучения динамических изменений в жировой ткани во время развития ожирения. Мощный рот hy-de является токсичным. Пожалуйста, выполнить P-ifa участие шаги в более широкий контакт кожи и и ингаляции и должным образом обрабатывать P-ifa Потому что лазерные лучи стали фокусный микроскоп еще вред глазу.Избегайте воздействия глаз на лучи, поступающие от цели,

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Выделение мышью перитонеальных клеток полости

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...