Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par grant R00HL122360 de la National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).

Toutes les méthodes décrites se conformer aux directives de protection des animaux de The University of North Carolina à Chapel Hill.
1. préparation des pipettes de micro-injection
<ol><li>Tirez des capillaires en verre à l’aide d’un extracteur d’une micropipette. Pour quelques injections, aiguille biseautage est recommandé car il offre une surface extrêmement tranchant dépourvu d’impuretés structurelles. Pour ce faire, polir l’extrémité d’une aiguille a tiré sur une roue Taillante selon un angle de 45° pour 15−20 min. Remarque : Les paramètres exacts pour tirer variera selon l’extracteur utilisé. Le diamètre intérieur final du biseau doit être entre 20−40 µm.</li>
	<li>Enduire les surfaces internes et externes du verre capillaire avec du silicone. Tout d’abord tremper les aiguilles dans l’agent siliconizing pour enduire la surface externe de l’aiguille, puis charger par l’arrière la solution d’agent siliconizing dans chaque micropipette pour enduire la surface intérieure. NOTE : Revêtement des capillaires verre devrait faire 24h avant l’expérience de l’implantation. Les capillaires en verre avec du silicone de revêtement offre une surface chimiquement inerte sur le verre. Si les capillaires sont laissés non traitée, la suspension cellulaire générée dans les étapes ultérieures sera adhèrent au verre et branchez l’aiguille. Revêtement est donc nécessaire et essentielle à la réussite de la méthode. Attention : L’agent siliconizing est un mélange commercialement disponible prêtes à l’emploi d’heptane et 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Table des matières). Il est extrêmement inflammable et très toxique. Toujours manipuler avec les EPI approprié à l’intérieur d’une hotte aspirante.<ol>
<li>Introduire l’aiguille, en direction de charge ~ 5−10 µL de l’agent siliconizing dans un micro injection de pipette (Table des matières). Placer l’embout de la micro-injection dans l’extrémité la plus large du verre tiré capillaire et positionner la pointe aussi loin vers le bas que possible (à proximité de la pointe de l’aiguille de verre). L’agent siliconizing d’éjection tout en retirant lentement la pipette de chargement afin de minimiser les bulles d’air dans l’aiguille.</li>
		<li>Laisser l’agent siliconizing dans l’aiguille de verre pendant 10 min, retirez en aspirant avec une nouvelle pipette de chargement et laissez aiguilles sécher toute la nuit sous une hotte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le matin de l’expérience, rincer les capillaires en verre avec de l’eau désionisée, suivant la procédure à l’étape 1.2 et laisser pour sécher pendant 3−4 h.</li>
</ol>2. préparation des solutions
<ol><li>Préparation de 5 mL de trypsine neutralisant la solution en la complétant 4,2 mL de milieu de Eagle modifié de Dulbecco et mélange nutritif Ham F12 (DMEM/F12), avec 750 µL de sérum bovin fœtal (FBS) et 50 µL de pénicilline/streptomycine. Conserver à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Préparer 5 µM étiquetant solution teintée par pipetage 5 µL de stock 1 mM marquage colorant (dans le diméthylsulfoxyde [DMSO], Table des matières) en 995 µL de Hank équilibré de solution saline (HBSS). Vortexer pendant 1 min et magasin à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Préparer la paraformaldéhyde frais (PFA) en combinant 10 mL de solution mère de PFA de 32 % avec 62 mL d’eau de qualité de la biologie moléculaire et 8 mL de 10 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD). La concentration finale est de 4 % PFA dans 1 x DPBS.</li>
</ol>3. préparation d’embryons de l’hôte
<ol><li>Incuber des oeufs de poulet fertile dans une orientation horizontale dans un incubateur humidifié à 38 ° C jusqu’au Hamburger et Hamilton (HH) étape 1910. Remarque : La scène choisie pour la manipulation est flexible et entièrement dépendant des objectifs de chaque expérience individuelle.</li>
