Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט R00HL122360 מן המכון הלאומי לבריאות, הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI).

כל השיטות המתוארות לדבוק הנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת צפון קרולינה בצ'פל היל.
1. הכנת מיקרו-הזרקת פיפטות
<ol><li>משוך נימים זכוכית באמצעות של פולר micropipette. עבור כמה זריקות, המחט שיפוע מומלץ כפי שהיא מספקת של השטח מושחזות ללא זיהומים מבנית. כדי לעשות זאת, פולנית סוף מחט משך על גלגל מסגרת משופעת בזווית של 45 מעלות למשך דקות 15−20. הערה: ההגדרות המדויק עבור משיכת ישתנו בהתאם פולר בשימוש. הקוטר הפנימי הסופי של השיקוע צריך להיות בין 20−40 מיקרומטר.</li>
	<li>מעיל של משטחי זכוכית נימי עם סיליקון פנימיים וחיצוניים. קודם לטבול את המחטים, הסוכן siliconizing לו מעיל על המשטח החיצוני של המחט, ואז backload הפתרון הסוכן siliconizing אל כל micropipette כדי להרגיע את השטח הפנימי. הערה: ציפוי של הנימים זכוכית צריך להיעשות 24 שעות לפני הניסוי השרשה. ציפוי זכוכית נימי הדם עם סיליקון מספק משטח אינרטי מבחינה כימית אל הזכוכית. אם הנימים נותרים ללא טיפול, התליה תא שנוצרו בשלבים מאוחר יותר לדבוק הזכוכית וחבר את המחט. לכן, ציפוי הוא הכרחי וחיוני להצלחת השיטה. זהירות: הסוכן siliconizing היא תערובת זמינים מסחרית מוכנות של heptane ב 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (טבלה של חומרים). זה דליק ביותר בחריפות רעילים. תמיד לטפל עם עיקרון השוויון הפוליטי הנכון בתוך ברדס fume.<ol>
<li>כדי backload המחט, לטעון ~ 5−10 µL של סוכן siliconizing לתוך טיפ מיקרו-הזרקת פיפטה (טבלה של חומרים). מקם את הטיפ מיקרו-הזרקת בסוף רחב של הזכוכית משך נימי ומקם את הטיפ עד למטה ככל האפשר (קרוב קצה המחט זכוכית). הוצא את הסוכן siliconizing בעת הסרת לאט על פיפטה העמסה על מנת למזער את בועות האוויר במחט.</li>
		<li>להשאיר את הסוכן siliconizing המחט זכוכית 10 דקות, להסיר על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה טעינה חדשה ולאפשר מחטים יבש ללון בשכונה fume.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בבוקר של הניסוי, לשטוף את נימים זכוכית עם מים יונים בעקבות ההליך בשלב 1.2 ולאפשר לייבוש על 3−4 h.</li>
</ol>2. אופן ההכנה של פתרונות
<ol><li>להכין 5 מ של טריפסין נטרול פתרון על ידי שכשהם מ 4.2 ל בינונית ששונה הנשרים של Dulbecco, התערובת של בשר חזיר מזין F12 (DMEM/F12) עם 750 µL של העובר שור סרום (FBS), µL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין. לאחסן ב 37 ° C עד השימוש.</li>
	<li>להכין 5 מיקרומטר תיוג לצבוע פתרון על-ידי pipetting µL 5 מניות 1 מ מ תיוג צבען (ב דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד], טבלה של חומרים) לתוך µL 995 של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS). מערבולת 1 דקות, חנות ב 37 ° C עד השימוש.</li>
	<li>להכין טרי paraformaldehyde (PFA) על ידי שילוב של 10 מ"ל של 32% PFA פתרון מניות 62 מ של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית ו- 8 מ של 10 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). הריכוז הסופי הוא 4% מחברים ב- 1 x DPBS.</li>
</ol>3. הכנת העוברים מארח
