Name: co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue
Uploaded: 2019-02-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (att K.S.).

Alla förfaranden som innehåller animaliska ämnen har godkänts av djur välfärd kommittén av University of Texas Health Science Center på Houston (animaliskt protokollnummer: AWC-18-0057).
1. REAGENSBEREDNING
<ol><li>1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4): för att göra 1 L av 1 x PBS, lös 8 g NaCl, 0,2 g av KCl, 1,44 g av Na2HPO4och 0.24 g KH2PO4 i 800 mL destillerat vatten. Justera pH till 7,4 och fyll på med destillerat vatten fö...

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+and+obesity.">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotrophin+triggers+adipose+tissue+fibrosis+and+metabolic+dysfunction.">Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction.</a> Nature Communication. 5, 3485 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+functions+of+endotrophin+on+different+cell+populations+in+adipose+tissue.">Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Overexpression+of+VEGF-A+in+Adipose+Tissue+Promotes+Energy+Expenditure+via+Activation+of+the+Sympathetic+Nervous+System.">Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System.</a> Molecular and Cellular Biology. , (2018).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-independent+angiogenesis+in+adipose+tissues+during+cold+acclimation.">Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+TDRG1+enhances+tumorigenicity+in+endometrial+carcinoma+by+binding+and+targeting+VEGF-A+protein.">LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein.</a> BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dichotomous+effects+of+VEGF-A+on+adipose+tissue+dysfunction.">Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).</li><li>During, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+VEGF+Links+the+White-to-Brown+Fat+Switch+With+Environmental,+Genetic,+and+Pharmacological+Stimuli+in+Male+Mice.">Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice.</a> Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).</li><li>Elias, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+protects+against+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).</li><li>Sung, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vascular+functions+in+modulation+of+obesity,+adipose+metabolism,+and+insulin+sensitivity.">Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+derived+VEGF-A+modulates+cold+tolerance+and+energy+expenditure.">Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure.</a> Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).</li><li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+neuro-adipose+connections+mediate+leptin-driven+lipolysis.">Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis.</a> Cell. 163 (1), 84-94 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>An, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+in+white+adipose+tissue+improves+metabolic+homeostasis+through+enhanced+angiogenesis.">Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li></ol>

Fettvävnad remodeling är direkt kopplad till metabola dysreglering under fetma utveckling1,2. Angiogenes och sympatiska innervation är båda viktiga för dynamisk remodeling process2,12. Utveckla en tillämplig metod för att visualisera den nya blodkärl samt nervfibrer är därför av stor betydelse. Tidigare metoder har rapporterats för att dokumentera angiogenes i fettvävnad. Vissa frågor kvarst...

Fettvävnaden har nyckel metabola och endokrina funktioner1. Det dynamiskt expanderar eller krymper svar på olika näringsämnen betonar2. Den aktiva vävnaden remodeling process består av flera fysiologiska vägar/steg inklusive angiogenes, fibros och utformningen av lokala inflammatoriska mikromiljö2,3,4. Vissa fysiska stimuli, såsom kallt exponering och motion, kan utlösa sympatisk aktivering, vilket i slutändan leder till nya blodkärl och sympatiska innervation i fettvävnad5,6. Dessa remodeling processer länkas tätt till systemisk metabola resultat inklusive insulinkänslighet, kännetecknet för typ 2-diabetes2. Visualisering av dessa patologiska förändringar är således mycket viktigt att förstå hela fettvävnad friska status.
Angiogenes är processen att nya blodkärl. Eftersom blodkärlen ge syre, näringsämnen, hormoner och tillväxtfaktorer för att vävnad, har angiogenes ansetts vara ett viktigt steg i fettvävnad remodeling, vilket har dokumenterats med olika tekniker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. finns dock fortfarande frågor om upplösningen på bilderna, effektivitet immunfärgning och metoder för kvantifiering av fartyget densitet. Jämfört med nya blodkärl, har innervation i fettvävnad underskattats under lång tid. Nyligen, Zeng et al. 14 används avancerade intravital två-foton mikroskopi och visat att adipocyter är omgiven av lager av nervfibrer14. Sedan dess har forskare börjat uppskatta den centrala rollen som sympatisk innervation i regleringen av fettvävnad fysiologi. Det är därför viktigt att utveckla en enkel och praktisk strategi för dokumentet fett nerv innervation.
Vi rapporterar här, en optimerad metod för samtidig färgningen av blodkärl och nervtrådar baserat på våra tidigare protokoll. Med den här metoden kan vi uppnå tydliga bilder av blodkärl och nervtrådar utan bullriga bakgrund. Dessutom får vi en resolution som är tillräckligt hög för att utföra kvantitativa mätningen av densiteter med öppen källkod. Genom att använda detta nya tillvägagångssätt, kan vi framgångsrikt jämför strukturer och tätheter av blodkärl och nervtrådar i olika fett depåer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Lot: 116969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Lot: 121944</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira 6.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Licensed software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angio tool</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>Open source software 
			https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse endomucin antibody</td>
			<td>R&#38;D research system</td>
			<td>AF4666</td>
			<td>Lot: CAAS0115101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>P40101-150</td>
			<td>Lot: aj01215y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses high performance, D=0.17mm</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>474030-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>High-viscosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde,16%</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>170215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>P24744</td>
			<td>Silicone isolator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36965</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEA BLOCK Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>37527X3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Path IV Tissue Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton &#935;-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Generic term: octoxynol-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator and rotisseries</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Generic term: Polysorbate 20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-staining blood vessels and nerve fibers in adipose tissue