	<li>Marquer la fin de « plate » de la coquille d’oeuf le long de l’Équateur de l’oeuf à l’aide de pinces angulaires à faire une petite perforation > 1 mm de diamètre. Insérer une aiguille 18 G avec seringue jointe 10 mL par le biais de la ponction et retirer environ 5 mL d’albumine. Remarque : Cette localisation anatomique est externe à la « cellule d’air » à l’intérieur de le œuf et empêche la fuite une fois la ponction faite albumine. Cette étape est recommandée car elle « tombe » de l’embryon de la coquille d’oeuf, prévenant les dommages potentiels dans les étapes ultérieures.</li>
	<li>Appliquer du ruban adhésif transparent vers le haut de la coquille d’oeuf. Marquer avec une pince coudée et découper une fenêtre de ~2.5 cm avec des ciseaux courbes ténotomie.</li>
	<li>Inspecter et l’embryon issu des critères établis par le Hamburger et Hamilton10 et sceller la piqûre de l’étape 3.2 avec du ruban adhésif transparent. NOTE : Ici, embryons au stade 19 HH sont utilisés qui ont des somites 37−40 s’étendant dans le bourgeon de la queue. La ponction ne devrait pas être scellée jusqu'à ce qu’après l’ouverture de la fenêtre sur le haut de l’oeuf (étape 3.3).</li>
	<li>Injecter ~ 200 µL du mélange de l’encre de Chine/HBSS (1:5) sous l’embryon à l’aide d’une aiguille de 32 G avec seringue jointe 1 mL. Remarque : l’encre de Chine offre un contraste visuel entre l’embryon et le jaune sous. Alternative colorants tels que neutre disponible dans le commerce ou rouge cyan protéine fluorescente (CFP) ou jeux de filtres de fluorescence bleue protéine fluorescente (BFP) peut être utilisé pour améliorer le contraste.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de HBSS goutte à goutte sur le disque embryonnaire et sceller les coquilles fenêtrées avec film de paraffine. Replacez les œufs dans l’incubateur humidifié jusqu’au moment de l’injection.</li>
</ol>4. isolement de tissu donneur
<ol><li>Incuber les oeufs de poulet fertile du donateur dans un incubateur humidifié à 38 ° C jusqu’au stade HH 19 (ou scène désirée).</li>
	<li>Retirer l’embryon de l’oeuf et les placer dans un plat de pétri 100 x 15 mm contenant stérile HBSS à température ambiante (RT).</li>
	<li>Chirurgicalement le tissu auriculaire donneur microdissect de chaque embryon par tout d’abord isoler tout coeur embryonnaire de l’embryon et puis en isolant les oreillettes du coeur à l’aide de pinces, ciseaux ténotomie et microspatula sous un stéréo binoculaire. Piscine dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL contenant 1 mL de HBSS sur la glace.</li>
	<li>Une fois que tous les tissus du donneur a été recueillie, pellet le tissu par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min à 4 ° C dans une micro-centrifugeuse angle fixe.</li>
</ol>5. la digestion trypsique de tissu donneur
<ol><li>Remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de préchauffée 0.05 % trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 15 min dans un bloc chauffant secouant à 300 tr/min. Sinon, utiliser un bain-marie avec agitation périodique de l’échantillon.</li>
	<li>Déposer de la solution de digestion haut et bas pour casser vers le haut de n’importe quel tissu restant et pellet comme au point 4.4.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de la trypsine neutralisant solution et centrifugeuse comme au point 4.4.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 400 µL de rouge fluorescent étiquetage solution teintée et incuber à 37 ° C pendant 20 min dans un bloc chauffant. Vous pouvez également utiliser un bain d’eau.</li>
	<li>Une fois que la réaction d’étiquetage est terminée, les cellules comme au point 4.4 de granule et laver avec 1 mL de HBSS (nombre de lavage étapes peuvent varier entre 1 et 3).</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules marquées, granulés à une concentration de ~ 50 000 cellules/µL, qui donne généralement lieu à un volume de travail 5−10 µL selon le rendement total de cellules. Remarque : Les concentrations de cellules au-dessous de ~ 50 000 cellules/µL peuvent entraîner efficacité pauvre injection.</li>
