Name: microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo
Uploaded: 2019-02-17T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Bu eser hibe R00HL122360 Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI) tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak hayvan bakımı yönergeleri, University of North Carolina Chapel Hill uygun.
1. mikro-enjeksiyon pipetler hazırlanması
<ol><li>Cam kılcal bir micropipette çektirmenin kullanarak çekin. Yapısal kirleri yoksun son derece keskin bir yüzey sağlar gibi bazı enjeksiyonlar için iğne eğim önerilir. Bunu yapmak için 15−20 min için 45 ° açılı beveling direksiyona iğne çekti sonuna Lehçe. Not: çekmek için tam ayarları kullanılan çektirme göre değişir. Eğimin son iç çapını 20−40 µm arasında olmalıdır.</li>
	<li>Silikon ile kılcal cam iç ve dış yüzeylerin kat. İlk siliconizing Agent'taki iğne ve sonra backload siliconizing Ajan çözüm iç yüzeyi kat için her micropipette içine dış yüzeyinin kat için iğne batır. Not: Kaplama cam kapiller 24 h implantasyon deneme önce yapılmalıdır. Cam kılcal silikon ile kaplama cama kimyasal olarak inert bir yüzey sağlar. Kılcal bırakılırsa tedavi edilmezse, sonraki adımda oluşturulan hücre süspansiyon uygun cam ve iğne takın. Bu nedenle, kaplama gerekli ve yöntemin başarısı için çok önemli. Dikkat: Siliconizing aracı hazır piyasada bulunan heptane ve 1,7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Malzeme tablo) karışımıdır. Bu son derece yanıcı ve akut toksik olduğunu. Her zaman bir duman başlık içinde uygun KKE ele.<ol>
<li>Backload iğne için yük ~ 5−10 µL bir mikro-enjeksiyon pipet ucu (Tablo reçetesi) içine siliconizing Aracısı. Mikro-enjeksiyon ipucu çekti cam geniş sonuna kapiller yerleştirmek ve ucu kadar aşağı (yakın cam iğne ucu) mümkün olduğunca konumlandırın. Siliconizing aracı iğne hava kabarcıkları en aza indirmek için yavaş yavaş yükleme pipet kaldırılırken çıkarma.</li>
		<li>Cam iğne 10 dakika içinde siliconizing Ajan bırakın, yeni bir yükleme pipet ile alıyorum tarafından kaldırmak ve iğneler gecede bir duman mahallede kuru izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deneme, sabah cam kılcal aşağıdaki yordamı adım 1.2 deiyonize suyla durulayın ve 3−4 h için kurumasını sağlar.</li>
</ol>2. çözümler hazırlanması
<ol><li>5 mL 4,2 mL Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta ve Ham'ın besin karışımı F12 (DMEM/F12) 750 µL, Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin 50 µL ilave tarafından çözüm nötralize tripsin de hazırlayın. 37 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>5 hazırlamak Hank'in 995 µL boya (içinde dimetil sülfoksit [DMSO], Malzemeler tablo) etiketleme 1 mM stokunun pipetting 5 µL tarafından boya çözüm etiketleme µM dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1 dk ve mağaza kullanımı kadar 37 ° C'de için girdap.</li>
	<li>Taze paraformaldehyde (PFA) 10 mL % 32 İngiltere'de yılın stok çözeltisi 62 mL moleküler biyoloji sınıf su ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) x 10 8 mL ile birleştirerek hazırlayın. Son konsantrasyonu % 4 olduğunu İngiltere'de yılın 1 x DPBS içinde.</li>
</ol>3. ana bilgisayar embriyo hazırlanması
<ol><li>38 ° C kadar Hamburger ve Hamilton (HH) sahne 1910oksijen bir kuluçka yatay yönde verimli tavuk yumurtası kuluçkaya. Not: manipülasyon için seçilen sahne esnek ve her bireysel deney amacı tamamen bağımlı değil.</li>
	<li>Küçük bir delik yapmak için açılı forseps kullanarak yumurta Ekvatordaki yumurta kabuğu "düz" sonu puan edinildi > 1 mm çapında. Bir 18 G iğne ponksiyon yoluyla ekli 10 mL şırınga ekleyebilir veya albümin ~ 5 mL kaldırabilir. Not: Bu anatomik konum "hava hücre" yumurta içinde dışında ve albümin ponksiyon yapıldıktan sonra sızıntı tutar. "Embriyo yumurta kabuğu, sonraki adımda potansiyel hasar önleme uzak damla olarak" Bu adım önerilir.</li>