Nyligen genomförda studier har belyst kritiska roll angiogenes och sympatiska innervation i fettvävnad ombyggnad under utvecklingen av fetma. Det är därför nödvändigt att utveckla en enkel och effektiv metod för att dokumentera de dynamiska förändringarna i fettvävnad. Här beskriver vi en modifierad Immunofluorescerande strategi som effektivt samarbete fläckar blodkärl och nervtrådar i fettvävnad. Vårt synsätt jämfört med traditionella och nyligen utvecklade metoder, och är relativt lätt att följa och effektivare i märkning blodkärl och nervtrådar med högre densiteter och mindre bakgrund. Dessutom tillåter högre upplösning bilder ytterligare oss att noggrant mäta området av fartyg, mängden förgreningar, och längden på fibrerna av programvara med öppen källkod. Som en demonstration med vår metod, visar vi att Brun fettvävnad (BAT) innehåller högre mängder av blodkärl och nervtrådar jämfört med vit fettväv (WAT). Vi ytterligare hitta att bland WATs, subkutan WAT (sWAT) har fler blodkärl och nervtrådar jämfört epididymal WAT (eWAT). Vår metod ger således ett användbart verktyg för att undersöka fettvävnad remodeling.

Den distala region av epididymal vit fettvävnad (eWAT), mediala region av den dorsolumbar subkutan vit fettvävnaden (sWAT) och mediala region av de interscapular brun fettvävnaden (BAT) samlades. Platser för att samla dessa vävnader anges i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59266/59266fig1.jpg"> Figur 1: anatomi av subkutan vit fettväv (sWAT), sperm...

Watch this Scientific Journal Video about Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue at JoVE.com

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Nya blodkärl och sympatiska innervation spelar avgörande roller i fettvävnad ombyggnad. Finns dock fortfarande tekniska problem i visualisera och kvantitativt mäta fettvävnad. Här presenterar vi ett protokoll för att framgångsrikt etikett och kvantitativt jämföra tätheterna av blodkärl och nervtrådar i olika fettvävnad.