</ol>6. in vivo injection
<ol><li>Charger par l’arrière la suspension cellulaire dans une pipette capillaire de silicone verre traité suivant la procédure à l’étape 1.2. Montez la pipette dans l’appareil de microinjector de pression.</li>
	<li>Retirer les embryons hôte incubateur humidifié et placer dans un support oeuf sous la stéréo fluorescent binoculaire.<ol>
<li>Ouvrez la membrane vitelline, à l’aide d’une pince fine stérile et faire une petite incision (~0.5−1.0 mm de longueur) dans le péricarde. Manipulation/dissection supplémentaire peuvent être nécessaires selon votre région cible pour injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez le microinjector de telle sorte que la pointe de l’aiguille de microinjection pénètre le tissu cible.<ol>
<li>Pression injecter des cellules et utilisez l’étiquette fluorescent pour déterminer que les cellules implantés sont présentes dans le tissu désiré. Pour les injections typiques, appliquer seule impulsions inférieures à 0,5 s à une durée allant de 100 à 400 hectopascals en pression. NOTE : Durée d’impulsion et de la pression absolue varient selon le nombre de cellules à doser et peuvent être modifiés en fonction des besoins individuels.</li>
		<li>Retirer l’appareil microinjector et retirez le œuf du support après l’injection de la pression.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 1 mL de HBSS chaude goutte à goutte sur l’embryon, sceller les oeufs à l’aide de ruban d’emballage transparent et incuber dans l’incubateur humidifié à 38 ° C pour l’implantation de poste de 24h.</li>
</ol>7. isolement et analyse
<ol><li>Isoler les embryons hôte dans HBSS RT à l’aide de pinces, ciseaux ténotomie et microspatula similaire à l’étape 4.3 et difficulté à 4 % PFA pour la nuit à 4 ° C avec le doux balancement.</li>
	<li>Laver les embryons 3 x 5 min dans HBSS RT avec doux balancement et stocker dans HBSS à 4 ° C pour une analyse ultérieure en aval (microscopie, immunohistochimie, hybridation in situ, etc.).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La possibilité de définir comment micro-environnementales conditions impact cellule cardiaque sort spécification et lignée de stabilisation est fondamentale à la création d’une compression compréhension des maladies cardiaques congénitales ainsi quant à l’élaboration de protocoles efficaces pour la bonne maturation des cellules souches ou cellules somatiques des cardiomyocytes reprogrammation-basé. Le protocole décrit ci-dessus donne chercheurs la possibilité d’analyser directement les développement des cellules cardiaques sous altéré les conditions in vivo, ce qui permet pour les processus de maturation autonome cellule d’être séparé de signaux paracrines/juxtacrine et/ou hémodynamiques. Lorsqu’il est combiné avec l’imagerie haute résolution, analyse génétique et les essais physiologiques, cette technique peut servir de complément puissant de modèles transgéniques existantes.
Former un point de vue technique, le protocole présenté ici s’appuie sur une isolation efficace, étiquetage et implantation précise des cellules cardiaques donneur dans les tissus embryonnaires de l’hôte. L’utilisation d’un système de micro-injection grandement contribue à cibler les cellules du donneur et permet une implantation réussie sans la nécessité de créer un site de grande prise de greffe dans les tissus de l’hôte. Certaines compétences opérationnelles sont requis pour effectuer cette technique toutefois, comme la viabilité réduite peut se produire si l’aiguille d’injection n’est pas soigneusement placé dans le tissu cible (ce qui provoque la rupture du cœur ou du système vasculaire locale). Soins et la pensée conviendrait aussi à l’isolement et l’étiquetage des étapes. Au cours de la digestion du donneur tissu peut conduire à l’efficacité médiocre de l’implantation, et transitoire des techniques de marquage peut limiter la durée de validité sur laquelle les cellules donneuses peuvent être suivis (comme la division cellulaire peut diluer l’étiquette).
