Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por grant R00HL122360 do National Institutes of Health, nacional do coração, pulmão e sangue Institute (NHLBI).

Todos os métodos descritos seguem diretrizes de cuidados com animais de The University of North Carolina em Chapel Hill.
1. preparação da microinjecção pipetas
<ol><li>Puxe os capilares de vidro usando um extrator da micropipeta. Para algumas injeções, bisel da agulha é recomendada pois fornece uma superfície extremamente afiada desprovida de impurezas estruturais. Para fazer isso, polir o fim de uma agulha puxada em uma roda de chanfradura em um ângulo de 45° para min 15−20. Nota: As configurações exatas para puxar irão variar com base no extrator sendo usado. O diâmetro interno final do bisel deve estar entre 20−40 µm.</li>
	<li>Revesti as superfícies internas e externas do vidro capilar com silicone. Primeiro Mergulhe as agulhas no agente siliconizing para revestir a superfície externa da agulha e depois carregue a solução de agente siliconizing em cada micropipeta para revestir a superfície interna. Nota: O revestimento dos capilares de vidro deve ser feito 24 h antes da experiência de implantação. Revestimento dos capilares de vidro com silicone fornece uma superfície quimicamente inerte ao vidro. Se os capilares são deixados sem tratamento, a suspensão de células gerada em etapas posteriores irá aderir ao vidro e conecte a agulha. Portanto, o revestimento é necessário e vital para o sucesso do método. Atenção: O agente siliconizing é uma mistura de comercialmente disponível ready-made de heptano e 1,7-dicloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabela de materiais). É extremamente inflamável e agudamente tóxicos. Sempre manuseie com EPI adequado dentro de uma coifa.<ol>
<li>Para Retrocarregue a agulha, carregar ~ 5−10 µ l do agente siliconizing em uma ponta da pipeta de injeção de micro (Tabela de materiais). Colocar a ponta da microinjecção no final de largura do vidro puxado capilar e posicione a ponta, tanto para baixo quanto possível (perto da ponta da agulha de vidro). Ejete o agente siliconizing enquanto lentamente, retirar a pipeta de carregamento a fim de minimizar as bolhas de ar na agulha.</li>
		<li>Deixar o agente siliconizing com a agulha de vidro para 10 min, retire por aspiração com uma pipeta de carregamento novo e permitir agulhas secar durante a noite em uma coifa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A manhã do experimento, enxagúe os capilares de vidro com água desionizada, seguindo o procedimento na etapa 1.2 e deixar para secar durante 3−4 h.</li>
</ol>2. preparação de soluções
<ol><li>Prepare-se 5 mL de tripsina neutralizando a solução completando 4,2 mL do médio modificados da águia de Dulbecco e nutriente mistura do Ham F12 (DMEM/F12) com 750 µ l de soro bovino Fetal (FBS) e 50 µ l de penicilina/estreptomicina. Armazenar a 37 ° C até o uso.</li>
	<li>Prepare-se 5 µM rotulagem solução corante por pipetagem 5 µ l de estoque de 1 mM rotulagem corante (em Dimetilsulfóxido [DMSO], Tabela de materiais) em 995 µ l de Hank está equilibrada solução salina (HBSS). Vórtice por 1 min e loja a 37 ° C até o uso.</li>
	<li>Prepare-se fresco paraformaldeído (PFA) combinando-se 10 mL da solução-mãe de PFA 32% com 62 mL de água de grau de biologia molecular e 8 mL de 10 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS). A concentração final é 4% PFA em 1 x DPBS.</li>
</ol>3. preparação dos embriões de acolhimento
<ol><li>Incube ovos férteis de galinha em uma orientação horizontal em uma incubadora umidificada em 38 ° C até Hamburger e Hamilton (HH) estágio 1910. Nota: O palco escolhido para manipulação é flexível e inteiramente dependente dos objectivos de cada experiência individual.</li>
	<li>Marcar a extremidade "achatada" da casca do ovo ao longo do Equador do ovo usando fórceps angulado para fazer uma pequena punção > 1 mm de diâmetro. Inserir uma agulha de 18 G com seringa de 10ml anexado através da punção e remover ~ 5 mL de albumina. Nota: Esta localização anatômica é externa à célula de"ar" dentro do ovo e mantém a albumina vazem uma vez feita a punção. Esta etapa é recomendada, pois ela "desce" o embrião longe a casca do ovo, evitando possíveis danos nas etapas subsequentes.</li>
