Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door R00HL122360 subsidie van de National Institutes of Health, National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI).

Alle methodes beschreven merkvoorschriften dierenverzorgers van The University of North Carolina te Chapel Hill.
1. bereiding van micro-injectie pipetten
<ol><li>Glazen capillairen met behulp van een micropipet trekker trek. Voor sommige injecties, wordt naald Afschuining aanbevolen omdat zij een uiterst scherp oppervlak verstoken van structurele onzuiverheden vormt. Pools om dit te doen, het einde van een getrokken naald op een beveling wiel in een hoek van 45° voor 15−20 min. Opmerking: De exacte instellingen voor het trekken van zal variëren op basis van de trekker wordt gebruikt. De definitieve binnendiameter van de schuine kant moet tussen 20−40 µm.</li>
	<li>Coat de binnenste en de externe oppervlakken van de glazen capillaire met silicone. Eerste duik de naalden in de siliconizing agent jas van het buitenoppervlak van de naald en vervolgens de backload de siliconizing agent-oplossing in elk micropipet jas van de binnenzijde. Opmerking: Coating van de haarvaten glas moet gebeuren 24 h vóór de implantatie-experiment. De haarvaten glas met siliconen coating biedt een chemisch inert oppervlak aan het glas. Als de haarvaten worden verlaten zal onbehandeld, de celsuspensie gegenereerd in latere stappen houden aan het glas en steek de naald. Coating is daarom noodzakelijk en essentieel voor het succes van de methode. Let op: De siliconizing agent is een kant en klare commercieel verkrijgbare mengsel van heptaan en 1,7-dichloorethaan-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabel van materialen). Het is zeer licht ontvlambaar en acuut toxisch. Altijd omgaan met goede PPE in een zuurkast.<ol>
<li>Om backload de naald, laden ~ 5−10 µL van de siliconizing agent in een micro-injectie pipette uiteinde (Tabel van materialen). Plaats het uiteinde van de micro-injectie in het brede einde van de getrokken glazen capillaire en plaats de tip zo ver naar beneden als mogelijk (dichtbij het glas naald tip). Verwijder de siliconizing agent tijdens het langzaam het verwijderen van de pipet laden om te minimaliseren van luchtbellen in de naald.</li>
		<li>Laat de siliconizing agent in de glas-naald voor 10 min, verwijderen door met een nieuwe lading pipet zuigen en laat naalden droog 's nachts in een zuurkast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De ochtend van het experiment, de haarvaten glas met gedeïoniseerd water na de procedure in stap 1.2 afspoelen en laten drogen voor 3−4 h.</li>
</ol>2. bereiding van de oplossingen
<ol><li>5 mL trypsine oplossing te neutraliseren door aan te vullen 4.2 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium en Ham van nutriënten mengsel F12 (DMEM/F12) met 750 µL van foetale boviene Serum (FBS) en 50 µL van penicilline/streptomycine voor te bereiden. Bewaren bij 37 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Bereiden van 5 µM labeling oplossing kleurstof door pipetting 5 µL van 1 mM voorraad labeling kleurstof (in dimethylsulfoxide [DMSO], Tabel of Materials) in 995 µL van Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Vortex voor 1 min en winkel bij 37 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Bereiden van verse paraformaldehyde (PFA) door het combineren van 10 mL van de stockoplossing van 32% PFA met 62 mL moleculaire biologie rang water en 8 mL van 10 x de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). De eindconcentratie is 4% PFA in 1 x DPBS.</li>
</ol>3. voorbereiding van de host embryo 's
<ol><li>Incubeer vruchtbare kippeneieren in een horizontale richting in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot Hamburger en Hamilton (HH) etappe 1910. Opmerking: Het podium gekozen voor manipulatie is flexibel en volledig afhankelijk van de doelstellingen van elk afzonderlijk experiment.</li>