Cette technique est très modifiable et adaptable pour une variété d’usages. Par exemple, donneur de cellules dans une large gamme de tissus et de stades peuvent être isolés (bien que l’optimisation de la digestion enzymatique est requise) et peut de même être injecté dans une variété de tissus de l’hôte à travers différents stades de développement. De même, la démarche d’étiquetage peut être modifiée pour assurer le suivi des cellules à travers des fenêtres temporelles différentes, y compris l’utilisation de nanocristaux fluorescents semi-conducteurs inorganiques pour l’étiquetage plus transitoire et l’implantation de cellules de caille ou cellules du vert (protéine fluorescente transgéniques GFP +) donneur embryons11 pour l’étiquetage perméants.
Alors qu’actuellement, nous utilisons cette technique pour les études d’implantation aviaire, nous pensons qu’il pourrait être utilisé pour une vaste gamme d’études chimériques dans l’avenir. Par exemple, les cellules cardiaques génétiquement modifiés provenant d’organismes transgéniques pourraient être isolées et micro au cœur aviaire à l’aide d’un protocole très similaire. En outre, les cellules différenciées dans les cardiomyocytes de provient de cellules ou par l’intermédiaire de cellules somatiques, reprogrammation des approches pourraient être micro au cœur embryonnaire pour évaluer leur intégration dans le tissu et/ou la maturation sous in vivo biomécanique conditions.

Recherche de développement cardiaque a profité énormément de l’avènement des systèmes de modèles transgéniques de lignée germinale qui ont identifié plusieurs des réseaux de régulation génique que modèle cellulaires différentes lignées et des domaines fonctionnels au cœur. Toutefois, déterminer comment ces réseaux de gènes interagissent avec et répond aux conditions micro-environnementales, y compris les signaux paracrines/juxtacrine et intrants biophysiques (stretch, souche, flux hémodynamique), peut être difficile. Par conséquent, il n’est pas toujours facile de déterminer si un phénotype cellulaire se pose comme une conséquence directe d’une perturbation génétique ou comme un résultat secondaire d’une adaptation aux modifications cardiaques biomécanique ou plus élevés ordre papier composition1,2 .
Greffage des expériences qui ont été classiquement utilisés aux concepts d’adresse de la spécification du destin, engagement, induction et compétence3,4, représenterait une approche idéale pour contourner certaines des difficultés inhérentes à définition de cellule autonome contre l’influence de l’environnement au coeur. Malheureusement, les contractions cardiaques compliquent des procédures types de greffage. Un mouvement rapide du tissu empêche souvent les cellules greffées d’adhérer au cœur et tissu grand perforations (normalement requis pour les greffes) conduisent souvent à une insuffisance cardiaque et de létalité embryonnaire5,6,7. Par conséquent, nous avons développé un basées sur la pression, système de micro-injection pour l’implantation de cellulaire de précision dans le cœur de poussin en voie de développement, contourner les obstacles techniques de greffe de tissus décrits précédemment8,9. En utilisant cette technique, individuels ou petits groupes de cellules cardiaques isolées à partir d’un embryon de donneur peuvent être micro dans diverses régions d’un cœur embryonnaire hôte, éliminant le besoin de préparation hôte étendu et les insultes de grands tissus qui se posent à l’aide techniques de greffage standards. Les aiguilles de microinjection utilisées pour ces études d’implantation ont un diamètre extérieur de ~ 30−40 µm, ce qui signifie que l’aiguille peut être placé directement dans le tissu cible (c'est-à-dire, pénètrent dans la paroi du myocarde embryonnaire) et cellules peuvent être circonscrits livrés avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Le protocole peut être utilisé pour exécuter une variété d’isochore isotopique, transplantation et des manipulations hétérochronique, offrant une approche rapide, flexible et peu coûteux pour examiner directement classiques paradigmes embryologiques expérimentales dans les pays en développement cœur à quatre cavités.