	<li>Saydam bandı yumurta kabuğu uygulamak. Açılı forseps ile puan ve eğri tenotomy makas kullanarak bir ~2.5 cm pencere kesmek.</li>
	<li>İncelemek ve Hamburger ve Hamilton10 tarafından belirlenen ölçütlere göre embriyo sahne ve ponksiyon adım 3.2 şeffaf bant ile mühür. Not: Burada, 37−40 somites uzanan kuyruk tomurcuk haline sahip sahne HH 19 embriyo kullanılmıştır. Pencerenin yumurta (adım 3.3) üst kısmında açıldıktan sonra delik kadar kapalı olmalıdır değil.</li>
	<li>~ 200 µL ekli 1 mL şırınga ile 32 G iğne kullanarak embriyo altında (1:5) çini mürekkebi/HBSS karışımı enjekte. Not: çini mürekkebi embriyo ve sarısı altında arasındaki görsel kontrast sağlar. Alternatif tarafsız kırmızı veya piyasada bulunan Camgöbeği floresan gibi protein (CFP) boya veya mavi flüoresan protein (BFP) Floresan filtre setleri karşıtlığı artırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>HBSS 1 mL dropwise embriyonik diskin üzerine ekleyin ve parafin film ile pencereli kabukları mühür. Yumurta enjeksiyon için hazır kadar geri oksijen kuluçka makinesine koyun.</li>
</ol>4. yalıtım donör doku
<ol><li>Donör verimli tavuk yumurta 38 ° c oksijen bir kuluçka sahne HH 19 (veya istediğiniz sahne) kadar kuluçkaya.</li>
	<li>Embriyonun yumurtadan kaldırmak ve steril HBSS oda sıcaklığında (RT) içeren 100 mm x 15 mm petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Cerrahi olarak microdissect atriyal donör dokudan ilk embriyo tüm embriyonik kalp yalıtma ve sonra kalp kulakçık izole ederek forseps, tenotomy makas ve microspatula bir stereo diseksiyon mikroskop altında kullanarak her embriyo. HBSS buz üzerinde 1 mL içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp havuzda.</li>
	<li>Bir kez toplanan tüm donör doku doku tarafından Santrifüjü 1000 x g sabit açılı microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için de cips.</li>
</ol>5. tripsin sindirim donör doku
<ol><li>Hücre topakları 1 mL prewarmed % 0.05 tripsin-EDTA resuspend ve sallayarak ısı taşını 300 devirde 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu örnek periyodik ajitasyon ile kullanın.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı kalan herhangi bir doku kırmaya ve adım 4.4 olduğu gibi cips sindirim çözüm pipette.</li>
	<li>Pelet çözüm ve santrifüj olduğu gibi adım 4.4 nötralize tripsin 1 ml resuspend.</li>
	<li>Kırmızı floresan boya çözüm etiketleme 400 µL hücrelerde resuspend ve 37 ° c ısı blok içinde 20 dk için kuluçkaya. Alternatif olarak, bir su banyosu kullanın.</li>
	<li>Etiketleme reaksiyon tamamlandıktan sonra hücre adım 4.4 olduğu gibi cips ve 1 mL HBSS (sayı 1 ile 3 adımları değiştirilebilir yıkama) ile yıkayın.</li>
	<li>~ 50.000 hücreleri/hangi genel olarak 5−10 µL çalışma birimdeki bağlı olarak toplam hücre verim sonuçları µL, konsantrasyon, etiketli, pelleted hücreleri resuspend. Not: Hücre konsantrasyonları aşağıda ~ 50.000 hücre/µL zavallı enjeksiyon verimliliği neden olabilir.</li>
</ol>6. In-vivo enjeksiyon
<ol><li>Backload hücre süspansiyon içine adım 1.2 prosedürleri aşağıdaki silikon tedavi cam kılcal bir pipet. Pipet basınç microinjector aparatı monte.</li>
	<li>Ana bilgisayar embriyo oksijen kuluçka çıkarın ve bir yumurta tutucu floresan stereo diseksiyon mikroskop altında yerleştirin.<ol>
<li>Vitelline membran steril iyi forseps kullanarak açın ve küçük bir insizyon attım (~0.5−1.0 mm uzunluğunda) kalp zarını içinde olun. Ek işleme/diseksiyon bağlı olarak hedef bölge enjeksiyon için gerekli olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Öyle ki hedef doku mikroenjeksiyon iğne ucu nüfuz microinjector getirin.<ol>