<ol><li>דגירה ביצי עוף פורייה כיוון אופקי ב חממה humidified ב 38 ° C עד המבורגר והמילטון (HH) 19 בשלב10. הערה: השלב שבחרת עבור מניפולציה הוא תלוי לחלוטין המטרות של כל ניסוי בודדות וגמישים.</li>
	<li>ניקוד בסוף "שטוח" קליפת ביצה לאורך קו המשווה ביצה באמצעות מלקחיים בזווית כדי לעשות נקב קטן > 1 מ מ קוטר. המחט של 18 גרם עם מזרק מצורף 10 מ"ל דרך הניקוב ולהסיר ~ 5 מ של אלבומין. הערה: מיקום אנטומי זה הוא חיצוני לתא"אוויר" בתוך הביצה ושומר אלבומין דולף לאחר הניקוב. השלב זה מומלץ כמו זה "מפיל" את העובר מן הקליפה ביצה, מניעת נזק פוטנציאלי והשלבים הבאים.</li>
	<li>השקוף חלות על החלק העליון של קליפת ביצה. ציון עם מלקחיים בזווית וחותכים חלון ס מ ~2.5 באמצעות מספריים tenotomy מעוקל.</li>
	<li>לבדוק בשלב העובר על פי קריטריונים שנקבעו על-ידי המבורגר והמילטון10 , לאטום הניקוב מהשלב 3.2 עם סלוטייפ. הערה: כאן, שלב HH 19 עוברי משמשים אשר יש somites 37−40 לעומק ניצן הזנב. לא צריך להיות חתום הניקוב עד לאחר החלון נפתח לאורך החלק העליון של הביצה (שלב 3.3).</li>
	<li>להזריק ~ 200 µL תערובת דיו הודו/HBSS (1:5) מתחת העובר באמצעות מחט 32 G עם מזרק מצורף 1 מ"ל. הערה: אינדיה אינק מספק חדות חזותית בין העובר לבין החלמון מתחת. חלופה צבענים כמו נייטרלי אדום או זמינים מסחרית ציאן חלבון פלואורסצנטי (CFP) או מערכות סינון קרינה פלואורסצנטית כחול חלבון פלואורסצנטי (BFP) יכול לשמש כדי לשפר את הניגודיות.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של HBSS dropwise אל הדיסק העוברי, לאטום פגזים חלון עם סרט פרפין. מניחים ביצים בחזרה בחממה humidified עד מוכן להזרקה.</li>
</ol>4. בידוד של רקמה
<ol><li>דגירה לתרומת ביציות עוף פורייה ב חממה humidified ב 38 ° C עד שלב HH 19 (או השלב הרצוי).</li>
	<li>מוציאים את העובר מהביצה ומניחים בצלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ המכיל HBSS סטרילי בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>בניתוח microdissect פרפור רקמה של כל העובר על ידי לראשונה לבודד את הלב העוברי כל העובר ולאחר מכן על-ידי בידוד של אטריה מכל הלב באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy ו- microspatula תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ. בריכה צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל 1 מ"ל של HBSS על הקרח.</li>
	<li>לאחר שנאספו כל רקמה, גלולה הרקמה על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ב- microcentrifuge זווית קבועה.</li>
</ol>5. טריפסין העיכול של רקמה
<ol><li>Resuspend תא כדורי ב 1 מ"ל של טריפסין 0.05% prewarmed-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתוך גוש חום חזק ב 300 סל ד. לחלופין, להשתמש באמבט מים עם עצבנות מחזוריים של המדגם.</li>
	<li>Pipette הפתרון עיכול למעלה ולמטה כדי לשבור את כל רקמות הנותרים, גלולה כמו שלב 4.4.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של טריפסין נטרול פתרון וצנטריפוגה כמו שלב 4.4.</li>
	<li>Resuspend תאי µL 400 של פלורסנט אדום תיוג פתרון לצבוע, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתוך גוש חום. לחלופין, להשתמש באמבט מים.</li>
	<li>לאחר סיום התגובה תיוג, גלולה התאים כמו שלב 4.4 ולשטוף עם 1 מ"ל של HBSS (מספר שטיפת השלבים יכולים להיות מגוונים בין 1 ל- 3).</li>