Dans le protocole décrit ci-dessous, nous étiquetons donneur de cellules avec un colorant fluorescent perméants cellulaire qui permet de surveiller en temps réel pour le succès d’une expérience de microinjection et la localisation des cellules implantées à figurer sans la nécessité d’une plus la coloration. Toutefois, il convient de noter que cette approche est idéale pour des expériences de courte durée (environ 48 h) car le colorant fluorescent peut être perdu par division cellulaire. Approches alternatives peuvent être utilisés pour des expériences de durée plus longues.
Alors que nous vous présentons cette technique dans le contexte du développement cardiaque, nous avons utilisé il à bon escient pour des expériences d’implantation de cellules dans le mésoderme, tête, membres et une poule. Ainsi, l’approche de base décrite ci-dessous est très souple et peut être utilisé dans une variété de systèmes d’organes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

Interpréter l’impact relatif de structuration autonome cellule contre extrinsèque microenvironmental influence sur la détermination de lignée cellulaire représente un défi général dans la recherche en biologie du développement. Dans le coeur embryonnaire, cela peut être particulièrement difficile puisque les différences régionales dans l’expression des régulateurs transcriptionnels, signaux de signalisation paracrine/juxtacrine, et force hémodynamique sont tous connus pour influencer la maturation cardiomyocyte. Une méthode simplifiée pour modifier microenvironnement de moléculaire et biomécaniques du cardiomyocyte un pays en développement, servirait donc une technique puissante pour examiner comment local conditions influence sort de la cellule et la fonction. Pour y remédier, nous avons optimisé une méthode physiquement transplantation cardiomyocytes juvéniles dans lieux ectopique dans le coeur ou les tissus embryonnaires environnants. Cela nous permet d’examiner comment micro-environnementales conditions influence cardiomyocyte sort transitions à résolution de cellule unique au sein de l’embryon intact. Nous décrivons ici un protocole dans lequel myocytes embryonnaires peut être isolés à partir d’une variété de sous-domaines cardiaques, dissociées, fluorescent étiquetés et ont été micro dans des embryons de hôte avec une grande précision. Cellules peuvent ensuite être analysées directement in situ en utilisant une variété de techniques d’imagerie et histologiques. Ce protocole est une puissante alternative à l’expérimentation greffage traditionnelle qui peut être extrêmement difficile dans un tissu mobile tels que le cœur. Le schéma général de cette méthode peut s’adapter à une variété de tissus de donneurs et environnements hôtes et sa facilité d’utilisation, faible coût, et vitesse rendent une application potentiellement utile pour une variété d’études sur le développement.

Après 24 h d’incubation, le cœur et surround tissu d’hôte embryons ont été isolés, photographié (Figure 1A) et traitement pour analyse par immunofluorescence. Dans cet exemple, donneur myocytes auriculaires ont été microinjected dans la proepicardium d’une multitude de mises en scène similaire embryon. L’embryon de l’hôte était taché alors avec le marqueur de muscle (MF20 vert) et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; bleu). Les cellules injectées (rouge) sont clairement visibles (Figure 1B). Ajustements possibles à examiner si les cellules ne sont pas visibles comprennent : tissus du donneur a été digéré plus (les cellules seraient incapables de fixer), solution teintée d’étiquetage a été trop dilué, les cellules sont trop lavés ou plusieurs divisions cellulaires a entraîné une perte de l’étiquette.