<li>Basınç hücreleri enjekte ve floresan etiket implante hücreleri istenen dokuda mevcut olduğunu belirlemek için kullanın. Tipik enjeksiyonlar için 0,5'den küçük tek darbeleri uygulamak basınç 100-400 hectopascals arasında değişen süre s. Not: Pulse uzunluğu ve mutlak basınç enjekte edilir hücre sayısına bağlı olarak değişir ve bireysel ihtiyaçlarına uygun şekilde değiştirilebilir.</li>
		<li>Microinjector aparatı geri çekmek ve basınç enjekte sonra sahibinden yumurta kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL sıcak HBSS dropwise embriyo ekleyin, şeffaf ambalaj bant kullanarak yumurta mühür ve 24 h posta implantasyon için 38 ° C'de kuluçka oksijen kuluçkaya.</li>
</ol>7. izolasyon ve analiz
<ol><li>RT HBSS forseps, tenotomy makas ve microspatula 4.3 adıma benzer kullanarak ana bilgisayar embriyolar izole ve %4 PFA gecede 4 ° c hafif sallanan ile düzeltin.</li>
	<li>Embriyo 3 x 5 dk HBSS RT, hafif sallanan ile yıkayın ve daha fazla aşağı akım analiz (mikroskopi, immünhistokimya, in-situ hibridizasyon, vb) 4 ° C'de HBSS içinde saklayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, Y. X., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Mosaics+for+Greater+Precision+in+Cardiovascular+Research.">Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research.</a> Circulation Research. 123, 27-29 (2018).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cardiac+Myocyte+Maturation+Using+CASAAV,+a+Platform+for+Rapid+Dissection+of+Cardiac+Myocyte+Gene+Function+In+Vivo.">Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo.</a> Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , (1962).</li><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential developmental biology. 3rd edition. , (2013).</li><li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+integration,+and+differentation+of+cardiomyocyte+grafts:+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts.">Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. 100, 193-202 (1999).</li><li>Rojas, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+purified+iPSC-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction.">Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction.</a> PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+Grafting+for+Cardiac+Repair:+Graft+Cell+Death+and+Anti-Death+Strategies.">Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).</li><li>Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mesodermal+cues+assign+avian+cardiac+pacemaker+fate+potential+in+a+tertiary+heart+field.">Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field.</a> Science. 340 (6133), 744-748 (2013).</li><li>Bressan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+myocardial-endocardial+interactions+pattern+the+delay+in+atrioventricular+junction+conduction.">Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction.</a> Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Nasıl microenvironmental koşulları etkisi kardiyak hücre kader belirtimi ve soyu sabitleme tanımlama yeteneği konjenital kalp hastalığının verimli iletişim kuralları için uygun geliştirmek için de basınç bir anlayış yaratmak için esastır kök hücre veya somatik hücre REPROGRAMING tabanlı cardiomyocytes olgunlaşma. Protokol içinde vivo koşullarda hücre özerk olgunlaşma süreçleri parakrin/juxtacrine ve/veya hemodinamik ipuçları ayrı kalmak için izin, doğrudan kalp hücre gelişimi altında tahlil yeteneği değişmiş müfettişler verir özetlenen. Yüksek kararlılık düşsel, genetik analiz ve fizyolojik deneyleri ile birleştirildiğinde, bu teknik varolan transgenik modelleri güçlü bir tamamlayıcı olarak hizmet verebilir.