	<li>Resuspend התאים שכותרתו, מגורען-ריכוז של ~ 50,000 תאים/µL, שתוצאתה בדרך כלל אמצעי העבודה µL 5−10 בהתאם התשואה cell סך הכל. הערה: תא ריכוזים מתחת ~ 50,000 תאים/µL יכול לגרום יעילות הזרקת המסכן.</li>
</ol>6. ב- vivo הזרקה
<ol><li>Backload התליה תא לתוך נימי סיליקון הזכוכית שטופלו פיפטה ביצוע הפרוצדורות בשלב 1.2. בעיא פיפטה של המנגנון microinjector הלחץ.</li>
	<li>להסיר את העוברים מארח חממה humidified ולמקם מחזיק ביצה מתחת הסטריאו פלורסנט לנתח מיקרוסקופ.<ol>
<li>פתח את הקרום vitelline באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי, עושים חתך קטן (~0.5−1.0 מ מ אורך) בהכפורת. ייתכן שיהיה צורך מניפולציה נוספים/ניתוח בהתאם לאזור היעד להזרקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את microinjector כך קצה המחט microinjection חודר את רקמת המטרה.<ol>
<li>הלחץ להזריק תאי, ויש להשתמש בתווית פלורסנט כדי לקבוע כי תאים מושתל נמצאים בתוך הרקמה הרצויה. לזריקות טיפוסי, החל פולסים יחיד פחות מ- 0.5 s במשך זמן הנע בין 100-400 hectopascals בלחץ. הערה: ללחץ מוחלט לאורכה של הדופק משתנה בהתאם מספר התאים כדי להיות מוזרק, יכול להיות שונה כדי להתאימה לצרכיו האישיים.</li>
		<li>. משכי את המנגנון microinjector ולהסיר את הביצה ממחזיק אחרי הזרקת לחץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של HBSS חמים dropwise אל העובר, לאטום ביצים באמצעות דבק סלוטפ שקוף, דגירה בחממה humidified ב 38 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה שלאחר ההשתלה.</li>
</ol>7. בידוד וניתוח
<ol><li>לבודד את העוברים מארח ב- RT HBSS באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy microspatula דומה לשלב 4.3, ותקן ב 4% מחברים בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין.</li>
	<li>לשטוף את העוברים 3 x 5 דקות ב- HBSS ב RT עם נדנדה עדין, ולאחסן ב- HBSS ב 4 ° C עבור במורד הזרם ניתוח נוסף (מיקרוסקופ, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה מקומיים, וכו '.).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

היכולת להגדיר איך microenvironmental תנאים ההשפעה תא לב גורל מפרט, שושלת היוחסין מייצב הוא היסוד ליצירת הבנה compressive של מולדת מחלת לב גם כדי לפתח פרוטוקולים יעיל עבור נכונה ההבשלה של תאי גזע או תאים סומטיים reprograming מבוססי cardiomyocytes. הפרוטוקול המתוארים לעיל נותן חוקרים היכולת ישירות assay תא לב פיתוח תחת ששונו תנאי ויוו, המאפשרות התא תהליכי התבגרות אוטונומית מהדת רמזים paracrine/juxtacrine ו/או בגרימת. בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, ניתוח גנטי של מבחני פיזיולוגיים, טכניקה זו יכול לשמש כהשלמה עוצמה קיימים מודלים מהונדס.
טופס נקודה טכנית לעמוד, פרוטוקול המובאת כאן מסתמך על בידוד יעיל, תיוג, ועל ההשתלה מדויק של תאי הלב התורם לרקמות עובריים המארח. השימוש של מערכת microinjection מאוד מסייע המיקוד של תאי התורם ומאפשר להשתלה מוצלחת ללא צורך יצירת אתר גדול engraftment ברקמות הפונדקאי. מיומנות תפעולית מסוימת נדרש לבצע טכניקה זו אולם, הכדאיות מופחת יכול לגרום אם המחט הזרקה לא ממוקם היטב ברקמות היעד (גורם קרע של הלב, או להערכת המקומי). ומחשבה תינתן גם בידוד, צעדים תיוג. על העיכול של התורם רקמות יכול להוביל יעילות ההשתלה המסכן, ארעי תיוג טכניקות יכול להגביל את חלון הזמן שבו תאי התורם ניתן לעקוב (כמו חלוקת התא יכול לדלל את התווית).