Pour confirmer que les cellules injectées dans cet exemple ont été myocardiques, nous avons sectionné optiquement cet embryon à l’aide d’un microscope confocal (Figure 1C-E). Les seules cellules positives MF20 au sein de la proepicardium (PE) sont les cellules positives rouges fluorescents qui ont été circonscrits implantés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> Figure 1 : Des images représentatives des embryons isolement 24 heures post injection. Image de fond clair de faible grossissement (A) de la région du tronc d’un embryon de poussin E3.5 (HH étape 19). Cellules d’affichage d’image fusionnée injecté (B) (rouges), cardiomyocytes (verts) et DAPI. Les cellules ont été isolées de l’oreillette et micro dans le proepicardium. (C) l’imagerie confocale fort grossissement montrant étiquetés cellules dans le noyau de la proepicardium. (D) l’imagerie confocale fort grossissement confirmant CT rouge marqué des cellules est des cardiomyocytes. (E) en trois dimensions (3D) reconstruction des cellules injectées par des panneaux D et E. At, oreillettes ; OFT, des voies de sortie ; PE, proepicardium ; VT, ventricule ; MF20, myosine 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Dans cette méthode, les tissus cardiaques embryonnaires sont chirurgicalement microdissected, dissocié, fluorescent étiquetés et implanté dans les tissus embryonnaires de l’hôte. Ceci fournit une plate-forme pour l’étude de l’organisation du développement niveau individuel ou de tissus dans des conditions hémodynamiques ectopiques, et/ou altération paracrine/juxtacrine environnements.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Ce protocole nous aide à déterminer comment les altérations de la biomécanique locale, de l’architecture tissulaire, des environnements paracrines et des interactions juxtacrines influencent le phénotype cellulaire. Cette technique nous permet d’explorer les paradigmes classiques et l’embryologie expérimentale sans causer les insultes tissulaires à grande échelle qui apparaissent normalement dans les expériences graphiques traditionnelles. Pour trouver la bonne pression pour l’injection, il est utile de commencer à une pression d’injection plus faible et d’augmenter progressivement jusqu’à ce qu’un flux régulier de cellules soit atteint.La visualisation de cette technique permet de comprendre directement comment l’équipement d’injection doit être positionné par rapport au tissu cible. Deux membres de mon laboratoire, Trevor Henley et Kandace Thomas, démontreront la procédure. 24 heures avant l’implantation, tirez les capillaires en verre sur un puller de micropipette selon les protocoles standard et trempez les capillaires dans l’agent siliconizing pour enduire les surfaces externes des aiguilles.Ensuite, chargez 5 à 10 microlitres d’agent siliconizing dans une pointe de pipette de microinjection et placez la pointe dans l’extrémité large d’un capillaire en verre tiré extérieurement enduit. Placez la pointe de la pipette aussi près que possible de la pointe de l’aiguille en verre et éjectez l’agent siliconant tout en rétractant lentement la pipette de chargement pour minimiser les bulles d’air à l’intérieur de l’aiguille. Laissez l’agent siliconizing dans l’aiguille en verre pendant 10 minutes avant d’utiliser une nouvelle pipette de chargement pour aspirer la solution.Ensuite, séchez les aiguilles dans une hotte de fumée pendant la nuit. Pour la préparation de l’embryon hôte, incuber des œufs de poulet fertiles dans une orientation horizontale dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius et utiliser des forceps inclinés pour faire une ponction de plus d’un millimètre de diamètre dans le fond de l’extrémité plate de chaque œuf le long de l’équateur d’oeufs. Insérez une aiguille de calibre 18 fixée à une seringue de 10 millilitres dans la perforation pour enlever environ cinq millilitres d’albumen.Et appliquer du ruban transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Marquer la région enregistrée le long du dessus de l’œuf avec des forceps inclinés et utiliser des ciseaux à ténotomie incurvée pour couper une fenêtre d’environ 2,5 centimètres dans la section scotchée de l’œuf. Inspecter et mettre en scène l’embryon en fonction des critères établis par Hamburger et Hamilton et utiliser une seringue d’un millimètre munie d’une aiguille de calibre 32 pour injecter environ 200 microlitres d’une dilution d’une à cinq de l’encre de Chine dans le HBSS sous l’embryon.Sceller ensuite la ponction avec du ruban transparent et ajouter un millilitre de HBSS drop-wise sur le disque embryonnaire avant de sceller la coquille vitrée avec du film de paraffine pour le placement de l’œuf dans l’incubateur humidifié. Lorsque les embryons atteignent le stade 19 de Hamburger et hamilton, rincer les capillaires en verre enduit de silicone avec de l’eau déionisée et laisser sécher les capillaires pendant trois à quatre heures à température ambiante. Entre-temps, transférer un embryon d’un œuf dans une boîte petri de 100 x 15 millimètres contenant du HBSS stérile à température ambiante et placer le plat au microscope stéréo.