	<li>Score van de 'platte' einde van de eierschaal langs de evenaar van de ei met behulp van schuine pincet te maken van een kleine lekke band > 1 mm in diameter. Invoegen van een naald 18 G met bijgevoegde 10 mL spuit via de lekke band en verwijder ~ 5 mL albumine. Opmerking: Deze anatomische locatie zich buiten de "lucht cel" binnen het ei en albumine weerhoudt lekken zodra de punctie is gemaakt. Deze stap wordt aanbevolen als het "drops" het embryo uit de buurt van de eierschaal, voorkomen van mogelijke schade in de opeenvolgende stappen.</li>
	<li>Het toepassen van transparante tape op de bovenkant van de eierschaal. Scoren met een schuine Tang en een ~2.5 cm venster met gebogen tenotomy schaar te knippen.</li>
	<li>Inspecteren en etappe van het embryo op basis van criteria die zijn vastgesteld door Hamburger en Hamilton10 en verzegel de punctie uit stap 3.2 met transparante tape. Opmerking: Hier, fase HH 19 embryo's worden gebruikt die hebben 37−40 somieten uitbreiden in de kiem van de staart. Het lek worden niet verzegeld tot nadat het venster is geopend langs de bovenkant van het ei (stap 3.3).</li>
	<li>~ 200 µL van Oost-Indische inkt/HBSS mengsel (1:5) onder het embryo met behulp van een 32 G naald met bijgevoegde 1 mL spuit te injecteren. Opmerking: Oost-Indische inkt biedt visueel contrast tussen het embryo en de dooier onder. Alternatieve kleurstoffen zoals neutrale rode of verkrijgbare cyaan fluorescente proteïne (GVB) of blauwe fluorescerende eiwit (BFP) fluorescentie filter sets kunnen worden gebruikt om het contrast te verbeteren.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van HBSS ontkleuring op de embryonale schijf en verzegel windowed schelpen met paraffine film. Plaats de eieren terug in de bevochtigde incubator tot klaar voor de injectie.</li>
</ol>4. isolatie van donorweefsel
<ol><li>Incubeer donor vruchtbare kippeneieren in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot fase HH 19 (of gewenste fase).</li>
	<li>Verwijder het embryo uit het ei en plaats in een 100 x 15 mm petrischaal met steriele HBSS bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Operatief microdissect atriale donorweefsel van elk embryo door eerst het gehele embryonale hart van het embryo te isoleren en vervolgens door het isoleren van de atria van het hart via pincet, schaar van tenotomy en microspatula onder een stereo microscoop ontleden. Zwembad in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL HBSS op ijs.</li>
	<li>Zodra alle donorweefsel is verzameld, pellet het weefsel door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste-hoek microcentrifuge.</li>
</ol>5. trypsine vertering van donorweefsel
<ol><li>Resuspendeer cel pellets in 1 mL voorverwarmde 0.05% trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in een schudden warmte blok bij 300 omwentelingen per minuut. Ook gebruiken een waterbad met periodieke agitatie van het monster.</li>
	<li>Pipetteer de spijsvertering oplossing op en neer te breken alle resterende weefsel, pellet zoals in stap 4.4.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 1 mL van de trypsine neutraliseren oplossing en centrifuge zoals in stap 4.4.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 400 µL van rode fluorescerende kleurstof oplossing labeling en Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min. in een blok van de warmte. Ook gebruiken een waterbad.</li>
	<li>Zodra de labeling reactie wordt gebeëindigd, de cellen zoals in stap 4.4 pellet en wassen met 1 mL van HBSS (aantal wassen stappen kunnen gevarieerd worden tussen 1 en 3).</li>
	<li>Resuspendeer de cellen van het gelabelde, Ingehuld bij een concentratie van ~ 50.000 cellen/µL, wat over het algemeen resulteert in een 5−10 µL werken volume afhankelijk van de cel Totaal rendement. Opmerking: Cel concentraties beneden ~ 50.000 cellen/µL kunnen resulteren in slechte injectie efficiëntie.</li>