טכניקה זו היא מאוד לשינוי, ניתן להתאים למגוון רחב של מטרות. לדוגמה, התורם תאים מתוך מגוון גדול של רקמות ו בשלבים יכול להיות מבודד (למרות אופטימיזציה של עיכול אנזימטי נדרשת) והוא יכול באופן דומה להיות מוזרק במגוון רחב של רקמות המארח ברחבי בשלבים שונים של פיתוח. באופן דומה, ניתן לשנות את הגישה תיוג כדי לעקוב אחר תאים על פני חלונות טמפורלית שונים, לרבות השימוש של מוליכים למחצה אורגניים פלורסנט nanocrystals עבור תיוג יותר ארעית ההשתלה של תאים שליו או תאים מ גרין חלבון פלואורסצנטי הטרנסגניים (GFP) התורם עוברי11 עבור תיוג permeant.
בעוד אנחנו כעת להשתמש בטכניקה זו ללימודי השרשה העופות, אנו חשים כי זה יכול לשמש למגוון גדול של מחקרים chimeric בעתיד. לדוגמה, תאי לב גנטית שונה של אורגניזמים הטרנסגניים יכול להיות מבודדת, microinjected ללב העופות באמצעות פרוטוקול דומה מאוד. יתר על כן, תאים הבדיל לתוך cardiomyocytes מ נובעת תאים או באמצעות תאים סומטיים reprograming גישות יכול להיות microinjected לתוך הלב העוברי כדי להעריך את השתלבותם רקמות ו/או התבגרות תחת ויוו ביו-מכני תנאים.

מחקר התפתחותי הלב יש כמיותרים והצרפתית כניסתו של מערכות מודל הטרנסגניים germline אשר זיהו רבים רשתות בקרה רגולטריות הזה שושלות תאים שונים דוגמת ותחומים פונקציונלי בלב. עם זאת, זיהוי כמה רשתות גנים אלה אינטראקציה עם ולהגיב תנאים microenvironmental, כולל paracrine/juxtacrine אותות biophysical תשומות (מתח, מתח, זרם בגרימת), יכול להיות מאתגר. בתור שכזה, זה לא תמיד קל לקבוע אם הפנוטיפ הסלולר מתעוררת כתוצאה ישירה של ההפרעות גנטיות או כתוצאה משנית של התאקלמות לשינויים ביומכניקה הלב או גבוה יותר סדר רקמות קומפוזיציה1,2 .
הרכבה ניסויים, אשר בסגנון קלאסי לשמש כתובת מושגים של מפרט הגורל, ומחויבות, אינדוקציה, מיומנות3,4, מייצגים גישה אידיאלי כדי לעקוף כמה מן האתגרים הטמונה הגדרת תא אוטונומית לעומת השפעה סביבתית בלב. למרבה הצער, התכווצויות הלב להקשות גישות הרכבה סטנדרטי. תנועה מהירה של הרקמה לעתים קרובות מונע תאי המושתל של הקפדה על הלב ועל רקמות גדולות פנצ'רים (בדרך כלל נדרש עבור הרכבה) לעתים קרובות להוביל ספיקת לב ועובריים lethality5,6,7. לכן, פיתחנו מבוסס-לחץ, מערכת microinjection עבור דיוק השרשה הסלולר אל הלב האפרוח המתפתח, עקיפת הקשיים הטכניים של רקמות הרכבה שתוארה לעיל8,9. בעזרת טכניקה זו, בודדים או קבוצות של תאי לב מבודד של העובר התורם יכול להיות microinjected לתוך מגוון של אזורים של לב מארח עובריים ומבטלת את הצורך עבור המארח נרחב הכנה וההעלבות רקמות גדולות שעולות באמצעות טכניקות הרכבה סטנדרטי. המחטים microinjection המשמש עבור מחקרים אלה ההשתלה יש של הקוטר החיצוני של ~ 30−40 מיקרומטר, מה שאומר כי ניתן למקם את המחט ישירות ברקמות היעד (קרי, יכולים לחדור את החומה שריר הלב עובריים) תאים יכול להיות מועברת focally עם נזק מינימלי הרקמה שמסביב. הפרוטוקול יכול לשמש כדי לבצע מגוון איזוטרופי, הטרוטופיות, isochoric, heterochronic מניפולציות, מתן גישה מהירה, גמישות בעלות נמוכה לבחון ישירות קלאסית פרדיגמות embryological ניסיוני בפיתוח תאיים ארבע לב.