À l’aide de forceps, de ciseaux de ténotomie et d’une micro spatule, isoler tout le cœur embryonnaire de l’embryon et isoler les atriés du cœur. Placer le tissu auriculaire dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de HBSS sur la glace. Lorsque tout le tissu donneur a été recueilli, pelleter les tissus par centrifugation dans une microcentrifugeuse à angle fixe.Pour la digestion des tissus donneurs, suspendre à nouveau les granulés dans un millilitre de trypsine EDTA préchauffé à 05 % pendant une incubation de 15 minutes dans un bloc thermique secouant à 300 rotations par minute. À la fin de l’incubation, pipette la solution de digestion à plusieurs reprises pour briser tout tissu restant et pelleter le lysate cardiaque par centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de solution neutralisante de trypsine pour une autre centrifugation suivie d’une nouvelle suspension dans 400 microlitres de solution de colorant fluorescent rouge.Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, pelleter les cellules par centrifugation pour un à trois lavages dans un millilitre de HBSS par lavage. Puis re-suspendre les cellules étiquetées à cinq fois dix à la quatrième cellule par concentration de microlitre dans hbss frais. Pour l’injection in vivo des cellules donneuses, rechargez la suspension cellulaire dans une pipette capillaire en verre sèche traitée au silicone telle que démontrée et montez la pipette dans l’appareil de microinjecteur de pression.Transférer chaque embryon hôte à injecter de l’incubateur humidifié dans un porte-ovules sous un microscope à dissection stéréo fluorescente. Et utilisez des forceps fins stériles pour ouvrir la membrane vitelline. Faire une incision de 5 à un millimètre dans le péricarde et positionner le microinjecteur de telle sorte que la pointe de l’aiguille de microinjection pénètre dans le tissu cible.Réglez le microinjecteur pour appliquer des impulsions simples de 5 secondes de durée et allant de 100 à 400 hectopascals en pression. Et injectez la pression dans les cellules. Il est essentiel de vérifier une implantation cellulaire réussie en imagerie du signal fluorescent avant de réédager l’œuf.L’embryon peut également être photographié pour documenter cette procédure. Lorsque toutes les cellules ont été injectées, retirez l’appareil de microinjecteur et retirez l’œuf du support. Ajouter ensuite un millilitre de hbss chaud drop-wise sur l’embryon.Sceller l’œuf avec du ruban adhésif transparent et remettre l’œuf dans l’incubateur humidifié pendant 24 heures après l’implantation. Ici, le coeur et le tissu environnant d’un coeur embryonnaire d’hôte après implantation atriale de myocyte de donateur est montré. Dans cette expérience représentative, les cellules donneuses ont été microinjectées dans le proepicardium d’un embryon hôte d’un stade similaire.La sectionnement optique utilisant un microscope confocal a indiqué que les seules cellules positives de marqueur cardiaque de muscle dans le proepicardium étaient les globules positifs rouges fluorescents focalement implantés. Prenez soin de ne pas trop manipuler l’embryon receveur car les ruptures dans le cœur et la vascularisation locale causée par l’aiguille d’injection peuvent entraîner une réduction de la viabilité. Après cette procédure, une variété d’analyses en aval peuvent être effectuées, y compris l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et le tri cellulaire.L’agent silicium est extrêmement inflammable et extrêmement toxique. Il doit toujours être manipulé avec soin et équipement de protection individuelle approprié à l’intérieur d’un capot de fumée.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Recherche

Biologie du développement

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead implantation dans l&#39;embryon de poisson zèbre

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

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The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

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In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome profilage des<em&gt; In-Vivo</em&gt; embryons de bovins pré-implantation à l&#39;aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

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Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

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