Teknik stand noktası formu, verimli yalıtım, etiketleme ve donör kalp hücreleri hassas implantasyonu ana bilgisayar embriyonik dokuların içine burada sunulan protokolü kullanır. Mikroenjeksiyon sistemi büyük ölçüde donör hücreleri hedefleme yardımcı olur ve bir büyük engraftment site ana bilgisayar doku oluşturmak için gerek kalmadan başarılı implantasyonu için sağlar. Bazı operasyonel beceri bu teknik ancak, gerçekleştirmek için gereken enjeksiyon iğne dikkatle (kalp ya da yerel damarlara yırtılması neden) hedef dokuda koymamış durumunda azaltılmış canlılık neden olabilir. Bakım ve düşünce de yalıtım ve etiketleme adımları verilmelidir. Donör sindirim üzerinde doku zavallı implantasyon verimlilik için yol açabilir ve teknikleri etiketleme geçici (hücre bölünmesi etiket seyreltik olabilir gibi) üzerinde donör hücreleri izlenebilir zaman penceresi sınırlayabilirsiniz.
Bu teknik son derece değiştirilebilir ve çok çeşitli amaçlar için adapte edilebilir. Örneğin, çok sayıda doku ve etap hücrelerden (enzimatik sindirim duruma getirilmesi gerekli olmasına rağmen) izole edilmesi ve benzer şekilde yapabilirsiniz donör farklı gelişim aşamalarında ana bilgisayar dokular çeşitli içine enjekte edilir. Benzer şekilde, etiketleme yaklaşımı hücreleri floresan inorganik yarı iletken nanocrystals artık bu geçici etiketleme için kullanımı ve bıldırcın hücreleri ya da yeşil hücre implantasyonu dahil olmak üzere farklı zamansal pencereler arasında izlemek için değiştirilebilir permeant etiketleme floresan proteini transgenic (GFP +) donör embriyolar için11 .
Biz şu anda bu teknik kuş implantasyon çalışmaları için kullanırken, bu gelecekte chimeric çalışmalar geniş bir yelpazesi için kullanılan olabilir hissediyorum. Örneğin, transgenik organizmalar genetiği değiştirilmiş kalp hücreleri izole olabilir ve çok benzer bir iletişim kuralı kullanılarak kuş kalbine microinjected. Ayrıca, cardiomyocytes içine farklılaşmış hücreler hücreleri kaynaklanıyor veya somatik hücre ile yaklaşımlar REPROGRAMING doku ve/veya olgunlaşma biyomekanik içinde vivo altında kendi entegrasyon değerlendirmek için embriyonik kalp içine microinjected koşullar.

Kardiyak gelişimsel araştırma son derece birçok gen düzenleyici ağların bu deseni farklı hücre soy ve kalbinde işlevsel etki alanları belirledik germline transgenik model sistemleri gelişiyle gelen benefitted. Nasıl bu gen ağlar ile etkileşim ve microenvironmental koşullara cevap ancak, tanımlayan parakrin/juxtacrine sinyalleri ve biyofiziksel girişleri (streç, zorlanma, hemodinamik akışı) de dahil olmak üzere, zor olabilir. Bu nedenle, her zaman bir hücresel fenotip kardiyak biyomekanik veya daha yüksek sipariş doku kompozisyon1,2 değişiklikleri için genetik pertürbasyon doğrudan bir sonucu olarak veya bir adaptasyon ikincil bir sonucu olarak doğar olup olmadığını belirlemek kolay değil .