</ol>6. in-vivo-injectie
<ol><li>Backload de celsuspensie in een siliconen behandelde glazen capillaire pipet volgens de procedure in stap 1.2. Monteer de pipet op de druk microinjector apparaat.</li>
	<li>Host embryo's uit bevochtigde incubator verwijderen en plaatsen in de houder van een ei onder de fluorescerende stereo microscoop ontleden.<ol>
<li>Open het vitelline membraan met behulp van steriele fijne pincet en maak een kleine incisie (~0.5−1.0 mm in lengte) in het hartzakje. Extra manipulatie/dissectie kan afhankelijk van doel regio voor injectie nodig zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de microinjector zodanig dat het uiteinde van de naald microinjection het doelweefsel doordringt.<ol>
<li>Druk injecteren van cellen en de fluorescerende label gebruiken om te bepalen dat geïmplanteerde cellen in gewenste weefsel aanwezig zijn. Voor typische injecties, gelden enkele pulsen van minder dan 0,5 s in duur variërend van 100-400 hectopascal in druk. Opmerking: Pulslengte absolute druk zal variëren afhankelijk van het aantal cellen te worden geïnjecteerd en kan worden aangepast voor individuele behoeften.</li>
		<li>Het microinjector apparaat intrekken en verwijder het ei uit de houder na het injecteren van de druk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 1 mL warme HBSS ontkleuring op het embryo, verzegelen met behulp van transparante verpakkingstape eieren en broeden in de bevochtigde incubator bij 38 ° C voor 24u post implantatie.</li>
</ol>7. isolatie en analyse
<ol><li>Isoleren van embryo's die gastheer in RT HBSS met pincet, tenotomy schaar en microspatula vergelijkbaar met stap 4.3, en monteren in 4% PFA overnacht bij 4 ° C met zachte rockende.</li>
	<li>Embryo's 3 x 5 min in HBSS op RT wassen met zacht rockende, en op te slaan in HBSS bij 4 ° C voor verder stroomafwaarts analyse (microscopie, immunohistochemistry, in-situ hybridisatie, enz.).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De mogelijkheid om te definiëren hoe microenvironmental voorwaarden invloed cardiale cel lot specificatie en bloedlijn stabilisatie is van fundamenteel belang voor het creëren van een druksterkte begrip van aangeboren hartziekte alsmede over de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor goede werking rijping van de cel van de stam of somatische reprograming gebaseerde cardiomyocytes. Het protocol bovenstaande geeft onderzoekers de mogelijkheid om rechtstreeks assay cardiale cel ontwikkeling onder omstandigheden in vivo veranderde, waardoor voor cel autonome rijping processen worden gescheiden van paracrine/juxtacrine en/of hemodynamische signalen. Wanneer gecombineerd met hoge resolutie beeldvorming, genetische analyse en fysiologische tests, kan deze techniek dienen als een krachtige aanvulling op bestaande transgene modellen.
Vorm van een technische stand punt, het protocol hier gepresenteerd is afhankelijk van efficiënte isolatie, labelen en nauwkeurige implantatie van donor hart cellen in embryonale weefsels van de gastheer. Het gebruik van een systeem van microinjection sterk helpt in de doelgerichtheid van de donor cellen en zorgt voor succesvolle implantatie zonder de noodzaak voor het maken van een grote engraftment site in het weefsel van de gastheer. Sommige operationele vaardigheid is vereist voor het uitvoeren van deze techniek echter zoals verminderde levensvatbaarheid kan tot gevolg hebben als de naald van de injectie niet zorgvuldig in het doelweefsel geplaatst is (waardoor breuk van het hart of de lokale therapieën). Zorg en dacht moeten ook uitgaan naar de isolatie en labeling stappen. Over spijsvertering van de donor weefsel kan leiden tot slechte implantatie efficiëntie en labelen van technieken van voorbijgaande aard kan beperken het venster van de tijd waarover donor cellen kunnen worden getraceerd (als celdeling het etiket verdunnen kan).
Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan worden aangepast voor verschillende doeleinden. Bijvoorbeeld, worden donor cellen uit een groot aantal weefsels en fasen kunnen worden geïsoleerd (hoewel de optimalisatie van de enzymatische spijsvertering is vereist) en kan ook in een verscheidenheid van host weefsels in verschillende stadia van ontwikkeling ingespoten. Ook kan de labeling aanpak worden aangepast voor het bijhouden van cellen over verschillende temporele Vensters, met inbegrip van het gebruik van fluorescerend anorganische halfgeleiders nanokristallen voor het labelen van de meer vluchtige en implantatie van kwartel cellen of van cellen uit groen fluorescent proteïne transgene (GFP +) donor embryo's11 voor het labelen van de permeant.
Terwijl we momenteel deze techniek voor aviaire implantatie studies gebruikt, zijn wij van mening dat het kan worden gebruikt voor een groot scala aan chimeer studies in de toekomst. Bijvoorbeeld kunnen genetisch gemanipuleerde hartcellen van transgene organismen worden geïsoleerd en microinjected in het aviaire hart met een vergelijkbaar protocol. Bovendien cellen onderscheiden in cardiomyocytes van stengels van cellen of via somatische reprograming benaderingen kunnen worden microinjected in de embryonale hart om te evalueren van hun integratie in het weefsel en/of de rijping onder in vivo biomechanische voorwaarden.

Cardiale developmental onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de komst van germline transgene modelsystemen waarin veel van de gene regulerende netwerken hebben vastgesteld dat patroon andere cel lineages en functionele domeinen in het hart. Identificeren kan hoe deze gene-netwerken met communiceren en op microenvironmental voorwaarden reageren, met inbegrip van paracrine/juxtacrine-signalen en biofysische ingangen (stretch, stam, hemodynamische flow), echter uitdagend. Als zodanig, is het niet altijd gemakkelijk om te bepalen of een cellulaire fenotype als een rechtstreeks gevolg van een genetische perturbation of als een secundaire gevolg van een aanpassing aan veranderingen in de cardiale biomechanica of hogere orde weefsel samenstelling1,2 ontstaat .
Enten van experimenten, die klassiek om adres concepten van lot specificatie gebruikt zijn, zou inzet, inductie en competentie3,4, een ideale aanpak omzeilen enkele van de uitdagingen die inherent zijn aan cel autonome versus milieu invloed in het hart te definiëren. Helaas, hart contracties bemoeilijken standaard praktijk benaderingen. Snelle beweging van het weefsel vaak voorkomt geënte cellen vast te houden aan het hart en grote weefsel puncties (normaal vereist voor enten) vaak leiden tot hartfalen en embryonale letaliteit5,6,7. Daarom hebben we een druk-gebaseerd, microinjection systeem voor precisie cellulaire implantatie in het derde kuiken hart, omzeilen van de technische hindernissen weefsel enten eerder8,9beschreven. Met behulp van deze techniek, kunnen individuele of kleine groepen van hartcellen geïsoleerd uit een embryo van de donor worden microinjected in een verscheidenheid van de regio's van een host embryonale hart eliminerend de behoefte aan uitgebreide host voorbereiding en de grote weefsel beledigingen die zich voordoen met behulp van standaard praktijk technieken. De microinjection naalden gebruikt voor deze implantatie studies hebben een buitendiameter van ~ 30−40 µm, wat betekent dat de naald direct in het doelweefsel kan worden geplaatst (dat wil zeggen, kan doordringen de embryonale myocardiale muur) en cellen kunnen focally worden geleverd met minimale schade aan het omliggende weefsel. Het protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van een verscheidenheid van isotopische, heterotopic, isochoor en manipulaties van de heterochronic, die bieden een snelle, flexibele en goedkope aanpak te onderzoeken direct klassieke experimentele embryologische paradigma's in de ontwikkelingslanden vier-chambered hart.
