Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грант R00HL122360 от национальных институтов здравоохранения, национальной сердца, легких и крови института (NHLBI).

Все методы, описанные соблюдать руководящие принципы ухода за животными в Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл.
1. Подготовка микро инъекции пипетки
<ol><li>Вытяните стеклянных капилляров с помощью микропипеткой съемник. Для некоторых инъекции игла фаски рекомендуется как она обеспечивает чрезвычайно острые поверхности лишено структурных примесей. Для этого, польский конце вытащил иголку на колесо фаски под углом 45 ° для 15−20 минут. Примечание: Точные настройки для буксировки будет меняться в зависимости от съемник используется. Последний внутренний диаметр скоса должна быть между 20−40 мкм.</li>
	<li>Герб внутренних и внешних поверхностей стеклянный капилляр с силиконом. Сначала опустите иглы в siliconizing агент для покрытия внешней поверхности иглы, а затем валидатор siliconizing агент решения в каждом микропипеткой для покрытия внутренней поверхности. Примечание: Покрытие стеклянных капилляров должно быть сделано 24 ч до имплантации эксперимент. Покрытие стекла капилляров с силиконовой обеспечивает химически инертный поверхности стекла. Если остаются капилляров необработанной, суспензию клеток, образующихся в последующих шагах будет придерживаться стекла и вставьте иглу. Таким образом покрытие является необходимым и жизненно важным для успеха метода. Предупреждение: Siliconizing агент является смесью коммерчески доступных готовых гептана и 1,7-дихлор-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Таблица материалов). Это чрезвычайно легковоспламеняющиеся и острой токсичностью. Всегда обращаться с надлежащей СИЗ внутри зонта.<ol>
<li>На тыльной стороне иглы, нагрузка ~ 5−10 мкл siliconizing агента в кончика пипетки микро инъекции (Таблица материалов). Место кончике микро инъекции в широкий конец вытащил стекла капилляров и Расположите наконечник как далеко вниз как можно скорее (недалеко от кончик иглы стекла). Удаляя медленно загрузки дозаторов для того, чтобы свести к минимуму пузырьков воздуха в иглу извлечь siliconizing агент.</li>
		<li>Оставить siliconizing агента в стеклянных иглу за 10 мин, удалить, аспирационных с новой загрузки дозаторов и позволяют иглы высохнуть на ночь в зонта.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Утром эксперимента, промойте деионизованной воды после процедуры на шаге 1.2 стеклянные капилляры и дайте высохнуть на 3−4 h.</li>
</ol>2. Приготовление растворов
<ol><li>Подготовьте 5 мл трипсина, нейтрализуя решение путем дополнения 4.2 мл Дульбекко изменение орла средних и ветчиной в питательной смеси F12 (DMEM/F12) с 750 мкл плода Bovine сыворотки (ФБС) и 50 мкл пенициллина/стрептомицина. Хранить при 37 ° C до использования.</li>
	<li>Подготовить 5 мкм, маркировки раствор красителя, дозирования 5 мкл акций 1 мм, маркировки краситель (в диметилсульфоксида [ДМСО], Таблица материалов) в 995 мкл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS). Вихрь за 1 мин и хранить при 37 ° C до использования.</li>
	<li>Подготовьте свежие параформальдегида (PFA) путем объединения 10 мл 32% PFA Стоковый раствор с 62 мл воды молекулярной биологии класса и 8 мл 10 x Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS). Конечная концентрация составляет 4% ПФА в 1 x DPBS.</li>
</ol>3. Подготовка принимающей эмбрионов
<ol><li>Инкубируйте плодородные куриные яйца в горизонтальной ориентации в увлажненные инкубатор 38 ° C до гамбургеров и Гамильтон (HH) этап 1910. Примечание: Этап, выбрали для манипуляции является гибкой и полностью зависит от цели каждого индивидуального эксперимента.</li>
	<li>Оценка «плоского» конец яичной скорлупы вдоль экватора яйцо с помощью угловой щипцы сделать небольшой прокол > 1 мм в диаметре. Вставьте иглу 18 G с прилагаемой 10 мл шприц через прокол и удалить ~ 5 мл альбумина. Примечание: Это анатомическое расположение является внешним по отношению к «воздушные ячейки» внутри яйца и предотвращает утечки после пункции альбумина. Этот шаг рекомендуется как он «падает» эмбриона от яичной скорлупы, предотвращая потенциальный ущерб в последующих шагах.</li>
	<li>Применить прозрачную ленту к верхней части скорлупы яиц. Оценка угловой пинцетом и прорубил окно ~2.5 см ножницами изогнутые тенотомия.</li>