	<li>Aplique a fita transparente para o topo da casca do ovo. Marcar com pinça angular e cortar uma janela de ~2.5 cm com uma tesoura curva para tenotomia.</li>
	<li>Inspecionar e estágio do embrião com base em critérios estabelecidos pela Hamburger e Hamilton10 e selar a punção da etapa 3.2 com fita transparente. Nota: Aqui, embriões de etapa 19 HH são usados que têm 37−40 somitas estendendo-se para o broto de cauda. A punção não deve ser selada até depois que a janela é aberta na parte superior do ovo (passo 3.3).</li>
	<li>Injete ~ 200 µ l de mistura de tinta nanquim/HBSS (1:5) sob o embrião usando uma agulha 32G com seringa de 1ml anexado. Nota: tinta nanquim fornece contraste visual entre o embrião e a gema abaixo. Alternativa de corantes como neutra comercialmente disponível ou vermelha ciana proteína fluorescente (PCP) ou conjuntos de filtros de fluorescência azul proteína fluorescente (BFP) podem ser usados para melhorar o contraste.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de HBSS, gota a gota no disco embrionário e selar conchas em janelas com película de parafina. Coloque os ovos em incubadora umidificada até que esteja pronto para a injeção.</li>
</ol>4. isolamento do tecido do doador
<ol><li>Incube a doadora de óvulos férteis de galinha numa incubadora umidificado a 38 ° C até 19 HH de fase (ou estágio desejado).</li>
	<li>Remover o embrião do ovo e coloque em um prato de petri 100 x 15 mm contendo HBSS estéril à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Cirurgicamente microdissect tecido atrial doador de cada embrião primeiro isolar todo o coração embrionário do embrião e isolando-se dos átrios do coração usando pinça, tesoura tenotomia e microspatula sob um estéreo microscópio de dissecção. Piscina em um tubo de microcentrifugadora mL 1,5 estéril contendo 1 mL de HBSS no gelo.</li>
	<li>Uma vez que todo o tecido doador tenha sido coletado, pelota o tecido por centrifugação a 1000 x g por 5 min a 4 ° C, em uma ângulo fixo microcentrifuga.</li>
</ol>5. digestão de tripsina do tecido do doador
<ol><li>Resuspenda pelotas de células em 1 mL de escaldadas 0.05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C por 15 min em um bloco de calor tremendo a 300 rpm. Como alternativa, use um banho de água com agitação periódica da amostra.</li>
	<li>Adicionar a solução de digestão acima e para baixo para quebrar qualquer tecido restante e pelota como na etapa 4.4.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 1 mL de neutralizar a solução e centrifugar como na etapa 4.4 a tripsina.</li>
	<li>Ressuspender as células em 400 µ l de vermelho fluorescente, rotulando a solução corante e incubar a 37 ° C por 20 min em um bloco de calor. Como alternativa, use um banho de água.</li>
	<li>Finalizada a reação de rotulagem, as células como na etapa 4.4 de pelotas e lavar com 1 mL de HBSS (número de lavagem etapas podem ser variadas entre 1 e 3).</li>
	<li>Ressuspender as células em uma concentração de ~ 50.000 células / µ l, que geralmente resulta em um volume de trabalho 5−10 µ l dependendo do rendimento total da célula rotuladas, peletizadas. Nota: Concentrações de célula abaixo ~ 50.000 células / µ l podem resultar em eficiência de injeção pobre.</li>
</ol>6. in vivo injeção
<ol><li>Carregue a suspensão de células para uma pipeta capilar de silicone vidro Tratado seguindo os procedimentos na etapa 1.2. Monte a pipeta no aparelho de microinjector de pressão.</li>
	<li>Retirar embriões de anfitrião da incubadora umidificada e coloque em um suporte de ovo debaixo o fluorescente estéreo microscópio de dissecção.<ol>
<li>Abrir a membrana vitelínico usando pinça fina estéril e faça uma pequena incisão (~0.5−1.0 mm de comprimento) no pericárdio. Manipulação/dissecação adicional podem ser necessários dependendo da região de destino para a injeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posicione o microinjector tal que a ponta da agulha microinjeção penetra o tecido-alvo.<ol>