In het protocol zoals hieronder beschreven, we label donor cellen met een cel permeant fluorescerende kleurstof, die het mogelijk voor het welslagen van een microinjection experiment maakt in real time worden gevolgd en de ligging van de werk cellen worden gedocumenteerd zonder de noodzaak voor een extra kleuring. Echter, opgemerkt moet worden dat deze aanpak is het meest geschikt voor korte termijn experimenten (ongeveer 48 h) zoals de fluorescente kleurstof verloren door celdeling worden kan. Alternatieve benaderingen kunnen worden gebruikt voor langere termijn experimenten.
Terwijl in het kader van cardiale ontwikkeling we deze techniek presenteren, zijn wij gewend het groot effect voor cel implantatie experimenten in het mesoderm, hoofd, ledematen en somieten. Als zodanig de basisbenadering hieronder beschreven is zeer hanteerbare en kan worden gebruikt in een verscheidenheid van orgaansystemen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

Interpretatie van de relatieve impact van de autonome patronen van de cel versus extrinsieke microenvironmental invloed op cel lineage bepaling is een algemene uitdaging in Ontwikkelingsbiologie onderzoek. In het embryonale hart, kan dit met name moeilijk als regionale verschillen in de expressie van transcriptionele regelgevers, paracrine/juxtacrine signalering signalen, en hemodynamische kracht zijn alle bekende te beïnvloeden cardiomyocyte rijping. Een vereenvoudigde methode om te veranderen van een ontwikkelende cardiomyocyte moleculaire en biomechanische communicatie zou daarom dienen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe de lokale voorwaarden invloed cel lot en functie. Om aan te pakken dit, hebben we een methode om fysiek transplantatie jonge cardiomyocytes in ectopische locaties in het hart of de omliggende embryonaal weefsel geoptimaliseerd. Hierdoor is ons te onderzoeken hoe microenvironmental voorwaarden invloed cardiomyocyte lot overgangen bij eencellige resolutie binnen het intact embryo. Hier beschrijven we een protocol waarin embryonale myocytes kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van cardiale sub-domeinen, losgekoppeld fluorescently label en microinjected in host embryo's met hoge precisie. Cellen kunnen vervolgens worden rechtstreeks geanalyseerd in situ met behulp van een verscheidenheid van beeldvorming en histologische technieken. Dit protocol is een krachtig alternatief voor traditionele praktijk experimenten die remmend moeilijk in een bewegende weefsel zoals het hart kan zijn. De algemene schets van deze methode kan ook worden aangepast aan een verscheidenheid van donor weefsels en host-omgevingen, en haar gebruiksgemak, lage kosten, en snelheid maken het een potentieel nuttige toepassing voor allerlei developmental studies.

Na 24 uur incubatie, het hart en de surround weefsel van host embryo's werden geïsoleerd, gefotografeerd (Figuur 1A), en verwerkt voor immunefluorescentie analyse. In dit voorbeeld donor atriale myocytes werden microinjected in het proepicardium van een soortgelijke geënsceneerde host embryo. Het embryo van de gastheer was vervolgens gekleurd met de markering van de spier (MF20 groen) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blauw). Ingespoten cellen (rood) zijn duidelijk zichtbaar (Figuur 1B). Mogelijke aanpassingen te overwegen als cellen niet zichtbaar zijn omvatten: donorweefsel was meer dan verteerd (cellen zou kunnen hechten), labeling kleurstof oplossing was ook verdund, cellen werden overdreven gewassen of meerdere celdelingen geleid tot verlies van het label.