	<li>Инспектировать и стадии эмбриона, основанные на критериях, установленных гамбургер и Гамильтон10 и герметизации проколов на шаге 3.2 с прозрачной лентой. Примечание: Здесь, этап HH 19 эмбрионов используются, которые имеют 37−40 сегменты в зародыше хвост. Прокол не должны быть закрыты до, после открытия окна в верхней части яйцо (шаг 3.3).</li>
	<li>Придать ~ 200 мкл чернил Индии/HBSS смесь (1:5) под эмбрионов, с помощью иглы 32 G с прилагаемой 1 мл шприц. Примечание: чернила Индии обеспечивает визуальный контраст между зародышем и желток под. Альтернативные краски как нейтрального красного или коммерчески доступных голубой флуоресцентный белок (СЛП) или наборы фильтров флуоресценции синий флуоресцентный белок (БПС) может использоваться для улучшения контрастности.</li>
	<li>Добавьте 1 mL HBSS каплям на эмбриональных диск и уплотнение оконных снаряды с парафином фильм. Поместите яйца обратно в увлажненные инкубаторе до готовности для инъекций.</li>
</ol>4. изоляция донорской ткани
<ol><li>Инкубируйте доноров плодородные куриные яйца в увлажненные инкубатора в 38 ° C до стадии HH 19 (или нужный этап).</li>
	<li>Удаление эмбриона из яйца и место в чашке Петри 100 мм х 15 мм, содержащие стерильные HBSS при комнатной температуре (RT).</li>
	<li>Хирургическим microdissect предсердий доноров ткани от каждого эмбриона сначала изоляции всей эмбриональных сердце из эмбриона и затем изолируя предсердий сердца с помощью щипцов, тенотомия ножницы и microspatula под стерео, рассекает микроскопом. Бассейн в стерильных 1,5 мл microcentrifuge тубы с 1 мл раствора HBSS на льду.</li>
	<li>После того, как были собраны все донорской ткани, окатышей ткани центрифугированием на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C в фиксированный угол microcentrifuge.</li>
</ol>5. Пищеварение трипсина доноров ткани
<ol><li>Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл подогретую трипсина 0,05%-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C 15 мин в блоке пожимая тепла в 300 об/мин. Кроме того используете на водяной бане с периодическим перемешиванием образца.</li>
	<li>Пипетка пищеварение решение вверх и вниз, чтобы разрушить любые оставшиеся ткани и Пелле как в шаге 4.4.</li>
	<li>Ресуспензируйте гранулы в 1 мл трипсина, нейтрализации раствора и центрифуги как в шаге 4.4.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в 400 мкл красный люминесцентные маркировки раствор красителя и инкубировать при 37 ° C 20 мин в блоке тепла. Кроме того используете на водяной бане.</li>
	<li>По окончании обозначая реакции Пелле клетки как в шаге 4.4 и мыть с 1 мл раствора HBSS (количество мыть шаги может изменяться от 1 до 3).</li>
	<li>Ресуспензируйте Приклеенные этикетку, гранулированных клетки в концентрации ~ 50 000 клеток/мкл, что обычно приводит к 5−10 мкл рабочего объема в зависимости от урожайности ячейке. Примечание: Концентрации клеток ниже ~ 50 000 клеток/мкл может привести к плохой инъекции эффективности.</li>
</ol>6. в vivo инъекций
<ol><li>Валидатор банкнот BackLoad суспензию клеток в Силиконовой обработанного стекла капиллярные пипетки после процедур, описанных в шаге 1.2. Смонтируйте пипеткой в аппарате microinjector давления.</li>
	<li>Снять хост эмбрионов увлажненные инкубатора и место в яйцо держатель под люминесцентные стерео, рассекает микроскопом.<ol>
<li>Открыть vitelline мембраны, с использованием стерильных тонкой щипцами и сделать небольшой надрез (~0.5−1.0 мм в длину) в перикарда. Дополнительные манипуляции/диссекции может быть необходимо в зависимости от целевого региона для инъекций.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Позиция microinjector, таким образом, чтобы кончик иглы микроинъекции проникает в ткани-мишени.<ol>
<li>Давление вставки ячейки и использовать флуоресцентные метки, чтобы определить, что имплантированные клетки присутствуют в желаемой ткани. Для типичных инъекции, применять единый импульсов меньше, чем 0,5 s в срок, начиная от 100-400 hectopascals давления. Примечание: Длительность импульса и абсолютное давление будет варьироваться в зависимости от количество клеток для инъекций и могут быть изменены с учетом индивидуальных потребностей.</li>