Klasik adres kavramları kader belirtimi için kullanılmıştır, deneyler aşılama bağlılık, indüksiyon ve yetkinlik3,4, bazı doğasında sorunları aşmak için ideal bir yaklaşım temsil eder hücre çevresel etkisi karşı özerk kalbinden tanımlama. Ne yazık ki, kalp kasılma standart aşılama yaklaşımlar zorlaştırabilir. Hızlı hareket doku kez kalbe bağlı kalarak aşılı hücreleri önler ve büyük doku deliyor (normalde aşılama için gerekli) sık sık kalp yetmezliği ve embriyonik ölümcül5,6,7yol açar. Bu nedenle, biz basınç tabanlı geliştirdik, mikroenjeksiyon sistemi hassas hücresel implantasyon doku aşılama teknik engellerin engellemeyi gelişmekte olan piliç kalbine için daha önce açıklanan8,9. Bu tekniği kullanarak, bireysel veya küçük gruplar bir donör embriyo izole kalp hücrelerinin geniş ana bilgisayar hazırlık ve kullanarak ortaya çıkan büyük doku hakaret ihtiyacını ortadan kaldırarak bir ana bilgisayar embriyonik kalp bölgelerinde çeşitli içine microinjected Standart aşılama teknikleri. Bir dış çapı bu implantasyon çalışmaları için kullanılan mikroenjeksiyon iğneler var ~ iğne doğrudan hedef dokuda yerleştirilmesi 30−40 µm (yani, embriyonik miyokard duvar nüfuz) ve hücre focally ile teslim çevreleyen doku çok az hasar. Protokol izotopik, heterotopik, isochoric ve heterochronic manipülasyonlar, doğrudan gelişmekte olan klasik deneysel Embriyoda paradigmalar incelemek için hızlı, esnek ve düşük maliyetli bir yaklaşım sağlayan çeşitli gerçekleştirmek için kullanılabilir dört odacıklı kalp.
Aşağıda özetlenen iletişim kuralında, biz gerçek zamanlı olarak izlenecek mikroenjeksiyon deney başarısı için sağlayan bir hücre permeant floresan boya, hücrelerle donör etiket ve herhangi için gerek kalmadan belgelenmeliydi engrafted hücrelerin konumunu ek boyama. Ancak, bu yaklaşım floresan boya hücre bölünmesi kaybolabilir kısa süreli deneyler (yaklaşık 48 saat) için en uygun olduğunu belirtmek gerekir. Alternatif yaklaşımlar daha uzun süreli deneyler için kullanılabilir.
Kalp geliştirme bağlamında bu teknik bulunuyorlar iken, biz bu büyük etkisi hücre implantasyonu deneyler için mesoderm, baş, bacaklarda ve somites kullandık. Bu nedenle aşağıda açıklanan temel yaklaşım son derece uysal ve çeşitli organ sistemleri kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1133px;" width="1133">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1 mL Insulin Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">329654</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:441px;">1.7 mL Microtubes, Clear</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">15 mL Centriguge Tubes, Racked</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">1588 Genesis Hova-Bator Incubator</td>
			<td style="width:257px;">GQF</td>
			<td>813927021221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18G x 1 1/2 Needle</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:268px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td style="width:257px;">TSK Steriject Air-Tite</td>
			<td style="width:268px;">TSK3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Alchohol Wipes 70%</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>19015744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled Forceps</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">11260-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Backloading Tips</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Black India Ink</td>
			<td>KOH-I-NOOR</td>
			<td style="width:268px;">3084-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Green CMF</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7025</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker Red CMTPX</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td>1 mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Commercial Grade Packing Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td>2619001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Curved Tenotomy Scissors</td>