בפרוטוקול המפורטות להלן, מתייגים התורם תאים תא permeant הפלורסנט, מה שמאפשר עבור ההצלחה של ניסוי microinjection כדי להיות במעקב בזמן אמת ואת המיקום של תאים engrafted כדי להיות מתועד ללא כל הצורך נוספים מכתים. עם זאת, יש לציין כי גישה זו היא המתאימה ביותר עבור ניסויים לטווח קצר (כ- 48 שעות) כמו הפלורסנט עלול ללכת לאיבוד דרך חלוקת התא. גישות אלטרנטיביות יכול לשמש לניסויים לטווח ארוך יותר.
בזמן שאנו מציגים טכניקה זו בהקשר של התפתחות הלב, השתמשנו בו אפקט נהדר עבור ניסויים השרשה התא לתוך והמזודרם, הראש, הגפיים, ו somites. ככזה הגישה הבסיסית המתוארת להלן הוא צייתן מאוד והוא יכול לשמש במגוון של מערכות איברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

לפרש את ההשפעה היחסית של תא המתבנת אוטונומית לעומת חיצוני microenvironmental השפעה על שושלת היוחסין תא בנחישות מייצג אתגר כללי בחקר ביולוגיה התפתחותית. בלב עובריים, זה יכול להיות קשה במיוחד כמו הבדלים אזוריים הביטוי של גנים ברמת השעתוק וסתים, רמזים איתות paracrine/juxtacrine, ואת כוח והמודינמיקה ידועים כדי להשפיע על cardiomyocyte ההבשלה. שיטה פשוטה כדי לשנות microenvironment biomechanical המולקולריים של cardiomyocyte המתפתח, לכן, לשמש טכניקה חזקה כדי לבחון איך מקומי תנאים השפעה גורל ותפקוד. כדי לטפל בבעיה זו, אנו יש אופטימיזציה שיטה פיזית השתלת cardiomyocytes לנוער לתוך מקומות חוץ רחמי הלב או עובריים הרקמה שמסביב. זה מאפשר לנו לבחון איך microenvironmental תנאים השפעה cardiomyocyte הגורל מעברים ברזולוציה תא בודד בתוך העובר תקין. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו נייטרלים עובריים יכול להיות מבודדת ממגוון רחב של תחומי המשנה לב הפומבית, הנקרא fluorescently, microinjected לתוך המחשב המארח העוברים עם דיוק גבוהה. התאים ניתן לאחר מכן ישירות לנתח באתרו תוך שימוש במגוון טכניקות הדמיה היסטולוגית. פרוטוקול זה היא חלופה חזקה ניסויים הרכבה מסורתי זה יכול להיות קשה מדי בממחטת נע כגון הלב. התכנית הכללית של שיטה זו גם ניתן להתאים מגוון רחב של התורם רקמות וסביבות המארח, קלות השימוש, עלות נמוכה, ולעשות את מהירות זה יישום שעשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים.

לאחר 24 שעות דגירה, את הלב ואת היקפי רקמות של מארח העוברים היו מבודדים, צולם (איור 1א'), מעובד עבור ניתוח immunofluorescent. בדוגמה זו, היו נייטרלים פרפור התורם microinjected לתוך proepicardium של מחשב מארח בשלבים דומים העובר. העובר המארח היה מוכתם ואז עם הסמן שרירים (MF20 ירוק) ו- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי; כחול). שהוחדר תאים (אדום) הם בבירור (איור 1B). כוללים התאמות אפשריות לשקול אם התאים אינם גלויים: רקמה היה מתעכל מעל (תאים יהיה אפשרות לצרף), תיוג לצבוע הפתרון היה גם שתדללו, התאים היו שטף יתר או חלוקות תאים מרובים, גרמו לאובדן של התווית.