		<li>Убрать аппарат microinjector и удалите яйцо из держателя после инъекции давление.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Добавьте 1 mL теплого HBSS каплям на эмбрион, печать с использованием прозрачной упаковочной ленты яйца и инкубировать в увлажненные инкубатора в 38 ° C для имплантации пост 24 h.</li>
</ol>7. изоляция и анализ
<ol><li>Изолировать хост эмбрионов в HBSS RT, используя пинцет, тенотомия ножницы и microspatula похоже на шаг 4.3 и исправить в 4%, PFA на ночь при 4 ° C с плавное покачивание.</li>
	<li>Промыть плавное покачивание эмбрионы 3 x 5 мин, в HBSS на RT и хранить в HBSS на 4 ° C для дальнейшего течению анализа (микроскопия, иммуногистохимия, гибридизации in situ и т.д.).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Возможность определения как microenvironmental условий воздействия сердечной клетки судьба спецификации и линии стабилизации имеет основополагающее значение для создания компрессионных понимание врожденный порок сердца, а также относительно разработки эффективных протоколов для правильного созревание стволовых клеток или соматической клетки перепрограммирования основе кардиомиоцитов. Протокол изложенные выше дает следователей, возможность непосредственно анализа развития сердечных клеток под изменены в естественных условиях условий, позволяя для процессов автономной созревания клеток должны быть отделены от паракринными/juxtacrine и/или гемодинамики подсказки. В сочетании с высоким разрешением изображения, генетический анализ и физиологических анализов, этот метод может служить мощным дополнением к существующим transgenic моделей.
Форма технического стоять точка, протокола, представленные здесь зависит от эффективной изоляции, маркировки и точные имплантации в принимающей эмбриональных тканей донора клеток сердца. Использование системы микроинъекции значительно СПИДа в ориентации клеток донора и позволяет для успешной имплантации без необходимости создания сайта большой приживления в ткани узла. Некоторые оперативных навыков, необходимых для выполнения этот метод, однако, как снижение жизнеспособности может привести, если тщательно инъекционной иглы не помещается в ткани-мишени (вызывая разрыв сердца или местных сосудистую). Для изоляции и маркировки шаги следует также уход и мысли. Над перевариванию доноры ткани может привести к плохой имплантации эффективности, и переходные маркировки методы можно ограничить время окно, над которым доноров клеток могут быть отслежены (как деление клеток можно разбавить этикетке).
Этот метод является весьма изменяемым и может быть адаптирована для различных целей. Например доноров клетки от широкий спектр тканей и этапов может быть изолирован (хотя требуется оптимизация ферментативного пищеварения) и аналогичным образом быть введены в различных тканях хост на различных этапах развития. Аналогично обозначая подход может быть изменен отслеживать клетки на различных временных окон, включая использование флуоресцентных неорганических полупроводниковых нанокристаллов больше временной маркировки и имплантации перепелиные клетки или клетки от Грин флуоресцентный белок трансгенных (GFP +) донорских эмбрионов11 для permeant нанесения этикеток.
Хотя в настоящее время мы используем этот метод для исследования птичьего имплантации, мы считаем, что он может использоваться для большого круга химерных исследований в будущем. Например генетически измененных сердечной клетки от трансгенных организмов могут изолированные и microinjected в птичий сердце с помощью весьма аналогичный протокол. Кроме того клетки делятся на кардиомиоцитов из стебли клетки или через соматические клетки перепрограммирования подходы могут microinjected в эмбриональных сердце, чтобы оценить их интеграции в ткани и/или созревания под в-vivo биомеханических условий.

Сердца развития исследований чрезвычайно выиграли от появления микрофлорой трансгенные модели систем, которые определили многие из генных сетей регулирования, что шаблон различных клеточных линий и функциональные домены в самом сердце. Однако определение как эти генных сетей взаимодействовать с и реагировать на microenvironmental условиях, включая паракринными/juxtacrine сигналов и биофизических входы (стрейч, штамм, гемодинамики потока), может быть сложным. Таким образом это не всегда легко определить ли клеточном фенотипу возникает как прямое следствие генетического возмущений или побочным результатом адаптации к изменениям в сердечной биомеханики или выше порядок ткани состав1,2 .