			<td style="width:257px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:268px;">14067-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">DMSO, anhydrous</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Femtojet 4i</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:268px;">5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Hatching Eggs</td>
			<td style="width:257px;">Pilgrim&#39;s Hatchery</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Injectman 4</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5192000027D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:257px;">Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Parafilm</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td style="width:257px;">VWR</td>
			<td>100496-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">15140-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:257px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:268px;">32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:441px;">Pipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:257px;">HEKA</td>
			<td style="width:268px;">PIP 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Scotch Transparent Tape</td>
			<td style="width:257px;">Staples</td>
			<td style="width:268px;">487909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:257px;">SIGMA</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:257px;">Leica</td>
			<td style="width:268px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">ThermoMixer C</td>
			<td style="width:257px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:257px;">World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:441px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:257px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection-based system for in vivo implantation of embryonic cardiomyocytes in the avian embryo

Hücre hücre lineage belirlenmesi üzerinde dışsal microenvironmental etkisi karşı özerk desenlendirme göreli etkisini yorumlama gelişim Biyolojisi Araştırma Genel mücadelesine temsil eder. Embriyonik kalbinde bu transkripsiyon regülatör, parakrin/juxtacrine sinyal cues, ifadesinde bölgesel farklılıklar özellikle zor olabilir ve hemodinamik kuvvet tüm bilinen cardiomyocyte olgunlaşma etkilemek için. Bir gelişmekte olan cardiomyocyte'nın moleküler ve biyomekanik microenvironment değiştirmek için basitleştirilmiş bir yöntem bu nedenle, nasıl yerel koşullar etkisi hücre kader ve işlevi incelemek için güçlü bir teknik olarak hizmet verecek. Bu sorunu çözmek için fiziksel olarak kalp veya çevreleyen embriyonik doku ektopik konumlara Juvenil cardiomyocytes nakli için bir yöntem optimize. Bu nasıl microenvironmental koşulları etkisi cardiomyocyte kader geçişler olduğu gibi embriyo içinde tek hücre çözünürlükte incelemek için bize sağlar. Burada, biz hangi embriyonik miyositler olabilir kalp alt etki alanları çeşitli izole, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyo yüksek hassasiyetle içine microinjected bir protokol tanımlamak. Hücreleri sonra doğrudan yerinde çeşitli görüntüleme ve histolojik teknikler kullanarak analiz edilebilir. Bu iletişim kuralı kalp gibi hareketli bir doku aşırı derecede zor olabilir geleneksel aşılama deneyler için güçlü bir alternatiftir. Bu yöntemin genel da donör doku ve ana bilgisayar ortamları çeşitli ve onun rahatlık-in kullanma, düşük maliyetli, adapte olabilir ve hızlı gelişim çalışmaları çeşitli için potansiyel olarak yararlı bir uygulama yapmak.

24 saat kuluçka, kalp ve surround doku konağın sonra embriyolar izole edildi, (Şekil 1A) fotoğraflandı ve immünfloresan analiz için işlenmiş. Bu örnekte, donör atriyal miyositler benzer bir aşamalı ana proepicardium microinjected embriyo. Ana bilgisayar embriyo sonra kas marker (MF20 yeşil) ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; mavi) lekeli ve. Enjekte (kırmızı) açıkça görülebilir (Şekil 1B) hücrelerdir. Hücreleri görünür olmayan dikkate almak olası ayarlamalar içerir: donör doku üzerinde sindirmek (hücreleri eklemek mümkün olurdu), boya çözüm etiketleme çok seyreltik, hücreleri aşırı soluk veya birden çok hücre bölünmeler etiket kaybına neden.