Om te bevestigen dat de ingespoten cellen in dit voorbeeld myocardiale werden, gesegmenteerd we optisch dit embryo met behulp van een confocal microscoop (Figuur 1C-E). De enige positieve cellen van de MF20 binnen de proepicardium (PE) zijn de fluorescerende rode positieve cellen die werden focally geïmplanteerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> Figuur 1 : Representatief beelden van embryo's geïsoleerd 24 uur bericht injectie. (A) lage vergroting helderveld beeld van de regio van de romp van een E3.5 (HH etappe 19) kuiken embryo. (B) de cellen van de samengevoegde afbeelding weergegeven: geïnjecteerd is (rood), cardiomyocytes (groen), en DAPI. Cellen werden geïsoleerd van de atria en microinjected in de proepicardium. (C) hoge vergroting confocal imaging weergegeven: label cellen in de kern van de proepicardium. (D) hoge vergroting confocal imaging cardiomyocytes bevestiging CT Red Label cellen zijn. (E) driedimensionale (3D) reconstructie van ingespoten cellen uit panelen D en E. At, atria; OFT, uitstroom tractus; PE, proepicardium; VT, ventrikel; MF20, Myosin 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Dit protocol helpt ons te bepalen hoe veranderingen in de lokale biomechanica, weefselarchitectuur, paracrineomgevingen en neventakelinteracties cellulair fenotype beïnvloeden. Deze techniek stelt ons in staat om klassieke paradigma's en experimentele embryologie te verkennen zonder de grootschalige weefselbeledimenten te veroorzaken die normaal gesproken ontstaan in traditionele grafiekexperimenten. Om de juiste druk voor injectie te vinden, is het nuttig om te beginnen bij een lagere injectiedruk en stapsgewijs te verhogen totdat een gestage stroom van cellen is bereikt.Het visualiseren van deze techniek helpt bij het bereiken van een direct inzicht in hoe de injectie-apparatuur moet worden gepositioneerd in relatie tot het doelweefsel. Het demonstreren van de procedure zal twee leden van mijn laboratorium, Trevor Henley en Kandace Thomas. Trek 24 uur voor de implantatie glazen haarvaten op een micropipettrekker volgens standaardprotocollen en dompel de haarvaten onder in siliconen om de buitenoppervlakken van de naalden te coaten.Laad vervolgens 5 tot 10 microliter siliconen in een microinjectiepipetpunt en plaats de punt in het brede uiteinde van een extern gecoate getrokken glazen haarvat. Plaats de pipetpunt zo dicht mogelijk bij de glazen naaldpunt en gooi het siliconen middel uit terwijl u de laadpipet langzaam intrekt om luchtbellen in de naald te minimaliseren. Laat het siliconenmiddel 10 minuten in de glazen naald zitten voordat u een nieuwe laadpipet gebruikt om de oplossing aan tezuigen.Droog vervolgens de naalden in een rookkap 's nachts. Voor de voorbereiding van het gastheerembryo, incubeer vruchtbare kippeneieren in een horizontale oriëntatie in een bevochtigde couveuse bij 38 graden Celsius en gebruik schuine tangen om een meer dan een millimeter diameter punctie in de bodem van het vlakke uiteinde van elk ei langs de e-evenaar te maken. Steek een 18 meter naald bevestigd aan een 10 milliliter spuit in de punctie om ongeveer vijf milliliter albumen te verwijderen.En breng transparante tape aan op de bovenkant van de eierschaal. Scoor het afgeplakte gebied langs de bovenkant van het ei met schuine tangen en gebruik gebogen tenotomy schaar om een venster van ongeveer 2,5 centimeter in het afgeplakte gedeelte van het ei te snijden. Inspecteer en fase het embryo op basis van de criteria vastgesteld door Hamburger en Hamilton en gebruik een een millimeter spuit uitgerust met een 32-meter naald om ongeveer 200 microliters van een een tot vijf verdunning van India inkt in HBSS injecteren onder het embryo.Sluit vervolgens de punctie af met transparante tape en voeg een milliliter HBSS-drop-wise toe op de embryonale schijf voordat u de besprenkeste schaal afsluit met paraffinefolie voor plaatsing van het ei terug in de bevochtigde couveuse. Wanneer de embryo's Hamburger en Hamilton fase 19 