Прививка экспериментов, которые классически были использованы для адрес понятия судьбы спецификации, приверженности, индукция и компетенции3,4, будет представлять идеальный подход для обхода некоторых из проблем, присущих определение в самом сердце клетки автономной против влияния окружающей среды. К сожалению сердечных сокращений затрудняют стандартные прививочных подходы. Быстрое движение ткани часто предотвращает привитые клетки от присоединения к сердцу и большие ткани проколов (обычно требуется для прививки) часто приводят к сердечной недостаточности и эмбриональных летальность5,6,7. Таким образом мы разработали на основе давления, микроинъекции системы для точности сотовой имплантации в развивающихся куриных сердце, обойти технические препятствия трансплантации тканей описанные ранее8,9. Используя эту технику, отдельных лиц или небольших групп сердечной клетки изолированы от эмбриона донора может быть microinjected в различных регионах хост эмбриональных сердца, устраняя необходимость подготовки обширные хост и большой ткани оскорбления, которые возникают с использованием стандартные методы прививочных. Микроинъекции иглы, используемые для этих исследований имплантации имеют наружный диаметр ~ 30−40 мкм, что означает, что иглы могут быть размещены непосредственно в ткани-мишени (то есть, могут проникать эмбриональных миокарда стены) и клетки могут поставляться централизовано с минимальное повреждение окружающих тканей. Протокол может использоваться для выполнения различных изотопов, heterotopic, Изохорный и heterochronic манипуляций, обеспечивая быстрое, гибкое и лоу кост подход непосредственно изучить классических экспериментальных эмбрионального парадигмы в развивающихся 4-сердце.
В протоколе, изложенные ниже, мы обозначаем доноров клеток с ячейки permeant Флюоресцентная краска, которая позволяет в режиме реального времени наблюдать за успех эксперимента микроинъекции и расположение прижившимися клетки, чтобы быть документально без необходимости для любого дополнительного пятнать. Следует, однако, отметить, что такой подход лучше всего подходит для краткосрочных экспериментов (около 48 ч) как Флюоресцентная краска может быть потеряны через деление клеток. Альтернативные подходы могут использоваться для долгосрочной перспективе экспериментов.
Хотя мы представляем эту технику в контексте развития сердца, мы использовали его для большой эффект для клеток экспериментов имплантации в мезодермы, головы, конечностей и сегменты. Таким образом основной подход, описанный ниже весьма шансов справиться с возникающими и может использоваться в различных органов и систем.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

Интерпретация относительное влияние автономной патронирования клетки против внешняя microenvironmental влияние на определение линии клеток представляет собой общий вызов в биологии развития исследований. В самом зачаточном состоянии это может быть особенно трудно, как региональные различия в выражении транскрипционный анализ регуляторов, паракринными/juxtacrine сигнализации сигналы, и гемодинамических силы известны влиять cardiomyocyte созревания. Таким образом, упрощенный метод, чтобы изменить развивающихся cardiomyocyte молекулярной и биомеханических микроокружения послужит мощным инструментом для изучения местных условий влияние клеток судьба и функции. Для решения этой проблемы, мы оптимизировали способ физически трансплантировать несовершеннолетних кардиомиоцитов в внематочная места в сердце или окружающих эмбриональных тканей. Это позволяет нам рассматривать как microenvironmental влияние условий cardiomyocyte судьба переходы в одну ячейку резолюции в рамках нетронутыми эмбриона. Здесь мы описываем протокол, в котором эмбриональных миоцитах может быть изолирован от целого ряда сердечных суб-доменов, отделить, дневно помечены и microinjected в принимающей эмбрионов с высокой точностью. Клетки могут затем быть непосредственно проанализированы на месте, с использованием различных методов обработки изображений и гистологические. Этот протокол является мощной альтернативой традиционным прививочных экспериментов, которые могут быть чрезмерно сложной в движущейся ткани, такие как сердце. В общих чертах этот метод также может быть адаптирована к различных средах размещения и тканей донора и его простота использования, низкая стоимость, и скорость делают его потенциально полезное приложение для целого ряда исследований в области развития.

После 24 ч инкубации, сердце и объемного ткани узла эмбрионы были изолированы, сфотографировали (рис. 1A) и обработаны для immunofluorescent анализа. В этом примере миоцитах предсердий доноров были microinjected в proepicardium же поставил хоста эмбриона. Эмбриона хост был затем витражи с маркером мышц (MF20 зеленый) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; синий). Вводили клетки (красный) являются четко видны (рис. 1Б). Возможные корректировки для рассмотрения, если клетки не видны включают: донорской ткани более переваривается (клетки будет не в состоянии приложить), маркировки раствор красителя был слишком разреженных, клетки были чрезмерно промывают, или несколько клеточных делений привели к потере метки.