Bu örnekte eklenen hücreleri miyokardiyal onaylamak için optik confocal mikroskop (Şekil 1C-E) kullanarak bu embriyo kesitli. Tek MF20 pozitif hücrelerinin proepicardium (PE) içinde focally implante edildi floresan kırmızı pozitif hücreler vardır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59267/59267fig1.jpg"> Resim 1 : Temsilcisi görüntüleri embriyolar izole 24 saat mesaj enjeksiyon. (A)düşük büyütme aydınlık alan görüntü bir E3.5 (HH sahne 19) civciv embriyo gövde bölgesinin. (B) enjekte birleştirilmiş görüntü gösteren hücreleri (kırmızı), cardiomyocytes (yeşil) ve DAPI. Hücreleri kulakçık izole edildi ve proepicardium microinjected. (C) yüksek büyütme confocal görüntüleme gösterilen özünü proepicardium hücreler etiketli. (D) yüksek büyütme confocal görüntüleme CT kırmızı etiketli hücreleri teyit cardiomyocytes vardır. (E) panelleri D ve Eeklenen hücreleri üç boyutlu (3D) yeniden inşası. Atria, Gerçekten, çıkış yolu; PE, proepicardium; VT, ventrikül; MF20, Myosin 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59267/59267fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo at JoVE.com

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Bu protokol, yerel biyomekanik, doku mimarisi, parakrin ortamlar ve yan yana etkileşimlerde yapılan değişikliklerin hücresel fenotipi nasıl etkilediğini belirlememize yardımcı olur. Bu teknik, geleneksel grafik deneylerinde ortaya çıkan büyük ölçekli doku hakaretlerine neden olmadan klasik paradigmaları ve deneysel embriyolojiyi keşfetmemizi sağlar. Enjeksiyon için doğru basıncı bulmak için, daha düşük bir enjeksiyon basıncından başlamak ve hücrelerin sabit bir akış elde edilene kadar kademeli olarak artırmak yararlıdır.Bu tekniğin görselleştirilmesi, enjeksiyon ekipmanının hedef dokuya göre nasıl konumlandırılması gerektiğinin doğrudan anlaşılmasına yardımcı olur. Prosedürü gösteren benim laboratuvar, Trevor Henley ve Kandace Thomas iki üyesi olacak. İmplantasyondan 24 saat önce, standart protokollere göre bir mikropipet çekmecesi üzerinde cam kılcal damarları çekin ve iğnelerin dış yüzeylerini kaplamak için kılcal damarları silikonlaştırıcı maddeye batırın.Daha sonra, bir mikroenjeksiyon pipet ucu içine silikonlaştırıcı ajan 5 ila 10 mikrolitre yükleyin ve bir dış kaplı cam kapiller geniş ucunda ucu yerleştirin. Pipet ucunu cam iğne ucuna mümkün olduğunca yakın yerleştirin ve iğne içindeki hava kabarcıklarını en aza indirmek için yükleme pipetini yavaşça geri çekerken silikonlaştırıcı maddeyi çıkarın. Çözeltiyi aspire etmek için yeni bir yükleme pipeti kullanmadan önce silikonlaştırıcı maddeyi cam iğnede 10 dakika bekletin.Sonra bir gecede bir duman başlık içinde iğnekurun. Ev sahibi embriyo hazırlama için, 38 santigrat derece nemli bir kuluçka yatay bir yönde verimli tavuk yumurtaları kuluçka ve yumurta ekvator boyunca her yumurtanın düz ucunun alt bir milimetre çapında delik daha büyük bir milimetre çapında delinme yapmak için açılı forseps kullanın. Yaklaşık beş mililitre albumen çıkarmak için delinmeye 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 18 kalibrelik bir iğne yerleştirin.Ve yumurta kabuğunun üstüne şeffaf bant uygulayın. Açılı çiflizli yumurtanın üst kısmındaki bantlı bölgeyi puanlayın ve yumurtanın bantlı bölümünde yaklaşık 2,5 santimetrelik bir pencereyi kesmek için kavisli tenotomi makası kullanın. İnceleme ve Hamburger ve Hamilton tarafından belirlenen kriterlere göre embriyo sahne ve embriyo altında HBSS Hindistan mürekkep bir ila beş seyreltme yaklaşık 200 mikrolitre enjekte etmek için 32 gauge iğne ile donatılmış bir milimetre şırınga kullanın.Daha sonra delinme şeffaf bant la kapatın ve yumurtanın nemlendirilmiş kuvöze