<li>Pressão injetar células e usar a etiqueta fluorescente para determinar que as células implantadas estão presentes no tecido desejado. Para injeções típicas, aplicam-se pulsos único a menos de 0,5 s em duração variando de 100-400 hectopascals na pressão. Nota: Duração de pulso e pressão absoluta irão variar dependendo do número de células a ser injetado e podem ser modificados para atender necessidades individuais.</li>
		<li>Retrair o aparelho microinjector e remova o ovo do suporte após injeção de pressão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 1 mL de HBSS quente gota a gota até o embrião, selar ovos usando fita de embalagem transparente e incubar na incubadora umidificada a 38 ° C para implantação do posto de 24h.</li>
</ol>7. isolamento e análise
<ol><li>Isolar os embriões de anfitrião em RT HBSS usando a pinça, tesoura tenotomia e microspatula semelhante ao passo 4.3 e corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C, com balanço suave.</li>
	<li>Lavar 3 x 5 min de embriões em HBSS em RT com balanço suave e armazene em HBSS a 4 ° C para uma análise mais adicional a jusante (microscopia, imuno-histoquímica, hibridização in situ, etc.).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A capacidade de definir como microenvironmental condições impacto cardíaco célula destino especificação e linhagem estabilização é fundamental para criar um entendimento à compressão de cardiopatia congênita, bem como para desenvolver protocolos eficientes para adequado maturação de células-tronco ou células somáticas cardiomyocytes reprograming-baseado. O protocolo descrito acima dá os investigadores a capacidade de ensaio diretamente o desenvolvimento da célula cardíaca sob alterado condições in vivo, permitindo processos de maturação autônoma celular ser separado de pistas parácrina/justácrina e/ou hemodinâmicas. Quando combinado com imagens de alta resolução, análise genética e fisiológicos ensaios, esta técnica pode servir como um complemento poderoso para modelos transgénicos existentes.
Formar um ponto de vista técnico, o protocolo aqui apresentado se baseia em isolamento eficiente, rotulagem e implantação precisa das células do coração doador em tecidos embrionários de anfitrião. O uso de um sistema de microinjeção grandemente ajuda a atingir as células do doador e permite a implantação bem sucedida sem a necessidade de criação de um site grande enxertia no tecido do hospedeiro. Alguma habilidade operacional é necessário para realizar esta técnica, no entanto, como viabilidade reduzida pode resultar se a agulha de injeção não é cuidadosamente colocada no tecido-alvo (causando a ruptura do coração ou da vasculatura local). Cuidados e pensamento também deve ser dado ao isolamento e rotulação passos. Sobre a digestão do dador tecido pode levar a eficiência de implantação pobre e transiente rotulagem técnicas pode limitar a janela de tempo durante o qual as células do doador podem ser rastreadas (como divisão celular pode diluir o rótulo).
Esta técnica é altamente modificável e pode ser adaptada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, doador de células de uma grande variedade de tecidos e estágios podem ser isolados (embora otimização da digestão enzimática é necessária) e pode similarmente ser injetado em uma variedade de tecidos do hospedeiro através de diferentes estágios de desenvolvimento. Da mesma forma, a abordagem de rotulagem pode ser modificada para rastrear as células através de janelas temporais diferentes, incluindo o uso de nanocristais semicondutores inorgânicos fluorescente para a rotulagem mais transitória e implantação de células de codorna ou de verde proteína fluorescente transgênico (GFP +) doador embriões11 para a rotulagem de permeant.
Enquanto atualmente usamos essa técnica para estudos de implantação aviária, achamos que poderia ser usado para uma grande variedade de estudos quiméricoes no futuro. Por exemplo, células cardíacas geneticamente alteradas de organismos transgénicos podem ser isoladas e injetadas no coração aviária usando um protocolo muito semelhante. Além disso, células diferenciadas em cardiomyocytes de caules de células ou através de células somáticas reprograming abordagens podem ser injetadas no coração embrionário para avaliar a sua integração no tecido e/ou maturação sob vivo em biomecânica condições.