Чтобы подтвердить, что вводили клетки в этом примере были миокарда, мы оптически секционного этот эмбрион с помощью конфокального микроскопа (C-Eрис. 1). Только позитивные клетки MF20 в proepicardium (PE) являются флуоресцентные красный позитивные клетки, которые были имплантированы централизовано.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> Рисунок 1 : Представитель изображения эмбрионов изолированные 24 часа пост инъекций. (A) малое увеличение brightfield изображение области ствола эмбриона куриных E3.5 (HH этап 19). (B) Merged изображения показаны вводили клетки (красный), кардиомиоцитов (зеленый) и DAPI. Клетки были изолированы от предсердий и microinjected в proepicardium. (C) конфокальная томография высокого увеличения показаны помечены клетки в ядро proepicardium. (D) высокое увеличение конфокальная томография подтверждающие КТ красной меткой клетки являются кардиомиоцитов. (E) трехмерной (3D) реконструкция вводили клетки из панелей, D и E. В, предсердиями; УДК, отток тракта; PE, proepicardium; VT, желудочка; MF20, миозин 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

В этом методе эмбриональных тканей сердца являются хирургическим microdissected, отделить, дневно помечены и имплантируется в принимающей эмбриональных тканей. Это обеспечивает платформу для изучения отдельных тканей уровня развития Организации или внематочная гемодинамических условий, и/или изменены паракринными/juxtacrine сред.

Микроинъекции системы в Vivo имплантации эмбриона кардиомиоцитов птичьего эмбриона

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Этот протокол помогает нам определить, как изменения в местной биомеханики, архитектуре тканей, паракринной среде и джукстакриновых взаимодействиях влияют на клеточный фенотип. Этот метод позволяет нам исследовать классические парадигмы и экспериментальную эмбриологию, не вызывая масштабных оскорблений тканей, которые обычно возникают в традиционных графинговых экспериментах. Чтобы найти правильное давление для инъекций, полезно начать с более низкого давления инъекций и увеличиваться постепенно, пока не будет достигнут устойчивый поток клеток.Визуализация этого метода помогает в достижении прямого понимания того, как инъекционное оборудование должно быть расположено по отношению к ткани-мишени. Демонстрацией процедуры будут два члена моей лаборатории, Тревор Хенли и Кэндис Томас. За 24 часа до имплантации потяните стеклянные капилляры на шкив микропипта в соответствии со стандартными протоколами и окуните капилляры в силиконизирующий агент, чтобы покрыть внешние поверхности игл.Далее загрузите от 5 до 10 микролитров силиконизирующего агента в наконечник пипетки микроинъекции и поместите наконечник в широкий конец одного внешне покрытого вытянутого стеклянного капилляра. Распоитите наконечник пипетки как можно ближе к кончику стеклянной иглы и выбросит силиконизирующий агент, медленно убирая погрузочную пипетку, чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха внутри иглы. Оставьте силиконизирующий агент в стеклянной игле на 10 минут, прежде чем использовать новую погрузочную пипетку для аспирации раствора.Затем высушите иглы в дымовой капот на ночь. Для подготовки эмбриона хозяина, инкубировать плодородные куриные яйца в горизонтальной ориентации во влажном инкубаторе при 38 градусах по Цельсию и использовать угловые типсы, чтобы сделать более одного миллиметра диаметром прокола в нижней части плоского конца каждого яйца вдоль экватора яйца. Вставьте 18 калибровочных игл, прикрепленных к 10 миллилитров шприц в прокол, чтобы удалить около пяти миллилитров альбумена.И нанесите прозрачную ленту на верхнюю часть яичной скорлупы. Оценка лентой области вдоль верхней части яйца с угловой типсов и использовать изогнутые ножницы тенотомии сократить примерно 2,5 сантиметра окна в лентой разделе яйца. Осмотрите и уровень эмбриона на основе критериев, установленных Гамбургером и Гамильтоном, и используйте одномиллиметровый шприц, оснащенный иглой калибра 32, чтобы ввести около 200 микролитров от одного до пяти разбавления индийских чернил в HBSS под эмбрионом.