כדי לוודא כי התאים מוזרק בדוגמה זו היו שריר הלב, אנחנו שטיחות למחלקה זו העובר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1C-E). התאים MF20 החיובית היחידה בתוך proepicardium (PE) הם תאים פלורסנט חיובי אדום זה השתילו focally.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> איור 1 : להחליפן בתמונות של העוברים מבודד 24 שעות שלאחר הזרקת. (א) הגדלה נמוכה brightfield תמונה של אזור המטען של העובר צ'יק E3.5 (HH שלב 19). (B) ממוזג תמונת מראה הזרקת תאים (אדום), cardiomyocytes (ירוק) ודאפי. התאים הם בודדו אותנו מהמתרחש אטריה, microinjected לתוך proepicardium. (ג) בהגדלה קונאפוקלית הדמיה מציג בתווית תאים הליבה של proepicardium. (D) בהגדלה הדמיה קונאפוקלית המאשרת CT אדום עם התווית תאים הם cardiomyocytes. (E) תלת מימדי (3D) שחזור של תאים מוזרק לוחות D ו- E. ב, אטריה; OFT, יצוא בדרכי; PE, proepicardium; Vt, החדר; . MF20, צולבות הקישור חוטים שרירן 4 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

פרוטוקול זה מסייע לנו לקבוע כיצד שינויים בביומכניקה מקומית, ארכיטקטורת רקמות, סביבות פרקטריניות ואינטראקציות בין-ספקטרינות משפיעים על פנוטיפ תאי. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור פרדיגמות קלאסיות ועוברים ניסיוניים מבלי לגרום לעלבונות רקמות בקנה מידה גדול המתעוררים בדרך כלל בניסויי גרפים מסורתיים. כדי למצוא את הלחץ הנכון להזרקה, זה מועיל להתחיל בלחץ הזרקה נמוך יותר ולהגדיל בהדרגה עד זרימה קבועה של תאים מושגת.הדמיה של טכניקה זו מסייעת בהשגת הבנה ישירה של האופן שבו ציוד ההזרקה צריך להיות ממוקם ביחס לרקמת היעד. הדגמת ההליך תהיה שני חברים במעבדה שלי, טרבור הנלי וקנדס תומאס. 24 שעות לפני ההשתלה, למשוך נימי זכוכית על מושך micropipette על פי פרוטוקולים סטנדרטיים לטבול את נימים בסוכן סיליקון כדי לצפות את המשטחים החיצוניים של המחטים.לאחר מכן, לטעון 5 עד 10 microliters של סוכן סיליקון לתוך קצה פיפטה microinjection ולמקום את הקצה בקצה הרחב של נימי זכוכית אחד מצופה חיצונית משך. מקם את קצה פיפטה קרוב לקצה מחט זכוכית ככל האפשר ולפלט את סוכן סיליקון תוך נסיגה איטית פיפטה טעינה כדי למזער בועות אוויר בתוך המחט. השאירו את סוכן הסיליקון במחט הזכוכית למשך 10 דקות לפני השימוש בפיפטת טעינה חדשה כדי לשאף את הפתרון.ואז לייבש את המחטים במכסה המנוע אדים לילה. להכנת עובר מארח, חגירה ביצי עוף פוריות בכיוון אופקי באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולהשתמש מלקחים זוויתיים לעשות ניקוב בקוטר של יותר ממילימטר בתחתית הקצה השטוח של כל ביצה לאורך קו המשווה ביצה. הכנס מחט מד 18 מחובר מזרק 10 מיליליטר לתוך הדקירה כדי להסיר על חמישה מיליליטר של אלבומן.ולהחיל סרט שקוף על החלק העליון של קליפת הביצה. ציון האזור המודבק לאורך החלק העליון של הביצה עם ממטרים זוויתיים ולהשתמש מספריים tenotomy מעוקל לחתוך חלון כ 2.5 ס"מ בחלק המודבק של הביצה. לבדוק ולביים את העובר על סמך הקריטריונים שנקבעו על ידי המבורגר והמילטון ולהשתמש מזרק מילימטר אחד מצויד מחט 32 מד להזריק כ 200 microliters של אחד עד חמישה דילול של הודו דיו HBSS מתחת לעובר.