Investigação do desenvolvimento cardíaca tem beneficiado enormemente o advento dos sistemas de transgénicos modelo germline que identificaram muitas das redes de regulação do gene que linhagens de células diferentes do padrão e domínios funcionais no coração. No entanto, identificando como estas redes gene interagirem e respondem às condições microenvironmental, incluindo sinais parácrina/justácrina e biofísicas entradas (estiramento, pressão, fluxo hemodinâmico), pode ser desafiador. Como tal, não é sempre fácil determinar se um fenótipo celular surge como uma consequência direta de uma perturbação genética ou como um resultado secundário de uma adaptação a alterações na biomecânica cardíaca ou maior ordem tecido composição1,2 .
Enxertia experimentos, classicamente utilizados conceitos de endereço de especificação de destino, o compromisso, indução e competência3,4, representaria uma abordagem ideal para contornar alguns dos desafios inerentes Definir célula autônoma contra a influência ambiental no coração. Infelizmente, as contrações do coração dificultam padrão abordagens de enxertia. Rápido movimento do tecido muitas vezes impede que as células transplantadas aderindo ao coração e tecido grande perfurações (normalmente exigidos para enxertia) frequentemente levar a insuficiência cardíaca e letalidade embrionárias5,6,7. Portanto, nós desenvolvemos um baseado em pressão, sistema de microinjeção para implantação celular de precisão ao coração da garota em desenvolvimento, contornando os obstáculos técnicos de enxerto de tecido descrito anteriormente8,9. Usando esta técnica, individuais ou pequenos grupos de células cardíacas isoladas de um embrião de doador podem ser injetados em uma variedade de regiões de um coração embrionário de anfitrião, eliminando a necessidade de acolhimento extensa preparação e os insultos de tecido grande que surgem usando técnicas de enxertia padrão. As agulhas de microinjeção utilizadas para estes estudos de implantação têm um diâmetro exterior de ~ 30−40 µm, o que significa que a agulha pode ser colocada diretamente no tecido-alvo (ou seja, podem penetrar a parede miocárdica embrionária) e células focally podem ser entregues com mínimo de danos para o tecido circundante. O protocolo pode ser usado para executar uma variedade de isotópica, heterotópica, adição e manipulações heterocrónico, proporcionando uma abordagem rápida, flexível e barato para examinar diretamente o clássicas experimentais paradigmas embriológicos no desenvolvimento coração de quatro cavidades.
O protocolo descrito abaixo, nós rotulamos doador de células com uma célula permeant corante fluorescente, que permite o sucesso de um experimento de microinjeção de ser monitorado em tempo real e a localização das células engrafted ser documentados sem necessidade de qualquer adicional a coloração. No entanto, deve notar-se que esta abordagem é mais adequada para experimentos de curto prazo (cerca de 48 h) como o corante fluorescente pode ser perdido através de divisão celular. Abordagens alternativas podem ser usadas para experiências de prazo mais longos.
Enquanto estamos apresentando esta técnica no contexto do desenvolvimento cardíaco, usamos isso com grande efeito para experiências de implantação de célula para a mesoderme, cabeça, membros e somitas. Como tal, a abordagem básica descrita abaixo é altamente tratável e pode ser usada em uma variedade de sistemas de órgãos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

Interpretar o impacto relativo de padronização autónoma de célula versus extrínseca microenvironmental influência na determinação de linhagem celular representa um desafio geral na pesquisa de biologia do desenvolvimento. No coração embrionário, isto pode ser particularmente difícil, como as diferenças regionais na expressão de reguladores transcricionais, pistas de sinalização justácrina/parácrina, e força de hemodinâmica são todos conhecidos para influenciar a maturação de casos. Um método simplificado para alterar o microambiente molecular e biomecânicas de um desenvolvimento casos serviria, portanto, como uma técnica poderosa para examinar como local condições influência célula destino e função. Para resolver isso, otimizamos a um método para transplantar fisicamente cardiomyocytes juvenil em localizações ectópicas no coração ou o tecido embrionário. Isso nos permite examinar como microenvironmental condições influência casos destino transições em resolução única célula dentro do embrião intacto. Aqui, descrevemos um protocolo em que miócitos embrionários podem ser isolados de uma variedade de subdomínios cardíacas, dissociados, fluorescente etiquetados e injetados em embriões de anfitrião com alta precisão. Células podem ser diretamente analisadas no local usando uma variedade de técnicas de imagem e histológicas. Este protocolo é uma poderosa alternativa para experimentos de enxertia tradicionais que pode ser proibitivamente difícil em um tecido em movimento, tais como o coração. Em linhas gerais este método também podem ser adaptada a uma variedade de tecidos de doadores e ambientes de host e sua facilidade de uso, baixo custo, e velocidade de torná-lo uma aplicação potencialmente útil para uma variedade de estudos do desenvolvimento.