Затем запечатайте прокол прозрачной лентой и добавьте один миллилитр HBSS drop-wise на эмбриональный диск, прежде чем запечатать оконную оболочку парафиновой пленкой для размещения яйца обратно во влажный инкубатор. Когда эмбрионы достигнут стадии Гамбургер и Гамильтон 19, промойте силиконовые стеклянные капилляры с деионизированной водой и дайте капиллярам высохнуть в течение трех-четырех часов при комнатной температуре. В то же время, передача эмбриона из одного яйца в 100 на 15 миллиметров Петри блюдо, содержащее стерильную комнатную температуру HBSS и поместить блюдо под стерео микроскопом.Используя миппы, тенотомию ножницами и микро шпателем, изолируйте все эмбриональное сердце от эмбриона и изолируйте атрию от сердца. Поместите предсердную ткань в стерильную микроцентрифугную трубку 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр HBSS на льду. Когда все донорские ткани были собраны, гранулы тканей центрифугации в фиксированной угловой микроцентрифуг.Для пищеварения донорской ткани повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре предварительно разогретого 05%трипсина ЭДТА в течение 15 минут инкубации в трясущимся тепловом блоке при 300 вращениях в минуту. В конце инкубации, пипетка пищеварения раствор несколько раз, чтобы разбить все оставшиеся ткани и гранулы сердечной лизации центрифугации. Повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре трипсина, нейтрализуя раствор для другой центрифугации с последующим повторной подвеской в 400 микролитров красного флуоресцентного раствора красителя.Через 20 минут при 37 градусах Цельсия гранулы клеток центрифугированием для одного-трех моет в одном миллилитре HBSS за стирку. Затем повторно приостанавливать помеченные клетки в пять раз десять-четвертые клетки на концентрацию микролитора в свежем HBSS. Для инъекции виво донорских клеток, backload клеточной подвески в сухой, силиконовой обработанной стеклянной капиллярной пипетки, как попродемонстрировано, и смонтировать пипетку в аппарат микроинъектора давления.Передача каждого эмбриона-хозяина, который будет введен из увлажняемого инкубатора в держатель яйцеклетки под флуоресцентным стерео рассечением микроскопа. И использовать стерильные тонкие типсы, чтобы открыть вителлиновую мембрану. Сделайте разрез на 5-1 миллиметр в перикардии и распоимите микроинъектер таким образом, чтобы кончик микроинъекции иглы проникал в ткани-мишени.Установите микроинжектор для применения одиночных импульсов продолжительностью 5 секунд и в диапазоне от 100 до 400 гектопаскалей в давлении. И давление-инъекции клеток. Очень важно проверить успешную имплантацию клеток путем визуализации флуоресцентного сигнала до повторного пропечатки яйцеклетки.Эмбрион также можно сфотографировать, чтобы задокументировать эту процедуру. Когда все клетки были введены, втягивать микроинжектор аппарата и удалить яйцо из держателя. Затем добавьте один миллилитр теплого HBSS капли мудрым на эмбрион.Печать яйцо с прозрачной упаковочной лентой и вернуть яйцо во влажный инкубатор в течение 24 часов после имплантации. Здесь показаны сердце и окружающие ткани эмбрионального сердца хозяина после имплантации донорских предсердий миоцитов. В этом репрезентативном эксперименте донорские клетки были микроинъектированы в проэпикардий эмбриона хозяина аналогичной стадии.Оптическое сечение с помощью конфокального микроскопа показало, что единственными положительными клетками сердечного мышечного маркера в проэпикарде были фокусно имплантированные флуоресцентные красные положительные клетки. Позаботьтесь, чтобы не чрезмерно манипулировать эмбриона получателя, как разрывы в сердце и местной сосудов, вызванных инъекционной иглой может привести к снижению жизнеспособности. После этой процедуры, различные анализы вниз по течению могут быть выполнены, в том числе иммуногистохимии, на месте гибридизации и сортировки клеток.Силиконизирующий агент чрезвычайно легковоспламеняющийся и остро токсичный. Она всегда должна быть обработана с осторожностью и надлежащей личной защиты оборудования внутри дыма капот.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя<em&gt; В Vivo</em&gt; И<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализы

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Имплантация в данио рерио эмбрионов

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Транскриптом профилирование<em&gt; In-Vivo</em&gt; Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Малоинвазивный перенос эмбрионов и Витрификация эмбрионов на оптимальном этапе развития эмбриона в кроличьей модели

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...