geri yerleştirilmesi için pencereli kabuğu parafin filmle mühürlemeden önce embriyonik diske bir mililitre HBSS damla ekleyin. Embriyolar Hamburger ve Hamilton evre 19 ulaştığında, deiyonize su ile silikon kaplı cam kılcal durulayın ve kılcal oda sıcaklığında üç ila dört saat kurumasını bekleyin. Bu süre zarfında, bir yumurtadan bir embriyoyu steril oda sıcaklığıNDA HBSS içeren 100 ila 15 milimetrelik Petri kabına aktarın ve kabı stereo mikroskop altına yerleştirin.Forseps, tenotomi makası ve mikro spatula kullanarak tüm embriyonik kalbi embriyodan izole edin ve atria'yı kalpten izole edin. Atriyal dokuyu steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne buz üzerinde bir mililitre HBSS içeren yerleştirin. Tüm donör doku toplandı zaman, sabit açılı mikrosantrifüj santrifüj ile dokular pelet.Donör doku sindirimi için, dakikada 300 rotasyonda sallayarak ısı bloğunda 15 dakikalık bir kuluçka için önceden ısıtılmış %05 tripsin EDTA'nın mililitresinde peletleri yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, pipet sindirim çözeltisi kalan doku kırmak ve santrifüj ile kardiyak lysate pelet birkaç kez. Başka bir santrifüj için bir mililitre trypsin nötralize çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve ardından 400 mikrolitre kırmızı floresan boya çözeltisinde yeniden süspansiyon.37 santigrat derecede 20 dakika sonra, yıkama başına HBSS bir mililitre bir ila üç yıkar için santrifüj ile hücreleri pelet. Daha sonra etiketli hücreleri taze HBSS'deki mikrolitre konsantrasyonu başına dördüncü hücrelere beş kat on oranında yeniden askıya alın. Donör hücrelerin in vivo enjeksiyonu için, hücre süspansiyonu gösterildiği gibi kuru, silikon lailgili cam kılcal pipete geri yükleyin ve pipeti basınçlı mikroenjektör aparatına monte edin.Her konak embriyoyu, nemlendirilmiş kuvözden floresan stereo diseksiyon mikroskobu altında bir yumurta tutucuya enjekte edilecek şekilde aktarın. Ve vitellin membranaçmak için steril ince forceps kullanın. Perikard'da 5-1 milimetrelik bir kesi yapın ve mikroenjeksiyon iğnesinin ucunun hedef dokuya nüfuz etmesi için mikroenjektörü yerleştirin.Mikroenjektörü, 100 ila 400 hektopascal arasında değişen tek darbeleri 5 saniye boyunca basınçta uygulayacak şekilde ayarlayın. Ve hücrelere basınç enjekte edin. Yumurtayı yeniden mühürlemeden önce floresan sinyali görüntüleyerek başarılı bir hücre implantasyonunun doğrulanması çok önemlidir.Embriyo da bu prosedürü belgelemek için fotoğraflandı olabilir. Tüm hücreler enjekte edildiğinde, mikroenjektör aparatını geri çekve yumurtayı tutucudan çıkarın. Sonra embriyo üzerine sıcak HBSS damla akıllıca bir mililitre ekleyin.Yumurtayı şeffaf ambalaj bandıyla kapatın ve yumurtayı implantasyon sonrası 24 saat boyunca nemli kuvöze geri gönderin. Burada donör atriyal miyosit implantasyonu sonrası konak embriyonik kalbin kalbi ve çevresindeki dokular gösterilmiştir. Bu temsili deneyde, donör hücreler benzer bir aşamada bir konak embriyo proepicardium içine mikro enjekte edildi.Konfokal mikroskop kullanılarak yapılan optik kesitler, proepikardiyum daki tek kardiyak kas belirteç pozitif hücrelerinin fokal implante edilmiş floresan kırmızı pozitif hücreler olduğunu ortaya koymuştur. Kalpte yırtıklar ve enjeksiyon iğnesinin neden olduğu lokal damar yırtılması canlılığın azalmasına neden olabileceğinden alıcı embriyoyu aşırı manipüle etmemeye özen. Bu prosedürü takiben, immünohistokimya, yerinde hibridizasyon ve hücre sıralama dahil olmak üzere, downstream tahliller çeşitli yapılabilir.Silikonlaştırıcı madde son derece yanıcı ve akut toksiktir. Her zaman bir duman başlık içinde bakım ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...