Após 24 h incubação, o coração e bordadura tecido do hospedeiro embriões foram isolados, fotografaram (Figura 1A) e processadas para análise de imunofluorescência. Neste exemplo, doador myocytes atrial foram injetadas no proepicardium de um host semelhante encenado embrião. O embrião do anfitrião então estava manchado com o marcador de músculo (MF20 verde) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; azul). As células injetadas (vermelho) são claramente visíveis (Figura 1B). Eventuais ajustamentos para considerar se as células não são visíveis incluem: tecido doador mais foi digerido (células seria não é possível anexar), rotulagem solução corante foi também diluído, as células eram excessivamente lavadas ou múltiplas divisões celulares resultou na perda do rótulo.
Para confirmar que as células injetadas neste exemplo foram miocárdica, nós opticamente seccionado este embrião usando um microscópio confocal (Figura 1C-E). A única MF20 positivo dentro do proepicardium (PE) são as fluorescentes vermelhas positivas células que focally foram implantadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> Figura 1 : Imagens representativas de embriões isolaram 24 horas pós injeção. (A) imagem de brightfield baixa ampliação da região de tronco de um embrião do pintinho E3.5 (HH estágio 19). (B) células de exibição de imagem mesclada injectada (vermelhas), cardiomyocytes (verde) e DAPI. As células foram isoladas a partir dos átrios e injetadas no proepicardium. (C) imagem confocal de alta ampliação mostrando rotulado de células no núcleo do proepicardium. Imagem latente confocal de alta magnificação de (D) confirmar CT vermelho rotulado células é cardiomyocytes. (E) reconstrução tridimensional (3D), de células injetadas de painéis, D e E. No, átrios; OFT, trato de saída; PE, proepicardium; VT, ventrículo; MF20, miosina 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Este protocolo nos ajuda a determinar como alterações na biomecânica local, arquitetura tecidual, ambientes paracrinos e interações justacrinas influenciam o fenótipo celular. Essa técnica nos permite explorar paradigmas clássicos e embriologia experimental sem causar os insultos teciduais em larga escala que normalmente surgem em experimentos gráficos tradicionais. Para encontrar a pressão certa para a injeção, é útil começar com uma pressão de injeção mais baixa e aumentar gradualmente até que um fluxo constante de células seja alcançado.Visualizar essa técnica ajuda a entender diretamente como o equipamento de injeção precisa ser posicionado em relação ao tecido alvo. Demonstrando o procedimento serão dois membros do meu laboratório, Trevor Henley e Kandace Thomas. 24 horas antes da implantação, puxe capilares de vidro em um puxador de micropipette de acordo com os protocolos padrão e mergulhe os capilares em agente de silício para revestir as superfícies externas das agulhas.Em seguida, carregue de 5 a 10 microliters de agente de silício em uma ponta de pipeta de microinjeção e coloque a ponta na extremidade larga de um capilar de vidro puxado externamente revestido. Posicione a ponta da pipeta o mais perto possível da ponta da agulha de vidro e ejete o agente de silício enquanto retrai lentamente a pipeta de carregamento para minimizar as bolhas de ar dentro da agulha. Deixe o agente silício na agulha de vidro por 10 minutos antes de usar uma nova pipeta de carregamento para aspirar a solução.Em seguida, seque as agulhas em um capô de fumaça durante a noite. Para a preparação do embrião hospedeiro, incubar ovos de galinha férteis em uma orientação horizontal em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius e usar fórceps angulares para fazer uma punção de diâmetro maior que um milímetro na parte inferior da extremidade plana de cada ovo ao longo do equador do ovo. Insira uma agulha de calibre 18 presa a uma seringa de 10 mililitros na punção para remover cerca de cinco mililitros de albumen.E aplique fita transparente no topo da casca de ovo. Marque a região colada ao longo da parte superior do ovo com fórceps angulares e use uma tesoura curva de tenotomia para cortar uma janela de aproximadamente 2,5 centímetros na seção colada do ovo. Inspecione e enseque o embrião com base nos critérios estabelecidos por Hamburger e Hamilton