bereiken, spoel de met siliconen gecoate glasvaten met gedeïioniseerd water en laat de haarvaten drie tot vier uur drogen bij kamertemperatuur. Breng ondertussen een embryo van het ene ei over in een petrischaal van 100 bij 15 millimeter met steriele kamertemperatuur HBSS en leg de schotel onder een stereomicroscoop.Met behulp van tangen, tenotomieschaar en een microspatel isoleren het hele embryonale hart van het embryo en isoleren de atria uit het hart. Plaats het atriumweefsel in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met een milliliter HBSS op ijs. Wanneer al het donorweefsel is verzameld, pellet de weefsels door centrifugatie in een vaste schuine microcentrifuge.Voor donorweefsel spijsvertering, opnieuw schorsen de pellets in een milliliter van voorverwarmde 05%trypsin EDTA voor een 15 minuten incubatie in een schudden warmteblok op 300 rotaties per minuut. Aan het einde van de incubatie, pipet de spijsvertering oplossing meerdere malen te breken resterende weefsel en pellet het hart lysaat door centrifugatie. Schors de pellet opnieuw in een milliliter trypsineneutraliserende oplossing voor een andere centrifugatie, gevolgd door re-suspensie in 400 microliters van rode fluorescerende kleurstofoplossing.Na 20 minuten bij 37 graden Celsius, pellet de cellen door centrifugatie voor een tot drie wast in een milliliter HBSS per wasbeurt. Stel de gelabelde cellen vervolgens opnieuw op met vijf keer tien tot de vierde cel per microliterconcentratie in verse HBSS. Voor in vivo injectie van de donorcellen laadt u de celsuspensie terug in een droge, met siliconen behandelde glazen capillaire pipet zoals aangetoond en monteer u de pipet in het drukmicroinjectorapparaat.Breng elk gastheerembryo over dat uit de bevochtigde couveuse in een eihouder wordt geïnjecteerd onder een fluorescerende stereoontledenmicroscoop. En gebruik steriele fijne tangen om het vitelline membraan te openen. Maak een incisie van 5 tot 1 millimeter in het pericardium en plaats de microinjecter zodanig dat de punt van de micro-injectienaald het doelweefsel binnendringt.Stel de microinjector in om enkele pulsen van 5 seconden in duur en variërend van 100 tot 400 hectopascals in druk toe te passen. En druk-injecteren van de cellen. Het is van cruciaal belang om een succesvolle celimplantatie te verifiëren door het fluorescerende signaal te beeldteren voordat het ei opnieuw wordt afgenomen.Het embryo kan ook gefotografeerd worden om deze procedure vast te leggen. Wanneer alle cellen zijn geïnjecteerd, trekt u het microinjectorapparaat in en verwijdert u het ei van de houder. Voeg vervolgens een milliliter warme HBSS drop-wise toe aan het embryo.Verzegel het ei met transparante verpakkingstape en breng het ei 24 uur na de implantatie terug naar de bevochtigde couveuse. Hier wordt het hart en het omliggende weefsel van een gastheer embryonaal hart na donortrial myocytenimplantatie getoond. In dit representatieve experiment werden de donorcellen microinjecteerd in het proepicardium van een gastheerembryo in een vergelijkbaar stadium.Optische secties met behulp van een confocale microscoop bleek dat de enige hartspier marker positieve cellen binnen het proepicardium waren de focally geïmplanteerde fluorescerende rode positieve cellen. Zorg ervoor dat u het embryo van de ontvanger niet te veel manipuleert, omdat breuken in het hart en de lokale vasculatuur veroorzaakt door de injectienaald kan resulteren in verminderde levensvatbaarheid. Na deze procedure kunnen verschillende downstream-tests worden uitgevoerd, waaronder immunohistochemie, in situ hybridisatie en celsorling.Het siliconen middel is uiterst ontvlambaar en acuut giftig. Het moet altijd worden behandeld met zorg en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen in een rookkap.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profilering van<em&gt; In-Vivo</em&gt; Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo&#39;s met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...