Co färgning blodkärl och nervtrådar i fettvävnad

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Nyligen genomförda studier har belyst den kritiska roll angiogenes och sympatisk innovation i Fettvävnad remodeling under utvecklingen av fetma. Här demonstrerar vi en modifierad immunofluorescensmetod som effektivt står blodkärl och nervfibrer i Adipose vävnad. Vår strategi är rakt fram och effektiv utan kompromisser om stående effektivitet och kvaliteten.Vi förvärvar bilderna med hjälp av konfokalmikroskopi. Den höga upplösningen av bilderna gör att vi kan rekonstruera blodkärlsnätverken och noggrant analysera dess egenskaper. Börja detta förfarande med anestesi och perfusion av sex veckors C57 Black-6J hanmöss som beskrivs i textprotokollet.Dissekera vita och bruna fettproblem från mössen. Använd sax för att bryta vävnadsproverna i små bitar av bit. Överför de små bitarna med de steriliserade pincetterna i vävnadsinbäddningskassetterna med korrekt märkning av vävnadsproverna på kassetterna.Sänk ned de inbäddade kassetterna som innehåller vävnadsprover i fixeringslösningen vid fyra grader celsius under 24 till 48 timmar. Överför de små bitarna steriliserades pincett till en Petriskål. Tvätta proverna 3 gånger med borste 1x PBS buffert vid 0,5 milliliter per tvätt.Skär nu de fasta vävnadsproverna i ungefär två kubikmillimeterkuber med den steriliserade saxen. För permeabalisering, överför proverna till ett 1,5 milliliterrör som innehåller en milliliter på 1%Triton PBS buffert och försiktigt rotera rören i rumstemperatur i 1 timme vid 18 RPM. Efter en timme försiktigt bort 1%Triton PBS buffert genom aspiration tvätta proverna tre gånger genom att lägga till 1x PBS direkt i samma rör.Under varje tvätt, invertera rören flera gånger. För blockering, tillsätt 0,5 milliliter blockerande buffert till proverna och inkubatorn i rumstemperatur i två timmar med skonsam rotation. För att förbereda 0,4 milliliter primär antikroppslösning, späd två mikroliter av anti Endomusin och två mikroliter av antityrosinhydroxilasantikroppar tills 396 mikroliter av blockerande buffert.Vortexa och snurra ner för att återvinna volymen. Nu, försiktigt bort den blockerande bufferten från vävnaden bitar. Tillsätt 100 mikroliter av den beredda primära antikroppar lösningen i rör och inkubera vid fyra grader celcius över natten.Nästa dag, samla noggrant den primära antikroppslösningen för återanvändning om så önskas. Tvätta proverna tre gånger med 1x PBST vid 500 mikroliter per tvätt i 30 minuter med skonsam rotation vid 18 RPM. För beredning av sekundära antikroppar lösning, späd två mikroliter av flouro-flouro konjugerat anti-gud IGG i två mikroliter av flouro-flouro konjugerad anti-rabiat IGG i 396 mikroliter av blockerande buffert.Vortex och spinn kort för att samla all vätska. Nu, ta bort den sista tvättbufferten från proverna. Tillsätt 100 mikroliter av sekundär antikroppslösning i rör.Inkubera proverna i rumstemperatur i två timmar med skonsam rotation vid 18 RPM. Efter att noggrant ha tagit bort den sekundära antikroppslösningen, tvätta proverna tre gånger med 1x PBST vid 500 mikroliter per tvätt i 30 minuter vardera med varse rotation vid 18 RPM. För optisk clearance, sänk ned proverna i en milliliter på 90%Glycerol och hålla proverna på fyra grader celcius i mörker tills de blir transparenta.Lägg här till en isolator av kisel i bilden för att skapa en brunn för volymavbildning. Håll silikonets höjd till eller något mindre än provets. Överför försiktigt proverna i brunnen och fyll den med monteringsmediet.Lägg ett täckskydd på ytan och försegla kvarteren i täcket med hög viskositetsmedium. Låt monteringsmediet bota i 24 timmar i rumstemperatur och mörker. Efter härdning är klar, helt försegla kanterna på täcket för optimal prov livslängd.Förvärva Z stack bilder med 20 gånger målet för en confocal mikroskop och dess motsvarande programvara. Starta systemet. Klicka på konfigurationsfliken och aktivera både Argonlasern och He-Ne 633-lasern.Klicka på fliken förvärva. I den synliga laserlinjer panelen, flytta motsvarande intensitet reglagen upp för att välja laserlinjer upp 488 nanometer och 633 nanometer. Initialt kan intensiteterna ställas in på 20 till 30%Välj nu 488, 561, 633 trippel dichroic spegel.Aktivera fotomultiplikatorerna genom att klicka på de aktiva kryssrutorna. Välj photomultiplier en för utsläppet som utövas av 488na nanometerlaser och photomultiplier 34 för det av 633na