e use uma seringa de um milímetro equipada com uma agulha de calibre 32 para injetar cerca de 200 microliters de uma diluição de uma a cinco tintas da Índia no HBSS sob o embrião.Em seguida, sele a punção com fita transparente e adicione um mililitro de HBSS em forma de gota no disco embrionário antes de selar a casca com filme de parafina para colocação do ovo de volta na incubadora umidificada. Quando os embriões chegarem ao Hambúrgueres e à etapa 19 de Hamilton, enxágue os capilares de vidro revestidos de silicone com água deionizada e deixe os capilares secarem por três a quatro horas em temperatura ambiente. Enquanto isso, transfira um embrião de um ovo para uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros contendo HBSS de temperatura ambiente estéril e coloque a placa sob um microscópio estéreo.Usando fórceps, uma tesoura de tenotomia e uma micro espátula, isole todo o coração embrionário do embrião e isole a atria do coração. Coloque o tecido atrial em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril contendo um mililitro de HBSS no gelo. Quando todo o tecido do doador tiver sido coletado, pelota os tecidos por centrifugação em uma microcentrifuagem angular fixa.Para digestão de tecido do doador, suspenda as pelotas em um mililitro de edta de 05% de trippsina pré-aquecida para uma incubação de 15 minutos em um bloco de calor tremendo a 300 rotações por minuto. No final da incubação, pipeta a solução de digestão várias vezes para quebrar qualquer tecido restante e pelotas o lysate cardíaco por centrifugação. Suspenda a pelota em um mililitro de solução neutralizante de trippsina para outra centrifugação seguida de re-suspensão em 400 microliters de solução de corante fluorescente vermelho.Após 20 minutos a 37 graus Celsius, pelota as células por centrifugação para uma a três lavagens em um mililitro de HBSS por lavagem. Em seguida, suspenda novamente as células rotuladas em cinco vezes dez para as quartas células por concentração de microliter em HBSS fresco. Para injeção in vivo das células doadoras, recarregue a suspensão celular em uma pipeta capilar de vidro seca e tratada com silicone, como demonstrado e monte a pipeta no aparelho microinjetor de pressão.Transfira cada embrião hospedeiro para ser injetado da incubadora umidificada em um suporte de ovo sob um microscópio de dissecação estéreo fluorescente. E use fórceps finos estéreis para abrir a membrana vitelline. Faça uma incisão de 5 a um milímetro no pericárdio e posicione o microinjetor de tal forma que a ponta da agulha de microinjeção penetra o tecido alvo.Defina o microinjetor para aplicar pulsos únicos de 5 segundos de duração e variando de 100 a 400 hectopascals em pressão. E injetar pressão nas células. É fundamental verificar uma implantação celular bem sucedida através da imagem do sinal fluorescente antes de ressar o óvulo.O embrião também pode ser fotografado para documentar este procedimento. Quando todas as células tiverem sido injetadas, retraia o aparelho microinjetor e remove o óvulo do suporte. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS quente em forma de gota no embrião.Sele o ovo com fita adesiva transparente e devolva o ovo à incubadora umidificada por 24 horas após a implantação. Aqui, o coração e o tecido circundante de um coração embrionário hospedeiro após a implantação de mócito atrial doador é mostrado. Neste experimento representativo, as células doadoras foram microinjetadas no proepiácdio de um embrião hospedeiro de um estágio semelhante.A seção óptica usando um microscópio confocal revelou que as únicas células positivas do marcador muscular cardíaco dentro do proepiácdio eram as células positivas vermelhas fluorescentes implantadas focalmente. Tome cuidado para não manipular demais o embrião receptor, pois rupturas no coração e vasculatura local causada pela agulha de injeção podem resultar em viabilidade reduzida. Após este procedimento, uma variedade de ensaios a jusante pode ser realizada, incluindo imunohistoquímica, hibridização in situ e triagem celular.O agente silício é extremamente inflamável e extremamente tóxico. Deve ser sempre manuseado com cuidado e equipamento de proteção individual adequado dentro de um capô de fumaça.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...