לאחר מכן לאטום את הניקוב עם סרט שקוף ולהוסיף מיליליטר אחד של HBSS טיפה חכם על הדיסק העוברי לפני איטום הקליפה חלון עם סרט פרפין למיקום הביצה בחזרה לתוך החממה לחה. כאשר העוברים מגיעים להמבורגר והמילטון שלב 19, שוטפים את נימי הזכוכית מצופים הסיליקון במים מיונים ומאפשרים נימים להתייבש במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להעביר עובר מביצה אחת לתוך צלחת פטרי 100 על ידי 15 מילימטר המכיל טמפרטורת החדר סטרילי HBSS ולה מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו.באמצעות מדפים, מספריים tenotomy ומיקרו מרית, לבודד את הלב העוברי כולו מן העובר ולבודד את האטריה מהלב. מניחים את הרקמה פרוזדרית בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של HBSS על קרח. כאשר כל רקמת התורם נאספה, גלולה את הרקמות על ידי צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה זוויתית קבועה.לעיכול רקמת התורם, להשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של EDTA 05%trypsin מחומם מראש עבור דגירה 15 דקות בבלוק חום רועד ב 300 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, פיפטה פתרון העיכול מספר פעמים כדי לשבור את כל הרקמה הנותרת גלולה ליאזט הלב על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של פתרון נטרול טריפסין עבור צנטריפוגה אחרת ואחריו השעיה מחדש ב 400 microliters של פתרון צבע פלואורסצנטי אדום.לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה עבור אחד עד שלושה שטיפות במיליליטר אחד של HBSS לכל לשטוף. ואז להשעות מחדש את התאים המסווים בחמש פעמים עשר לתאים הרביעיים לכל ריכוז microliter ב HBSS טרי. עבור הזרקת vivo של התאים התורמים, לטעון בחזרה את ההשעיה התא לתוך יבש, סיליקון שטופלו פיפטה נימי זכוכית כפי שהודגם ולהוות את פיפטה לתוך מנגנון microinjector לחץ.מעבירים כל עובר מארח להזרקה מהאינקובטור הלח למחזיק ביצים תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו פלואורסצנטי. ולהשתמש במטליות דק סטריליות כדי לפתוח את קרום הויטליין. בצע חתך 5 עד 1 מילימטר ב pericardium ולמקם את microinjecter כך קצה מחט microinjection חודר רקמת היעד.הגדר את microinjector להחיל פולסים בודדים של 5 שניות משך נע בין 100 ל 400 hectopascals בלחץ. ולהזריק את התאים בלחץ. זה קריטי כדי לאמת השתלת תא מוצלחת על ידי הדמיה אות פלואורסצנטי לפני כריתה מחדש של הביצה.ניתן גם לצלם את העובר כדי לתעד הליך זה. כאשר כל התאים הוזרקו, לסגת מנגנון microinjector ולהסיר את הביצה מהמחזיק. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של HBSS חם טיפה חכם על העובר.לאטום את הביצה עם סרט אריזה שקוף ולהחזיר את הביצה לחה החממה במשך 24 שעות לאחר ההשתלה. כאן, הלב ואת הרקמה שמסביב של לב עוברי מארח לאחר השתלת מיוציט פרוזדור התורם מוצג. בניסוי מייצג זה, התאים התורמים היו microinjected לתוך הפרופיקרדיום של עובר מארח של שלב דומה.חתך אופטי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי גילה כי התאים החיוביים היחידים של סמן שריר הלב בתוך הפרופיקרדיום היו התאים החיוביים האדומים הפלורסנטיים המושתלים. יש לדאוג לא יתר על כן לתפעל את העובר המטופל כמו קרעים בלב וסקולטורה מקומית הנגרמת על ידי מחט ההזרקה יכול לגרום הכדאיות מופחתת. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מגוון של בדיקות במורד הזרם, כולל אימונוהיסטוכימיה, בהכלאה באתרו ומיון תאים.סוכן הסיליקון הוא דליק מאוד ורעיל מאוד. זה תמיד צריך להיות מטופל עם טיפול וציוד מגן אישי נאות בתוך מכסה המנוע אדים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...