nanometerlaser. Ställ in våglängdsområdet till mellan 500 och 550 nanometer för fotomultiplikator ett.I 650 till 750 nanometer, för foto multiplikator tre. Välj den pseudofärg som ska användas för bildvisning genom att dubbelklicka på den färgade rektangeln bredvid varje fotomultiplikator och välja en färg från popup-menyn. Klicka nu på live för att kontrollera bilden vid proverna.Använd Z-position nob för att välja ett plan av fokus inom XY region av intresse. Justera bildernas ljusstyrka genom att vrida på laserintensiteten, smart förstärkning och förskjutning. För varje fluorescenskanal utför du denna justering under visningsläget för snabbuppslagstabellen.Klicka på snabb leta upp bordsknappen för att komma in i snabb uppslagsbord läge där mättade pixlar visas i blått för att hjälpa inställningen av lämplig ljusstyrka nivå. Klicka två gånger på snabb leta upp tabellen knappen för att gå tillbaka till pseudo färg visningsläge. Medan skanning, vrid Z position nob moturs för att flytta plan för fokus till ena änden av volymen av intresse.Klicka sedan på slutet pilspets för att ställa in skanning och position. Vrid Z-positionen nob av medurs för att flytta plan av fokus genom exemplaret till den andra änden av volymen av intresse. Klicka sedan på den börja pilspets för att ställa in skanning börja position.Justera Z-stegstorleken till tre mikrometer. Ändra bildkvaliteten genom att välja ett format på 1024 med 1024, En hastighet på 100 Hz och ett linjegenomsnitt på två. Välj start för att initiera Z stacken bild förvärv För maximal projektion av förvärvade bilden stacken, Klicka på processen fliken och sedan verktyg;välj 3D-projektion och ange maximalt i metodlistan utan ändringar av X, Y och Z.Ställ tröskel till noll, klicka på gäller.Den maximala intensiteten för Z-volymen kommer att staplas i en 2D-bild som visas. För att analysera 2D-bilderna via öppen källkod, öppna de staplade bilderna i programvaran. Justera kärldiameter och intensitet tills alla kärlstrukturer kan väljas på rätt sätt.Välj kör analys och exportera data efter vägledning av programvaran. För att analysera 3D-bilderna via licensprogramvaran öppnar du bilders rådata med programvaran. Justera intensitetströskeln och andra parametrar tills kärlstrukturerna i varje lager av Z-volymen är korrekt segmenterade.Skeletonize den resulterande binarised bildstapeln för att få en speciell graf. Analysera de valda segmentegenskaperna och exportera data efter vägledningen av programvaran. Den distala regionen epididymal vit fettvävnad, den mediala regionen i den dorsala ryggradens subkutan vit fettvävnad och den mediala regionen av intra-scapular brun fettvävnad samlades in.Efter en hel montera färgning, vävnadsstammarna var monterade och avbildade med confocal mikroskop. Fler blodkärl var positivt färgade. Med anti-Endomusin-antikroppen i glycerolet inkuberade subkutan vit fettvävnad, vilket tyder på att clearingsteget är avgörande för fullständig färgning av blodkärlen.För att avgöra om blodkärl och nervfibrer uppvisar olika mönster bland depos med denna metod, Gemensamma fluorescens färgning utfördes i fettvävnad med antikroppar med anti-Endomusin att visa blodkärl och med anti-tyrosin hydroxy lase att visa nervfibrer. Intressant nog visar resultaten att de var betydligt fler blodkärl än nervfibrer i brun fettvävnad jämfört med vit fettvävnad. Bland den vita fettvävnaden uppvisade den subkutana vita fettvävnaden högre blodkärlsdensitet än den epididymala vita fettvävnaden.Notera, medan nervfibrerna expanderade parallellt med blodkärlen, visade de inte signifikant samlokalisering. Kärlområdet, antal korsningar och rörlängd mättes sedan kvalitativt med 2D-metoden i dessa tre typer av fettvävnad och fann liknande resultat. Denna metod effektivt cos-dens blodkärl och nervfibrer och fettvävnad.Det låter som ett användbart verktyg för att studera den dynamiska förändringen i fettvävnad under utvecklingen av fetma. Kraftfull mun hy-de är giftigt. Var vänlig och utför P-ifa inblandade steg i en A bredare hudkontakt och och inandning och hantera P-ifa på rätt sätt Eftersom laserstrålarna har blivit fokalmikroskop men ändå skadat ögat.Undvik ögonexponering för de strålar som kommer från målsättningen,

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Protokoll för rekombinant RBD-baserade SARS Vaccines: Protein Förberedelser, Animal Vaccination och neutralisering Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...